Name: Wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę Clocks lifeline alignment do analizy szeregów czasowych w cyklu komórkowym drożdży. Umożliwia ona fazowe porównania transkryptomicznych i proteomicznych danych między eksperymentami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S. Campione i S. Haase byli wspierani przez fundusze National Science Foundation (DMS-1839288) i National Institutes of Health (5R01GM126555). Dodatkowo autorzy chcieliby podziękować Huarui Zhou (Duke University) za komentarze do manuskryptu i za beta testy protokołu. Dziękujemy również Francisowi Motcie (Florida Atlantic University) i Joshui Robinsonowi za ich pomoc w tworzeniu kodu Java.

Alignment of Synchronized Time-Series Data for Cross-Experiment Comparisons

<ol><li>Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+G1+cyclins%3A+Cln3+may+be+an+upstream+activator+of+Cln1%2C+Cln2+and+other+cyclins%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).</li>
<li>Schwob, E., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLB5+and+CLB6%2C+a+new+pair+of+B+cyclins+involved+in+DNA+replication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).</li>
<li>Polymenis, M., Schmidt, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cell+division+to+cell+growth+by+translational+control+of+the+G1+cyclin+CLN3+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast.</a> Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).</li>
<li>Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+cell+cycle-regulated+genes+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+microarray+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).</li>
<li>Cho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transcriptional+analysis+of+the+mitotic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle.</a> Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).</li>
<li>Bar-Joseph, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+time+series+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Analyzing time series gene expression data.</a> Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).</li>
<li>Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Forkhead+transcription+factor+Hcm1+regulates+chromosome+segregation+genes+and+fills+the+S-phase+gap+in+the+transcriptional+circuitry+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle.</a> Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).</li>
<li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+control+of+cell-cycle+transcription+by+coupled+CDK+and+network+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators.</a> Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).</li>
<li>Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WHI1%2B+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae+tethers+cell+division+to+cell+size+and+is+a+cyclin+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog.</a> EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).</li>
<li>Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+G1+and+G2+by+S-phase+cyclins+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).</li>
<li>Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+model+for+multi-marker+analysis+of+cell+cycle+progression+in+synchrony+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments.</a> Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+inhibitor+Whi5+records+environmental+information+to+coordinate+growth+and+division+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast.</a> Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).</li>
<li>Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+molecular+noise+and+size+control+on+variability+in+the+budding+yeast+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle.</a> Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).</li>
<li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+probabilistic+model+for+cell+cycle+distributions+in+synchrony+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments.</a> Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).</li>
<li>Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+branching+process+model+for+flow+cytometry+and+budding+index+measurements+in+cell+synchrony+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Statistics%22%5BJournal%5D)">A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments.</a> Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).</li>
<li>Duan, F., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+the+loss+of+cell-cycle+synchrony+in+clustering+analysis+of+microarray+data+using+weights%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights.</a> Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+transcription+dynamics+during+the+budding+yeast+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+and+arrest+of+the+budding+yeast+cell+cycle+using+chemical+and+genetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Haase, S. B., Reed, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+flow+cytometric+analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle.</a> Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).</li>
<li>Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+conservation+of+the+cell-cycle-regulated+transcriptional+program+in+the+fungal+pathogen%2C+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Genetics. 12 (12), e1006453(2016).</li>
<li>Kelliher, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layers+of+regulation+of+cell-cycle+gene+expression+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).</li>
<li>Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JTK_CYCLE%3A+An+efficient+nonparametric+algorithm+for+detecting+rhythmic+components+in+genome-scale+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets.</a> Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).</li>
<li>Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+large-scale+biological+rhythm+studies%3A+A+comparison+of+algorithms+for+detecting+periodic+signals+in+biological+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data.</a> Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+oscillator+drives+the+blood+stage+cycle+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Science. 368 (6492), 754-759 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W artykule przedstawiono metodę dokładniejszej i ilościowej oceny danych z eksperymentów szeregów czasowych na zsynchronizowanych populacjach komórek. Metoda wykorzystuje wyuczone parametry z CLOCCS, bayesowskiego modelu wnioskowania, który wykorzystuje wejściowe dane fazowe cyklu komórkowego, takie jak dane o pączkowaniu i dane o zawartości DNA cytometrycznej przepływowej, do parametryzacji każdego eksperymentu14,15. CLOCCS wykorzystuje wejściowe dane fazowe cyk...

Pomiary szeregów czasowych wykonywane na zsynchronizowanych populacjach komórek w trakcie ich postępu w cyklu komórkowym to standardowa metoda badania mechanizmów kontrolujących postęp cyklu komórkowego1,2,3,4,5,6,7, 8. Możliwość dokonywania porównań między eksperymentami szeregów czasowych synchronizacji/wydania ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia tych dynamicznych procesów. Wykorzystanie powtórzonych eksperymentów w celu potwierdzenia wyników może zwiększyć pewność co do odtwarzalności wniosków. Co więcej, porównania między warunkami środowiskowymi, mutantami, a nawet między gatunkami mogą dostarczyć wielu nowych informacji na temat regulacji cyklu komórkowego. Jednak międzyeksperymentalna zmienność w odzyskiwaniu po synchroniczności i w szybkości progresji cyklu komórkowego upośledza zdolność do dokonywania porównań między punktami czasowymi między powtórzeniami lub między eksperymentami ze zmienionym czasem cyklu komórkowego. Ze względu na te wyzwania replikaty często nie są uwzględniane dla pełnych szeregów czasowych (np. Spellman et al.4). Gdy zbierane są repliki dla całego szeregu czasowego, dane nie mogą być analizowane w formie zagregowanej, ale raczej do analizy używana jest pojedyncza replika, a inne powtórzenia są często przenoszone do dodatkowych liczb (np. Orlando i in.8). Co więcej, porównania między eksperymentami o różnej charakterystyce regeneracji lub progresji cyklu komórkowego są trudne. Pomiary mniejszych odstępów czasu między zdarzeniem będącym przedmiotem zainteresowania a punktem orientacyjnym cyklu komórkowego (np. pojawienie się pąków, wejście w fazę S lub początek anafazy) mogą pomóc w zmniejszeniu błędów, jeśli te przełomowe zdarzenia są śledzone1,2,3,9,10,11,12. Jednak subtelne, ale ważne różnice mogą pozostać niewykryte lub przesłonięte przy użyciu tych metod ad hoc. Wreszcie, analizy pojedynczych komórek pozwalają analizować progresję cyklu komórkowego bez polegania na synchronizacji lub dopasowaniu13, chociaż pomiary na dużą skalę w badaniach pojedynczych komórek mogą być trudne i kosztowne.
Aby przezwyciężyć te trudności, opracowaliśmy model Charakteryzujący Utratę Synchronizacji Cyklu Komórkowego (CLOCCS), aby pomóc w analizie pomiarów szeregów czasowych wykonanych na zsynchronizowanych populacjach14,15. CLOCCS to elastyczny model matematyczny, który opisuje rozkład zsynchronizowanych komórek w różnych fazach cyklu komórkowego, gdy są one uwalniane z synchronizacji i przechodzą przez cykl komórkowy. Struktura procesu rozgałęziania umożliwia modelowi uwzględnienie asymetrycznych cech komórek macierzystych i potomnych po podziale, jak zaobserwowano u S. cerevisiae, a jednocześnie jest przydatny dla organizmów, które dzielą się przez rozszczepienie, takich jak S. pombe. Model może pobierać dane wejściowe z różnych typów pomiarów w celu określenia fazy cyklu komórkowego. Może pobierać dane dotyczące fazy cyklu pączkowania komórek, które obejmują pomiary procentu pączków komórek w czasie, co pozwala na oszacowanie liczby komórek poza niezabudzoną fazą G114,15. Model może również pozyskiwać dane cytometryczne przepływu, które mierzą zawartość DNA, umożliwiając w ten sposób ocenę przejść punktów orientacyjnych z G1 do S, S do G2 i z M do G115. Fluorescencyjne markery morfologiczne mogą być również wykorzystywane do identyfikacji fazy cyklu komórkowego. Fluorescencyjne znakowanie pierścieni, jąder i ciał wrzecionowatych (SPB) miozyny może być wykorzystane do określenia fazy cyklu komórkowego, a te zostały włączone do modelu CLOCCS11; Pomiary te nie zostaną jednak opisane w niniejszym protokole. Dodatkowo indeks septacji został wykorzystany jako dane wejściowe do modelowania danych z S. pombe14. Dzięki temu model może być wykorzystywany do analiz cyklu komórkowego w różnych organizmach i może być dalej rozbudowywany.
CLOCCS to model parametryczny, który pozwala na pełne bayesowskie wnioskowanie wielu parametrów z danych wejściowych (np. procent pączkowania, zawartość DNA). Parametry te obejmują czas regeneracji po synchronizacji, długość okresu cyklu komórkowego (oszacowaną oddzielnie dla komórek macierzystych i potomnych) oraz średnią pozycję komórek w cyklu komórkowym w każdym punkcie czasowym. Parametry te reprezentują zachowanie przeciętnej komórki w populacji, umożliwiając badaczowi mapowanie każdego punktu czasowego do pozycji cyklu komórkowego wyrażonej jako punkt linii życia. Konwersja na punkty linii życia zależy od parametrów CLOCCS lambda (λ) i mu0 (μ0)14,15. Parametr λ odpowiada średniemu okresowi cyklu komórkowego komórek macierzystych. Jednak ze względu na opóźnienie matka-córka14,15, nie jest to średni okres cyklu komórkowego całej populacji, która obejmuje zarówno komórki matki, jak i komórki potomne. CLOCCS dodatkowo wnioskuje o parametrze delta (δ), który odpowiada opóźnieniu matka-córka, a tym samym pozwala na obliczenie średniego okresu cyklu komórkowego całej populacji. Wreszcie, ponieważ każdy eksperyment rozpoczyna się po zwolnieniu z synchronizacji cyklu komórkowego, czas wymagany do odzyskania sprawności po metodzie synchronizacji jest reprezentowany przez parametr CLOCCS μ0. CLOCCS dopasowuje model do wejściowych danych fazowych cyklu komórkowego, a następnie wnioskuje o tych parametrach za pomocą algorytmu Monte Carlo losowego łańcucha Markowa14,15. Mapując wiele eksperymentów do wspólnej skali czasowej cyklu życia cyklu komórkowego, można dokonać bezpośrednich porównań specyficznych dla fazy między powtórzeniami lub eksperymentami, w których czas odzyskiwania lub okresy cyklu komórkowego nie są identyczne8,14,15.
Ponieważ zsynchronizowane populacje tracą synchronizację w pewnym tempie w trakcie szeregu czasowego14,15,16,17, zmienność szybkości utraty synchronizacji może również utrudniać porównania ilościowe między eksperymentami. Identyfikując lokalizację populacji i wariancję w ich rozmieszczeniu, CLOCCS uwzględnia różnice w tempie utraty synchronizacji. To potężne narzędzie pozwala na konkretne i szczegółowe porównania między eksperymentami, zapewniając w ten sposób możliwość bezpośredniego dokonywania odpowiednich porównań nie tylko między powtórzeniami, ale także między warunkami środowiskowymi, mutantami, a nawet gatunkami, które mają dramatycznie różny czas cyklu komórkowego14,15.
Ten artykuł opisuje metodę wykorzystującą CLOCCS do szacowania parametrów poprzez dopasowywanie danych z eksperymentów synchronicznych/uwalniających, mapowanie danych do wspólnej skali linii życia, a następnie dokonywanie odpowiednich porównań między powtórzeniami lub eksperymentami. Wyrównanie linii życia pozwala na bezpośrednie porównania specyficzne dla fazy w tych eksperymentach, co pozwala na agregację i porównanie kontrprób oraz na dokonywanie bardziej odpowiednich porównań między eksperymentami o różnych czasach regeneracji i okresach cyklu komórkowego.

<table><tbody><tr><td>2x PBS do roztworu</td><td></td><td></td><td>utrwalającego. Opisany w Leman 2014.</td></tr><tr><td>4% formaldehydu</td><td></td><td></td><td>do roztworu utrwalającego.</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td></td><td></td><td>do utrwalania cytometrii przepływowej. Opisane w Haase 2002.</td></tr><tr><td>Cytometr</td><td></td><td></td> przepływowy CLOCCS <td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git</td></tr> Do protokołu cytometrii przepływowej.<tr><td>Git</td><td></td><td></td><td>https://git-scm.com/</td></tr> <tr><td>Java 19</td><td></td><td></td><td>https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td>Do liczenia komórek i pąków.</td></tr><tr><td>Miniconda</td><td></td><td></td><td>https://docs.conda.io/en/latest/</td></tr> <tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td>proteazy Do protokołu cytometrii przepływowej. Opisane w Haase 2002.</td></tr><tr><td>RNAza Roztwór</td><td></td><td></td><td>Do protokołu cytometrii przepływowej. Opisane w Haase 2002.</td></tr><tr><td>SYTOX Zielony barwnik kwasem nukleinowym</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Do barwienia cytometrią przepływową. Opisane w Haase 2002.</td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td>pH 7,5</td></tr></tbody></table>

wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami

Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons

Badanie cyklu komórkowego często polega na synchronizowaniu populacji komórek w celu pomiaru różnych parametrów w szeregu czasowym, gdy komórki przechodzą przez cykl komórkowy. Jednak nawet w podobnych warunkach powtórzone eksperymenty wykazują różnice w czasie wymaganym do wyjścia z synchronizacji i przejścia przez cykl komórkowy, uniemożliwiając w ten sposób bezpośrednie porównania w każdym punkcie czasowym. Problem porównywania pomiarów dynamicznych między eksperymentami nasila się w populacjach zmutowanych lub w alternatywnych warunkach wzrostu, które wpływają na czas odzyskiwania synchronicznego i/lub okres cyklu komórkowego. 
Wcześniej opublikowaliśmy parametryczny model matematyczny o nazwie Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS), który monitoruje, jak synchroniczne populacje komórek uwalniają się z synchronizacji i przechodzą przez cykl komórkowy. Parametry wyuczone z modelu można następnie wykorzystać do konwersji eksperymentalnych punktów czasowych z zsynchronizowanych eksperymentów szeregów czasowych na znormalizowaną skalę czasu (punkty linii życia). Zamiast reprezentować czas, który upłynął w minutach od rozpoczęcia eksperymentu, skala linii życia reprezentuje postęp od synchronizacji do wejścia w cykl komórkowy, a następnie przez fazy cyklu komórkowego. Ponieważ punkty linii życia odpowiadają fazie przeciętnej komórki w zsynchronizowanej populacji, ta znormalizowana skala czasowa pozwala na bezpośrednie porównania między eksperymentami, w tym tymi z różnymi okresami i czasami rekonwalescencji. Co więcej, model został wykorzystany do dostosowania eksperymentów cyklu komórkowego między różnymi gatunkami (np. Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe), umożliwiając w ten sposób bezpośrednie porównanie pomiarów cyklu komórkowego, które mogą ujawnić ewolucyjne podobieństwa i różnice.

Kroki opisane w powyższym protokole oraz w schemacie przedstawionym na Rysunku 1 zostały zastosowane w pięciu eksperymentach z szeregami czasowymi zsynchronizowanych komórek w celu przeprowadzenia dwóch reprezentatywnych porównań: pomiędzy powtórzeniami z zastosowaniem różnych metod synchronizacji (feromonu kojarzenia i elutriacji odśrodkowej18) oraz platform sekwencjonowania (sekwencjonowanie RNA [RNA-seq] i mikromacierze), a także pomiędzy różnymi warunkami eksperym...

Jednym z wyzwań związanych z analizą eksperymentów z synchronizowanymi szeregami czasowymi jest to, że eksperymenty często różnią się długością powrotu do zdrowia po synchronizacji i okresem cyklu komórkowego. W związku z tym pomiary z różnych eksperymentów nie mogą być analizowane zbiorczo ani łatwo porównywane. W tym miejscu opisujemy metodę dopasowywania eksperymentów, aby umożliwić porównania specyficzne dla fazy.

Wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami

Investigating the cell cycle often depends on synchronizing cell populations to measure various parameters in a time series as the cells traverse the cell ...

Głównym wyzwaniem związanym z analizą eksperymentów z szeregami czasowymi jest to, że często różnią się one długością powrotu do zdrowia po synchroniczności i okresem cyklu komórkowego, więc pomiary z różnych eksperymentów nie mogą być łatwo porównywane lub analizowane w zagregowanej formie bez wyrównania. Wyrównanie linii życia zegarów to metoda specyficznych dla fazy i biologicznie istotnych porównań między eksperymentami oraz agregacji wielu powtórzonych eksperymentów, które wcześniej były trudne lub niemożliwe. Wcześniej porównania specyficzne dla fazy i biologicznie istotne dokonywano poprzez śledzenie przełomowych wydarzeń.Jednak przy użyciu tych metod ad hoc subtelne, ale ważne różnice pozostają niewykryte. Porównanie eksperymentów z szeregami czasowymi jest szczególnie trudne w przypadku eksperymentów ze znaczącymi różnicami w czasie, takimi jak populacje mutantów lub warunki wzrostu, które wpływają na czas odzyskiwania synchronicznego lub okres cyklu komórkowego. Wyrównanie linii życia zegarów pozwala na porównanie specyficzne dla fazy w tych przypadkach, Użyliśmy zegarów do wyrównania danych transkryptomicznych i proteomicznych szeregów czasowych, co pozwoliło na bezpośrednie porównanie dynamiki mRNA i odpowiadającego mu białka.Co więcej, dostosowujemy eksperymenty szeregów czasowych dla różnych gatunków, dostarczając krytycznych informacji na temat zmian ewolucyjnych w cyklu komórkowym. Aby rozpocząć, pobierz repozytorium wyrównania zegarów, wprowadzając polecenie w terminalu. Utwórz środowisko conda przy użyciu condarec.yml plik, wprowadzając polecenie do terminala w folderze, w którym sklonowano repozytorium wyrównania zegarów. Kliknij dwukrotnie condaV2023. jar znajdujący się w folderze Clocks w repozytorium wyrównania zegarów i poczekaj na otwarcie graficznego interfejsu użytkownika.Ekran umożliwia wprowadzanie opcji dla uruchomienia zegarów i wyświetla wyniki po uruchomieniu. Wprowadź warunki eksperymentalne, określając temperaturę w stopniach Celsjusza za pomocą pola tekstowego oznaczonego temperaturą, a następnie określ metodę synchronizacji za pomocą menu rozwijanego synchro.method. Aby wprowadzić ustawienia danych pączkowania, wybierz opcję pączek dla pączkujących drożdży z menu rozwijanego typu modelu.Zaimportuj dane, przesyłając plik za pomocą przycisku wyboru pliku lub wpisując go w polach wprowadzania tekstu w panelu importu danych. Pierwsza kolumna określa punkty czasowe, a pozostałe dwie kolumny określają dane pączkowania. Aby wprowadzić ustawienia danych cytometrii przepływowej, wybierz sekcję przepływu z menu rozwijanego typu modelu.Zaimportuj dane za pomocą panelu importu danych i kliknij wybierz plik, a następnie wybierz punkty czasowe w polu czasy dopasowania, dla których należy wykreślić dopasowanie zegarów cytometrii przepływowej. Po wybraniu wszystkich danych wejściowych do cytometrii pączkującej lub przepływowej, kliknij przycisk Zastosuj, a następnie przycisk próbki u góry ekranu. Wyświetl wykresy krzywej pączkowania lub cytometrii przepływowej na karcie przewidywanych pasowań.Uzyskaj parametry Zegary z pasowania, wybierając zakładkę Parametry tylne. Wynikowa tabela zawiera każdy wiersz składający się z parametru, przy czym ostatni wiersz jest wierszem tylnym. Kolumny składają się z przewidywanego parametru średniej, 2,5% dolnego przedziału ufności, 97,5% górnego przedziału ufności i współczynnika akceptacji.Krzywe pączkujące zegarów były prawidłowo dopasowane, o czym świadczą punkty danych nakładające się na odpowiadającą im krzywą dopasowania z małym pasmem ufności 95%. Na podstawie danych fazowych cyklu komórkowego cytometrii przepływowej Zegary tworzą zegary pasujące do każdego wybranego punktu czasowego. Aby rozpocząć, aktywuj środowisko conda, wprowadzając polecenie w terminalu.Użyj polecenia, aby otworzyć interaktywny notes języka Python. Utwórz nowy notes języka Python w żądanym folderze, podając odpowiednią nazwę, a następnie zaimportuj plik języka Python zawierający funkcje wyrównania, uruchamiając polecenie w pierwszej komórce. Jeśli używasz danych pączkowania jako danych fazy cyklu komórkowego, zaimportuj ramkę danych zawierającą procent dopasowania w każdym punkcie czasu, uruchamiając polecenie w nowej komórce, a następnie dopasuj dane pączkowania do skali czasu punktu linii życia, wprowadzając funkcję do nowej komórki.Następnie zaimportuj eksperymentalną ramkę danych do notesu, uruchamiając polecenie w nowej komórce. Dopasuj dane eksperymentalne do skali punktu czasu linii życia, wprowadzając funkcję do nowej komórki. Następnie wprowadź polecenie w nowej komórce, aby pobrać zestaw danych wyrównanych do linii życia.Pączkujące dane zebrane z sekwencji RNA w warunku 2 wykazały procentowy spadek w czasie zarówno dla niewyrównanej skali czasu w minutach, jak i wyrównanej skali czasu w punktach linii życia. Dane cytometrii przepływowej zebrane dla zestawu danych warunku 2 wykreślone dla wybranych punktów czasowych wykazały, że dane pasowały do fazy określonej przez wyrównanie. Wykreśl pączkujące krzywe przed wyrównaniem za pomocą funkcji narzędziowej Pythona, wprowadzając polecenie do nowej komórki.Następnie wykreśl pączkujące krzywe po wyrównaniu za pomocą funkcji narzędziowej Pythona. Użyj dostarczonego porównania wykresów liniowych w fiolce narzędzi języka Python, aby wykonać porównania wykresów liniowych w oryginalnej, wyrównanej lub wyrównanej i interpolowanej ramce danych, wpisując polecenie w nowej komórce. Zaimportuj plik listy genów CSV lub TSV do notesu przy użyciu polecenia w nowej komórce.Następnie użyj podanej funkcji wykresu porównania mapy cieplnej w pliku narzędzi języka Python, aby wykonać porównanie mapy cieplnej na wyrównanej, interpolowanej i wyrównanej fazowo ramce danych, wpisując polecenie w nowej komórce. Porównanie wyrównanych i niewyrównanych danych transkryptomatycznych wykazało, że przed wyrównaniem pierwsza ekspresja piku w eksperymentach z mikromacierzą wydawała się wyrównana z drugim pikiem w eksperymencie sekwencyjnym RNA. Jednak po wyrównaniu pierwsze piki cyklu komórkowego każdego zestawu danych są odpowiednio wyrównane.Porównanie danych fazowych cyklu komórkowego w eksperymentach z różnymi okresami wykazało widoczne różnice w okresie w niewyrównanych krzywych pączkowania, podczas gdy wyrównanie zegarów sprawiło, że trzy krzywe wyglądały niezwykle podobnie, umożliwiając porównanie danych eksperymentalnych. Dane dotyczące fazy cyklu komórkowego dla każdego porównywalnego punktu linii życia nie były identyczne w obu warunkach. Porównanie danych transkryptomicznych z eksperymentów z różnymi okresami wykazało, że przed wyrównaniem dynamika transkryptu CDC 20 nie nakładała się na siebie, ale po wyrównaniu piki wystąpiły w tej samej fazie cyklu komórkowego, ale kształty krzywych były różne.Geny zostały wykreślone jako mapy ciepła w tej samej kolejności dla wszystkich trzech warunków, zarówno dla niewyrównanych, jak i wyrównanych.

alignment-synchronized-time-series-data-using-characterizing-loss

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Synchronizacja komórek bakteryjnych jest niezbędna do badań nad cyklem komórkowym i rozwojem bakterii.  Caulobacter crescentus można synchronizować poprzez wirowanie gęstości, co pozwala na szybkie i skuteczne narzędzie do badań cyklu komórkowego bakterii.  Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół synchronizacji komórek Caulobacter.

Synchronizacja Caulobacter crescentus w celu zbadania cyklu komórkowego bakterii

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Komora pomiarowa analitycznej ultrawirówki (AUC) mieści próbkę oraz bufor referencyjny i podczas eksperymentów jest poddawana działaniu wysokiej próżni oraz prędkościom rotacji do 60 000 rpm. Niniejszy film zaprezentuje rygorystyczną dbałość o szczegóły, która jest niezbędna podczas montażu, napełniania i centrowania tego kluczowego elementu eksperymentu AUC.

Montaż, napełnianie i centrowanie celi pomiarowej analitycznej ultrawirówki

Pirofosforany inozytolu odgrywają istotną rolę w patologiach ludzkich, takich jak nowotwory, cukrzyca i otyłość; jednak dokładny mechanizm ich działania pozostaje kwestią sporną. Brak komercyjnie dostępnych pirofosforanów inozytolu sprawia, że szczegółowe badania są problematyczne. W niniejszej pracy opisujemy prosty protokół produkcji i izolacji miligramowych ilości pirofosforanów inozytolu.

Przygotowanie wysokiej jakości pirofosforanów inozytolu

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Funkcjonalność komórek beta jest ważna dla homeostazy glukozy we krwi, która jest oceniana w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą genetycznie zakodowanego reportera dla napływu wapnia.

Analiza funkcji komórek beta za pomocą obrazowania wapnia w rozdzielczości pojedynczej komórki na wysepkach danio pręgowanego

Skurcze macicy są ważne dla dobrego samopoczucia kobiet. Jednak patologicznie zwiększona kurczliwość może powodować bolesne miesiączkowanie, szczególnie u młodszych kobiet. W tym miejscu opisujemy prosty preparat ex vivo, pozwalający na szybką ocenę skuteczności leków zwiotczających mięśnie gładkie, które mogą być stosowane w leczeniu bolesnego miesiączkowania.

Metoda ex vivo do oceny spontanicznej ruchliwości układu rozrodczego myszy oraz algorytm śledzenia ruchu macicy oparty na MATLAB do analizy danych

Poznaj metodę Clocks lifeline alignment do analizy szeregów czasowych w cyklu komórkowym drożdży. Umożliwia ona fazowe porównania transkryptomicznych i proteomicznych danych między eksperymentami.

Wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami (Wideo) | JoVE Journal

Wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami

Przeglądaj więcej filmów