Optymalizacja analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus przez immunoblotting

W ciągu życia zwierzęcia decyzje dotyczące siarczanów podejmowane są nieustannie, co pozwala na prawidłowy rozwój i zdrowie organizmu dorosłego. Decyzje te zależą od konkretnych białek przypisanych regulatorom siarczanów. Celem naszych badań jest znalezienie mechanizmów kontrolujących syntezę tych kluczowych regulatorów.

Oprócz szczegółowego zarysu immunoblottingu oraz oocytów i embrionów Xenopus, nasz protokół daje wgląd w wyzwania typowe dla tego organizmu modelowego, takie jak pozyskiwanie przeciwciał. Dzięki dogłębnym badaniom mechanizmów wiązania i represji w Bicaudal C nasze badania pomogły stworzyć podstawę informacji umożliwiającą porównanie innych regulatorów translacji. Aby rozpocząć przetwarzanie komórek do immunoblotowania, dodaj 10 mikrolitrów buforu do lizy komórek schłodzonych, rozcieńczonego do jednokrotnego stężenia podwójnie dejonizowaną wodą na zarodek lub oocyt.

Używając mikrotłuczka, ujednolic próbki na lodzie. Umieść probówki w wirówce stołowej i obracaj próbki w temperaturze 5 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, aby rozpylić zanieczyszczenia, w tym żółtko i nierozpuszczalne pigmenty. Przenieś supernatant do czystej rurki o pojemności 1,5 mililitra, zapewniając, że podczas transferu nie zostanie naruszona pellet.

Do zebranego supernatantu dodaj równą objętość dwukrotnego buforu próbki Laemmli, uzupełnioną o 5% wagi objętościowej 2-merkaptoetanolu. Podgrzej mieszankę w temperaturze 95 do 100 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby denaturować białka. Teraz wyjmij prefabrykowany żel SDS o zawartości 4 do 12% bis-tris z opakowania i zdejmij naklejkę z dołu żelu.

Wkładaj żel do zespołu elektrod naprzeciwko zapory buforowej i umieszczaj cały zespół w pionowym zbiorniku elektroforetycznym. Następnie wypełnij zarówno elektrodę, jak i dno zbiornika buforem Tris-MOPS-SDS. Delikatnie wyjmij grzebień żelowy i pipetę prowadząc bufor do dołków, aby usunąć pęcherzyki i wyrównać bufor.

Teraz załaduj pięć mikrolitrów wcześniej barwionych standardów białkowych do pierwszego dołku i 10 mikrolitrów każdej przygotowanej próbki do pozostałych dołków. Załóż pokrywę na zbiornik elektroforezy i podłącz go do zasilania. Następnie ustaw napięcie na 200 woltów, aby rozpocząć elektroforezę.

Elektroforeza zatrzymać, gdy przód barwnika próbki-buforu opuści żel. Przed zakończeniem elektroforezy zacznij składać kanapkę transferową w klipsie. Napełnij szklaną naczynkę do pieczenia schłodzonym buforem transferowym i zanurz wszystkie materiały transferowe w tym buforze podczas montażu.

Włóż klips transferowy do miseczki, z czarną połową opartą o dno, białą połową skierowaną do góry, a klipsem otwartym w lewo. Połóż jedną lub dwie gąbki z włókna płasko na czarnej połowie klipsa transferowego. Po wycięciu dwóch kawałków papieru chromatograficznego o średnicy 0,35 milimetra na odpowiedni rozmiar, połóż jeden na gąbkach.

Po zakończeniu elektroforezy usuń żel z zbiornika elektroforezy. Używając dźwigni otwierającej kasetę żelową, ostrożnie rozchyl płyty żelowe, dbając o to, aby żel pozostał przymocowany do jednej strony. Przytnij wgłębienia od góry żelu za pomocą zwalniacza.

Połóż żel, który nadal jest przyklejony do jednej połowy plastikowej kasety, na papierze filtracyjnym i usuń pozostałą połowę kasety, aby żel pozostał płaski na papierze. Następnie wytnij kawałek membrany nitrocelulozowej o średnicy 0,45 mikrometra, aby dopasował go do wymiarów żelu. Usuń membranę z papieru ochronnego, krótko zwilż ją w buforze transferowym i ostrożnie umieść na żelu.

Następnie połóż drugi kawałek papieru filtracyjnego na membranę nitrocelulozową. Używając rolki, delikatnie, ale stanowczo wyciskaj wszystkie pęcherzyki powietrza. Ułóż jedną lub dwie dodatkowe gąbki z włókna na papierze filtracyjnym, aby dokończyć kanapkę.

Zamknij kasetę transferową i mocno ją przypięj, aby uszczelnić złożoną kanapkę. Następnie włóż zamkniętą kanapkę transferową do rdzenia transferowego z klipsem skierowanym do góry i upewnij się, że strona klipsa jest skierowana do czarnej strony rdzenia. Włóż rdzeń transferowy do zbiornika elektroforezy.

Dodaj do zbiornika okład z lodem i batonik mieszanki, aby batonik mógł swobodnie się obracać. Napełnij zbiornik schłodzonym buforem transferowym, aż urządzenie będzie całkowicie zanurzone, i zabezpiecz pokrywę na wierzchu. Podłącz urządzenie do zasilacza, dopasuj kolory elektrod i ustaw warunki na 100 woltów przez godzinę, obracając się barkiem mieszającego.

Po zakończeniu transferu ostrożnie otwórz kasetę i rozłóż kanapkę. Usuń błonę nitrocelulozową i zaznacz stronę, która miała kontakt z żelem. Następnie umieść membranę nitrocelulozową w małym pojemniku, tak aby leżała płasko na dnie.

Całkowicie pokryj membranę bejcą Ponceau i delikatnie kołysz na buźce przez 5 do 10 minut. Po wylaniu barwnika Ponceau spłucz membranę kilkakrotnie wodą podwójnie dejonizowaną, aż nadmiar barwy zostanie usunięty i w pasach pojawią się pasma białkowe. Następnie wykonaj blokowanie błon, inkubację przeciwciał oraz płukanie, zgodnie z pokazaniem.

Po zakończeniu inkubacji i płukania przeciwciał wtórnych, błona jest gotowa do obrazowania. W ciemnym pomieszczeniu włącz wywoływacz i pozwól mu się rozgrzać. Wytnij dwa kwadraty folii foliowej na tyle dużej, by całkowicie zakryć membranę.

Za pomocą kleszczy umieść membranę nitrocelulozową do góry na pierwszym kwacie folii spożywczej. W probówce o pojemności 1,5 mililitra wymieszaj równe ilości luminolu z wzmocnioną chemiluminescencją oraz odczynników wzmacniających. Następnie użyj około jednego mililitra tej mieszaniny, aby pokryć większość błon.

Używając folii plastikowej, delikatnie manipuluj membraną, aby cała powierzchnia była równomiernie pokryta i inkubuj przez minutę. Następnie usuń nadmiar odczynnika ECL, chwytając membranę kleszczami i lekko strząśnij płyn. Umieść membranę twarzą do góry na drugim kwacie folii plastikowej, luźno ją złóż na membranę i mocno przyklej taśmą do kasety do autoradiografii.

Następnie zrób zdjęcie błony za pomocą filmu radiograficznego w ciemnym pomieszczeniu, wykonując poniesione kroki. Po uzyskaniu pożądanej wizualizacji białka wyrównaj wywołaną warstwę z markerami świecącymi w ciemności i użyj ich jako przewodnika do oznaczenia pozycji wcześniej barwionych standardów białka na warstwie. Po zakończeniu obrazowania ostrożnie wyjmij membranę z folii plastikowej i zanurz ją w TBSTW, aby zmyć pozostałości odczynnika ECL.

Barwienie błony metodą Ponceau potwierdziło pomyślny transfer białka. Endogenne białko B1 nie zostało wykryte w próbkach oocytów, ale wyraźnie wykryto je w próbkach zarodków w stadium siódmym i dziesiątym i 10,5 o masie około 107 kilodaltonów. W próbkach wstrzykiwanych we wszystkich stadiach z użyciem przeciwciała Bicc1 wykryto mniejsze pasmo białka o długości 70 kilodaltonów, co wskazuje na skuteczną ekspresję fuzji C-terminalnej HA-Bicc1.

Przeciwciało HA wykrywało ten sam pas 70-kilodaltonowy tylko w wstrzykniętych próbkach, co potwierdza specyficzność przeciwciała Bicc1 dla białka fuzji. Dwa pasma o masie cząsteczkowej, około 250 i 270 kilodaltonów, wykryto we wszystkich próbkach z użyciem przeciwciała CNOT1. Ekspresja białka DDX6 o stężeniu 54 kilodalton została wykryta we wszystkich próbkach, ale widocznie zmniejszona w zarodkach stadium 10,5.