Name: Optymalizacja analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus przez immunoblotting (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj protokół immunoblottingu do analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus. Metoda obejmuje lizę komórek, SDS-PAGE, transfer na membranę i detekcję przeciwciałami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laurze Vanderploeg za przygotowanie danych oraz laboratorium Billa Bementa za dostarczenie oocytów Xenopus . Dziękujemy także Marko Horbowi, Kelsey Coppenrath oraz Narodowemu Zasobowi Xenopusa, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, za dostarczenie zarodków Xenopus tropicalis . Chcielibyśmy również podziękować Emily T. Johnson za jej wnikliwe uwagi dotyczące manuskryptu. Prace te korzystały ze wsparcia Xenbase (http://www.xenbase.org/; RRID: SCR_003280). Prace w laboratorium Sheets są wspierane przez NICHD (R01HD091921) oraz NIGMS (R01GM152615). Charlotte Kanzler jest wspierana przez Program Szkoleniowy z Biotechnologii realizowany przez National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health (T32GM135066).

Cała praca ze zwierzętami (X. laevis) reprezentowana w tym protokole jest zgodna z i została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt UW-Madison. Szczegóły dotyczące sprzętu, używanych odczynników oraz stosowanych stężeń przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów. Wybór sprzętu można zobaczyć na Rysunku 2 poniżej.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69139/69139fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Przetworzony ekstrakt z zarodków i sprzęt do immunoblotowania. (A) Wirowany ekstrakt z oocytu X. laevis stadium VI. Lipidy i białka rozpuszczalne w tłuszczach unoszą się na powierzchnię, podczas gdy witellogenina (żółtko) i pigmentowane resztki tworzą pellet. (B) Sprzęt do rozdzielania białek według masy cząsteczkowej SDS-PAGE. (i) Zasilacz, (ii) pionowy zbiornik elektroforezy, (iii) pokrywa zbiornika elektroforezy, (iv) zespół elektrod, (v) zapora buforowa, (vi) prefabrykowany żel elektroforezy; Zwróć uwagę na zielony grzebień (u góry) i niebieską naklejkę (na dole), z których każdy musi zostać usunięty. (C) Sprzęt do transferu membran. Pionowy zbiornik elektroforezy i pokrywa są ponownie wykorzystywane do transferu po dokładnym płukaniu. (i) Rolka do usuwania pęcherzyków, (ii) Klips transferowy, (iii) Mały pręt mieszanki, (iv) Membrana nitrocelulozowa pomiędzy dwoma ochronnymi niebieskimi arkuszami papieru, (v) Papier filtracyjny do chromatografii celulozowej, (vi) Poduszki gąbkowe transferowe, (vii) Szklana naczynka do pieczenia do montażu transferowego, (viii) Okład lodowy, (ix) rdzeń transferowy. (D) Inny sprzęt. (i) Zwalniacz żelu (do przycinania żelowych wejść przed transferem), (ii) Dźwignia otwierania kaset żelowych, (iii) Kleszcze (do obsługi membrany), (iv) Pojemnik (do przechowywania membrany), (v) pokrywa pojemnika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/69139fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
1. Zbieranie oocytów i zarodków Xenopus 
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek jajowych<ol>
		<li>Pobierz odfolikulowane oocyty X. laevis od komercyjnego dostawcy (Ecocyte Bio Science, Austin, Teksas) lub izoluj i odfolikuluj zgodnie z opisanąmetodą 8.</li>
		<li>Posiew izolował oocyty w zmodyfikowanym roztworze Bartha (MBS; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,4 mM CaCl2, 0,33 mM Ca(NO3)2, 0,8 mM MgSO4, 5 mM Tris-HCl, 2,4 mM NaHCO3, pH 7,4) aż do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zarodków<ol>
		<li>Wyizolować jaja X. laevis i zapłodnić je zgodnie z opisem 9,10.</li>
		<li>Hodowla zapłodniła zarodki w 0,25x zmodyfikowanym roztworze Ringera Marc'sLimited 11 (MMR) (1x MMR: 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES).</li>
		<li>Przygotuj roztwór 2% cysteiny w 0,1x MMR z pH dostosowanym do 8,2 przy użyciu NaOH.</li>
		<li>Usuń 0,25x MMR z naczynia używanego do zapłodnienia i pokryj zarodki roztworem cysteiny, aby usunąć galaretkową powłokę12. Delikatnie wymieszaj roztwór, aby zarodki były równomiernie naświetlone.</li>
		<li>Monitoruj zarodki uważnie za pomocą stereomikroskopu od 2x do 25x powiększenia. Po rozpuszczeniu się galarety (zazwyczaj 3-5 minut) zarodki zgromadzają się blisko siebie. Unikaj długotrwałej ekspozycji na cysteinę.</li>
		<li>Usuń roztwór cysteiny i płucz zarodki wielokrotnie 0,25x MMR.</li>
		<li>Hodować 0,25x MMR aż do pożądanego etapu wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobierz pożądaną liczbę zarodków lub oocytów (zalecane co najmniej pięć na próbkę) do probówki o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Usuń nadmiar podłoża pipetem, unikając uszkodzenia komórek.</li>
	<li>Użyj próbek od razu lub przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Oocyty i zarodki mogą być przechowywane przez kilka lat.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktu Xenopus
<ol>
	<li>Próbki rozmrażać na lodzie, jeśli są zamrożone.</li>
	<li>Dodaj 10 μL schłodzonego buforu lizy 10x komórek, rozcieńczonego do 1x z podwójnie zdejonizowaną wodą (patrz Tabela materiałów) na zarodek/oocyt i ujednolic próbki mikrotłuczkiem na lodzie.</li>
	<li>Próbki rotacji w 5000 g w 4 °C w wirówce stołowej przez 10 minut, aby uwolnić zanieczyszczenia, w tym żółtko i nierozpuszczalne pigmenty.</li>
	<li>Przełóż supernatant do osobnej probówki 1,5 mL, uważając, by nie pojawić się granulek (Rysunek 2A).</li>
	<li>Dodaj do supernatantu równą objętość 2x buforu próbki Laemmli z dodatkiem 5% w 2-merkaptoetanolu i gotuj przez 10 minut w temperaturze 95-100 °C, aby denaturować białka próbki.</li>
	<li>Używaj próbek natychmiast lub przechowuj je w temperaturze -20 °C przez miesiące lub lata.</li>
</ol>
3. STRONA NA KARTCE SDS
<ol>
	<li>Przygotuj bufor biegowy SDS: 1x bufor Tris-MOPS-SDS (6,06 g zasady Tris, 10,46 g 3- (N-morfolino)propanosulfonowego kwasu [MOPS], 1,0 g SDS, 0,3 g etylendiaminetetraoctowego kwasu [EDTA], podwójnie zdejonizowana woda do 1000 mL).</li>
	<li>Wyjmij z opakowania prefabrykowany żel bis-tris SDS o stężeniu 4-12%. Usuń naklejkę na dole żelu.</li>
	<li>Włóż żel do zespołu elektrody naprzeciwko zapory buforowej. Umieść zespół elektrod w pionowym zbiorniku elektroforezy (Rysunek 2B).</li>
	<li>Napełnij zespół elektrody i dno zbiornika elektroforezy 1x buforem Tris-MOPS-SDS.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij grzebień żelowy z żelu i pipety, wprowadzając bufor do dołków, aby usunąć pęcherzyki i wyrównać bufor.</li>
	<li>Ostrożnie załaduj 5 μL wcześniej barwionych standardów białkowych do pierwszego dołku i po 10 μL każdej próbki do kolejnych dołków.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) Załaduj pozostałe studnie 10 μL bufora próbek Laemmliego, aby żel działał równomierniej.</li>
	<li>Załóż pokrywę na zbiornik elektroforezy i podłącz go do zasilania. Stosuj 200 V.</li>
	<li>Elektroforeza zatrzymać, gdy przednia część barwnika buforu próbki opuści żel.</li>
</ol>
4. Mokry transfer białek na błonę
<ol>
	<li>Podczas elektroforowania próbek przygotuj 1 L buforu transferowego (3,0 g Tris Base, 4,08 g bicyny, 900 mL podwójnie dejonizowanej wody, 100 mL metanolu). Wstępnie schłodź bufor transferowy w temperaturze 4 °C. UWAGA: Obchodz się z koncentrowanymi zapasami metanolu w okapie i unikaj kontaktu ze skórą. Metanol można zastąpić etanolem.</li>
	<li>Przed zakończeniem elektroforezy zacznij składać "kanapkę" transferową w klipsie transferowym (Rysunek 2C).<ol>
		<li>Napełnij szklaną naczynę do pieczenia schłodzonym buforem transferowym. W kolejnych etapach montażu kanapek upewnij się, że materiały są zanurzone w tym buforze.</li>
		<li>Umieść klips transferowy w naczyniu tak, że połowa leży na dnie naczynia, biała część otwarta i skierowana do góry, a klips otwarty w lewo.</li>
		<li>Połóż jedną lub dwie gąbki z włókna płasko na czarnej połowie klipsa transferowego.</li>
		<li>Wytnij dwa papiery chromatografii celulozowej o średnicy 0,35 mm (papiery filtracyjne) na odpowiedni rozmiar i połóż jeden na gąbkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu elektroforezy usuń żel z zbiornika elektroforezy.</li>
	<li>Ostrożnie rozchyl płytki żelu za pomocą dźwigni otwierającej kasetę żelową, upewniając się, że żel pozostaje przymocowany do jednej z płyt (Rysunek 2D). Przytnij wgłębienia od góry żelu za pomocą żelu.</li>
	<li>Połóż żel, nadal przymocowany do jednej połowy plastikowej kasety, na papierze filtracyjnym. Zdejmij połowę kasety, żeby żel pozostał na papierze filtracyjnym.</li>
	<li>Wytnij kwadrat o powierzchni 0,45 μm błony nitrocelulozy, aby dopasował go do wymiarów żelu. Usuń membranę z papieru ochronnego, zwilż ją krótko w buforze transferowym i połóż na żelu. UWAGA: Ostrożnie obchodz się z membraną za rogi, używając rękawiczek lub kleszczy, aby uniknąć niepożądanego zanieczyszczenia błony białkami.</li>
	<li>Na membranę nitrocelulozową połóż drugi papier filtracyjny. Delikatnie, ale stanowczo usuwaj wszelkie bąbelki, używając wałka na wierzchu papieru filtracyjnego.</li>
	<li>Ułóż na papierze filtracyjnym jeszcze jedną lub dwie gąbki z włókna.</li>
	<li>Zamknij kasetę transferową i mocno ją zatrzaskaj, kończąc "kanapkę".</li>
	<li>Włóż kanapkę transferową do rdzenia transferowego tak, że klips transferowy jest skierowany do góry, a strona klipsa transferowego skierowana do czarnej strony rdzenia.</li>
	<li>Włóż rdzeń transferowy do zbiornika elektroforezy. Dodaj do zbiornika okład z lodem i batonik mieszanki, aby mógł się swobodnie obracać. UWAGA: Oprócz lub zamiast okładu lodowego, transfer można wykonać w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C w kroku 4.13.</li>
	<li>Napełnij zbiornik schłodzonym buforem transferowym. Mocno zabezpiecz pokrywkę na górze.</li>
	<li>Podłącz urządzenie transferowe do zasilacza, upewniając się, że kolory elektrod są wyrównane. Przelew przez 1 godzinę, 100 V, w temperaturze 4 °C, z rotacją batonika mieszanki.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie błonowe po transferze
<ol>
	<li>Przygotuj 10x tris-buffered solankę fizjologiczną (100 mM bazy Tris; 1,5 M NaCl). Ustaw pH do 8 i sterylizuj filtr.</li>
	<li>Przygotuj 1x tris-buforowaną sól fizjologiczną Tween-20 (TBSTw), rozcieńczając 10x roztwór łyżek 1:10 w 500 mL podwójnie zdejonizowanej wodzie i dodając 500 μL Tween-20.</li>
	<li>Przygotuj bufor blokujący (500 mL TBSTw, 25 g mleka w proszku bez tłuszczu). UWAGA: Mleko beztłuszczowe można zastąpić 2-5% albuminą surowicy bydłej (BSA) w buforze blokującym. BSA powinno być stosowane, jeśli eksperymentalne zastosowania polegają na wizualizacji białek biotynylowych, ponieważ mleko zawiera biocynę.</li>
	<li>Po zakończeniu transferu ostrożnie usuń i rozmontuj kanapkę oraz usuń membranę nitrocelulozową. Zaznacz, która strona błony stykała się z żelem, i w kolejnych etapach trzymaj tę stronę skierowaną do góry.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml barwnika Ponceau (0,5% Ponceau S, 1% kwasu octowego), odwracalnego barwnika do wizualizacji białek. UWAGA: Bejca Ponceau jest. Unikaj kontaktu ze skórą.</li>
	<li>Umieść membranę w małym pojemniku (jak pokazano na Rysunku 2D), tak aby leżała równo przy dnie pojemnika. Pokryj membranę bejcą Ponceau aż do zanurzenia i delikatnie kołysz na bujace przez 5-10 minut.</li>
	<li>Wylej bejcę Ponceau. UWAGA: Bejcę Ponceau można używać wielokrotnie.</li>
	<li>Płucz membranę wielokrotnie z wodą podwójnie dejonizowaną, aż nadmiar Ponceau zostanie usunięty i pasma białkowe w torach zaczną się rozpuszczać.</li>
	<li>Sprawdź skuteczność przejścia na obecność prostych, równych pasów z wyraźnie wyróżnionymi pasmami.</li>
	<li>Wylej resztki płynu i zanurz blot w buforze blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z błoną w kolejnych etapach.</li>
	<li>Delikatnie kołysać na bujacej kółce przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
6. Inkubacja przeciwciał
<ol>
	<li>Rozcieńcz przeciwciało główne w 10 mL świeżego buforu blokującego do pożądanego stężenia. UWAGA: Optymalne stężenie będzie musiało zostać ustalone empirycznie dla każdego nowego przeciwciała. Typowy punkt startowy to 1:1000, albo należy stosować się do zaleceń producenta.</li>
	<li>Usuń bufor blokujący i zamień go na mieszankę przeciwciał. Inkubuj, kołysząc delikatnie, przez noc (~16 h) w 4 °C.</li>
	<li>Wylej roztwór przeciwciał pierwotnych i przepłucz błonę TBSTw, zanurzając ją w roztworze i szybko wylewając. UWAGA: Większość mieszanek przeciwciał można zachować i ponownie użyć dwa do trzech razy. Musi to być określone empirycznie dla każdego przeciwciała.</li>
	<li>Umyj membranę, zanurzając ją w TBSTw i delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wykonaj łącznie trzy mycia po 5 minut.</li>
	<li>Rozcieńcz przeciwciało wtórne w 30 mL TBSTw do pożądanego stężenia. UWAGA: Stężenie musi być określone empirycznie dla każdego przeciwciała. Zazwyczaj używamy 1:30 000.</li>
	<li>Wylej roztwór do płukania TBSTw i zamień go mieszanką przeciwciał wtórnych. Inkubuj, delikatnie kołysząc przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szybko opłukaj membranę raz TBSTw, a następnie trzy 5-minutowe mycia TBSTw.</li>
</ol>
7. Obrazowanie błony na wywoływaczu filmowym
<ol>
	<li>W ciemni włącz wywoływacz filmu i pozwól mu się rozgrzać.</li>
	<li>Wytnij dwa kwadraty folii foliowej na tyle dużej, by objąć membranę. Za pomocą kleszczy umieść membranę nitrocelulozową twarzą do góry na pierwszym kwadle folii spożywczej.</li>
	<li>W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj równe ilości luminolu i odczynników wzmacniających chemiluminescencję (ECL). Użycie 1 mL roztworu mieszanego powinno pokryć większość błon.</li>
	<li>Pipetą nałóż odczynnik ECL na membranę i delikatnie ją manipuluj za pomocą folii plastikowej, aby zapewnić pełne pokrycie. Inkubuj przez 1 minutę.</li>
	<li>Usuń nadmiar odczynnika ECL, chwytając błonę kleszczami i delikatnie strząsając ciecz lub odprowadzając płyn, dotykając rogu błony ręcznika papierowego.</li>
	<li>Umieść membranę odwróconą do góry na drugim kwacie folii i złóż folię na membranę, aż będzie luźno zamknięta. Zawij owiniętą membranę szczelnie do kasety radiograficznej.</li>
	<li>W ciemni umieść taśmę wewnątrz kasety, zakrywając taśmą błonę. Zamknij kasetę szczelnie i naświetl film na membranę na 1 minutę.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij folię, uważając, aby nie przeciągnąć odsłoniętej folii po membranie. Wlej to do wywoływacza.</li>
	<li>Po ocenie wywołanej folii dostosuj czas naświetlania kolejnymi warstwami, aż osiągniesz pożądaną wizualizację białka. Jeśli wizualizacja białka dostarcza słaby sygnał, powtórz krok inkubacji odczynnika ECL z bardziej czułym odczynnikiem ECL i ponownie zrób obraz.</li>
	<li>Wyrównaj wywołaną warstwę z markerami świecącymi w ciemności i użyj tego odniesienia, aby oznaczyć pozycję wcześniej barwionych standardów białka na błonie na warstwie.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania ostrożnie usuń membranę z folii plastikowej i zanurz ją w TBSTw, aby zmyć pozostałe odczynniki ECL.</li>
</ol>
8. (Opcjonalnie) Dodatkowe inkubacje przeciwciał
UWAGA: Usuwanie immunoblowu oznacza usunięcie początkowych przeciwciał pierwotnych i wtórnych za pomocą roztworu denaturującego (buforu demaskującego), aby plama mogła być ponownie zbadana innym przeciwciałem. Ponowne badanie pozwala na analizę tego samego immunoblowtu pod kątem ekspresji różnych celów białkowych oraz porównanie nieznanych białek z dobrze scharakteryzowanymi białkami, które pełnią funkcję standardu. Najpierw sonda z przeciwciałem, które generuje stosunkowo słabszy sygnał. Dzięki temu zapobiega powstawaniu artefaktów spowodowanych niecałkowicie usuniętymi przeciwciałami podczas kolejnych ekspozycji i minimalizuje wpływ utraty białka spowodowanej powtarzającym się usuwaniem bloty.
<ol>
	<li>Usuń związane przeciwciała, zanurzając błonę w buforze do zdejmowania i delikatnie kołysząc przez 5-10 minut.</li>
	<li>Usuń membranę z bufora do odbierania i krótko przepłucz w TBSTw, aby usunąć resztki roztworu do odbierania.</li>
	<li>Zanurz membranę w buforze blokującym i delikatnie kołysz przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotuj nowy roztwór pierwotnego przeciwciała w buforze blokującym o pożądanym stężeniu.</li>
	<li>Dodaj nowe pierwotne rozcieńczenie przeciwciał do błony i inkubuj delikatnie kołysząc się przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przejdź od kroku 6.3. Błonę można zdejmować i ponownie badać nawet trzy kolejne razy.</li>
</ol>

<ol><li>Gurdon, J. B., Wickens, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The use of Xenopus oocytes for the expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 101, 370-386 (1983).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Coller, J., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+function+assays%3A+an+adaptable+approach+to+study+RNA+regulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tethered function assays: an adaptable approach to study RNA regulatory proteins.</a> Methods Enzymol. 429, 299-321 (2007).</li>
<li>Minshall, N., Allison, R., Marnef, A., Wilczynska, A., Standart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+assessed+using+the+tethered+function+assay+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Translational control assessed using the tethered function assay in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 165-169 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Cooke, A., Park, S., Dewey, C. N., Wickens, M., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Waghray, S., Williams, C., Coon, J. J., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+CAF1+requires+NOT1-mediated+interaction+with+4E-T+to+repress+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Xenopus CAF1 requires NOT1-mediated interaction with 4E-T to repress translation in vivo.</a> RNA. 21 (7), 1335-1345 (2015).</li>
<li>Neff, A. W., Wakahara, M., Jurand, A., Malacinski, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analyses+of+cytoplasmic+rearrangements+which+follow+fertilization+and+accompany+symmetrization+of+inverted+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Experimental analyses of cytoplasmic rearrangements which follow fertilization and accompany symmetrization of inverted Xenopus eggs.</a> Development. 80 (1), 197-224 (1984).</li>
<li>Newman, K., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).</li>
<li>Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Obtaining Xenopus laevis eggs.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).</li>
<li>Shaidani, N. -I., McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Obtaining Xenopus laevis embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2021 (3), (2021).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> Development. 77 (1), 15-37 (1983).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dejellying+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dejellying Xenopus laevis embryos.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), dev200356(2022).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+Characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30 (3), 675-686 (1982).</li>
<li>Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal-to-zygotic+transition%3A+reprogramming+of+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The maternal-to-zygotic transition: reprogramming of the cytoplasm and nucleus.</a> Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).</li>
<li>Park, S., Blaser, S., Marchal, M. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+maternal+Bicaudal-C+controls+vertebrate+embryogenesis+via+translational+repression+of+mRNAs+encoding+cell+fate+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A gradient of maternal Bicaudal-C controls vertebrate embryogenesis via translational repression of mRNAs encoding cell fate regulators.</a> Development. 143 (5), 864-871 (2016).</li>
<li>Bull, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal%2C+a+genetic+factor+which+affects+the+polarity+of+the+embryo+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Bicaudal, a genetic factor which affects the polarity of the embryo in Drosophila melanogaster.</a> J Exp Zool. 161 (2), 221-241 (1966).</li>
<li>Mohler, J., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+maternal-effect+mutations+of+Drosophila+melanogaster+causing+the+production+of+double-abdomen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dominant maternal-effect mutations of Drosophila melanogaster causing the production of double-abdomen embryos.</a> Genetics. 112 (4), 803-822 (1986).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Minegishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+left-right+asymmetric+decay+of+Dand5+mRNA+in+the+mouse+embryo+requires+a+Bicc1-Ccr4+RNA+degradation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced left-right asymmetric decay of Dand5 mRNA in the mouse embryo requires a Bicc1-Ccr4 RNA degradation complex.</a> Nat Commun. 12 (1), 4071(2021).</li>
<li>Maerker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicc1+and+Dicer+regulate+left-right+patterning+through+post-transcriptional+control+of+the+Nodal+inhibitor+Dand5%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bicc1 and Dicer regulate left-right patterning through post-transcriptional control of the Nodal inhibitor Dand5.</a> Nat Commun. 12 (1), 5482(2021).</li>
<li>Piazzon, N., Maisonneuve, C., Guilleret, I., Rotman, S., Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicc1+links+the+regulation+of+cAMP+signaling+in+polycystic+kidneys+to+microRNA-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicc1 links the regulation of cAMP signaling in polycystic kidneys to microRNA-induced gene silencing.</a> J Mol Cell Biol. 4 (6), 398-408 (2012).</li>
<li>Kraus, M. R. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+mutations+in+human+BICC1+resulting+in+Wnt+pathway+hyperactivity+associated+with+cystic+renal+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Two mutations in human BICC1 resulting in Wnt pathway hyperactivity associated with cystic renal dysplasia.</a> Hum Mutat. 33 (1), 86-90 (2012).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+Bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein Bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Bouvrette, D. J., Sittaramane, V., Heidel, J. R., Chandrasekhar, A., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Bicaudal+C+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+causes+cystic+kidneys%3A+a+nonmammalian+model+of+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Bicaudal C in zebrafish (Danio rerio) causes cystic kidneys: a nonmammalian model of polycystic kidney disease.</a> Comp Med. 60 (2), 96-106 (2010).</li>
<li>Mahone, M., Saffman, E. E., Lasko, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Bicaudal-C+RNA+encodes+a+protein+containing+a+KH+domain%2C+the+RNA+binding+motif+of+FMR1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Localized Bicaudal-C RNA encodes a protein containing a KH domain, the RNA binding motif of FMR1.</a> EMBO J. 14 (9), 2043-2055 (1995).</li>
<li>Dowdle, M. E., Park, S., Blaser Imboden, S., Fox, C. A., Houston, D. W., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+KH+domain+in+Bicaudal-C+links+mRNA+binding+and+translational+repression+functions+to+maternal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A single KH domain in Bicaudal-C links mRNA binding and translational repression functions to maternal development.</a> Development. 146 (10), dev172486(2019).</li>
<li>Saffman, E. E., Styhler, S., Rother, K., Li, W., Richard, S., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+Bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein Bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chalabi Hagkarim, N., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulatory+properties+of+the+Ccr4-Not+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The regulatory properties of the Ccr4-Not complex.</a> Cells. 9 (11), E2379(2020).</li>
<li>Chicoine, J., Benoit, P., Gamberi, C., Paliouras, M., Simonelig, M., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Kugler, J. -M., Chicoine, J., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+associates+with+a+Trailer+Hitch%2FMe31B+complex+and+is+required+for+efficient+Gurken+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C associates with a Trailer Hitch/Me31B complex and is required for efficient Gurken secretion.</a> Dev Biol. 328 (1), 160-172 (2009).</li>
<li>Kamenska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DDX6-4E-T+interaction+mediates+translational+repression+and+P-body+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DDX6-4E-T interaction mediates translational repression and P-body assembly.</a> Nucleic Acids Res. 44 (13), 6318-6334 (2016).</li>
<li>Ladomery, M., Wade, E., Sommerville, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xp54%2C+the+Xenopus+homologue+of+human+RNA+helicase+p54%2C+is+an+integral+component+of+stored+mRNP+particles+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Xp54, the Xenopus homologue of human RNA helicase p54, is an integral component of stored mRNP particles in oocytes.</a> Nucleic Acids Res. 25 (5), 965-973 (1997).</li>
<li>Wühr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+proteomics+of+the+Xenopus+laevis+egg+using+an+mRNA-derived+reference+database%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep proteomics of the Xenopus laevis egg using an mRNA-derived reference database.</a> Curr Biol. 24 (13), 1467-1475 (2014).</li>
<li>Kurien, B. T., Dorri, Y., Dillon, S., Dsouza, A., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+western+blotting+for+determining+antibody+specificities+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An overview of western blotting for determining antibody specificities for immunohistochemistry.</a> Methods Mol Biol. 717, 55-67 (2011).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Western blotting: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 1312, 17-30 (2015).</li>
<li>Fisher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%3A+key+features+and+resources+of+the+Xenopus+model+organism+knowledgebase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase.</a> Genetics. 224 (1), iyad018(2023).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+anarchy%3A+a+call+to+order%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody anarchy: a call to order.</a> Nature. 527 (7579), 545-551 (2015).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+crisis%3A+blame+it+on+the+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reproducibility crisis: blame it on the antibodies.</a> Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).</li>
<li>Martin, S. A., Page, S. J., Piccinni, M. Z., Guille, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirming+antibody+specificity+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Confirming antibody specificity in Xenopus.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Choć prosty w koncepcji, immunoblotting jest trudny w praktyce ze względu na kilka etapów trwających kilka dni. Dlatego osiągnięcie spójnych, wysokiej jakości wyników często jest wyzwaniem. Niemniej jednak immunoblotting jest istotnym i wszechobecnym elementem współczesnej biologii. Na przykład immunoblotting jest kluczowy dla potwierdzenia skutecznej translacji i ekspresji mikrowstrzykniętego mRNA w oocytach i zarodkach X. laevis , podkreślając jego znaczenie dla badań nad X. laevis . Ponadto eksperymenty immunoprecipitacyjne wykorzystują immunoblotting do analizy interakcji białko-białko in vivo . Efektywne wykrywanie konkretnych białek będzie w dużej mierze zależało od ich obfitości oraz jakości odczynników wykrywających przeciwciała. W tym badaniu szacowane stężenia analizowanego endogennego białka w jaju Xenopus wahają się prawie 500-krotnie (Bicc1: 37,22 nM, Cnot1: 115,08 nM, Ddx6: 980,55 nM, Gapdh: 17 907,26 nM)34, ale wszystkie zostały łatwo wykryte. Poniżej tego zakresu można wprowadzać modyfikacje w przepływie pracy praktycznie na każdym etapie immunobloku — od pobierania próbek po obrazowanie — aby poprawić dokładność i efektywność wykrywania, jeśli jest to konieczne.
Wybór rodzaju żelu i membrany SDS-PAGE jest kluczowym czynnikiem przy każdym eksperymencie immunoblotting. Z naszego doświadczenia wynika, że prefabrykowane żele są bardziej proste i powtarzalne niż żele produkowane wewnętrznie. Prefabrykowane żele mają dodatkową zaletę, ponieważ są dostępne w formach gradientowych, gdzie żele stopniowo zwiększają stężenie poliakrylamidu od góry do dołu. Żele gradientowe pozwalają naukowcom rozłożyć i analizować szeroki zakres białek o bardzo różnych masach cząsteczkowych. Dzięki temu unika się typowego kompromisu między wyborem żelu o niskim stężeniu akryloamidu (<7%), który rozpuszcza białka o wysokiej masie cząsteczkowej, a żelem o wysokiej wartości (>12%), który lepiej rozwiązuje białka o niskiej masie cząsteczkowej. Ważne jest również, aby rozważyć, czy do transferu białek należy stosować membranę z nitrocelulozy lub fluorku poliwinylydenu (PVDF). Mechanizm i zalety każdego typu błony zostały szeroko omówione35,36. Krótko mówiąc, PVDF ma większą zdolność wiązania białek (a co za tym idzie większą czułość) niż membrana nitrocelulozowa i jest bardziej trwała przy wielokrotnym stosowaniu. Jednak PVDF wymaga dodatkowej obsługi w postaci aktywacji przez inkubację metanolu i jest droższy. Chociaż uważamy, że obie membrany nadają się do większości zastosowań, rutynowo stosujemy nitrocelulozę ze względów kosztowych.
Obrazowanie immunopłotycznego jest kluczowym elementem protokołu. Podczas tego etapu badacze muszą wykazać się rozsądkiem, aby uchwycić obraz immunoblota, który przekazuje wszystkie niezbędne informacje, ale minimalizuje hałas tła. Istnieją dwie główne metody obrazowania dla standardowych przeciwciał sprzężonych z HRP: film rentgenowski lub systemy obrazowania cyfrowego. Z naszego doświadczenia wynika, że robienie zdjęć na taśmie rentgenowskiej ma wiele zalet. Filmy rentgenowskie są zazwyczaj znacznie bardziej czułe niż systemy obrazowania cyfrowego, co ułatwia wykrywanie białek o niskiej ilości. Filmy rentgenowskie tworzą również fizyczny zapis eksperymentu, który można adnotować i digitalizować w wysokiej rozdzielczości. Jednak system cyfrowego obrazowania będzie miał znacznie lepszy zakres liniowy – relację między siłą sygnału a natężeniem obrazu – niż wywoływacz filmowy. Ze względu na swoją czułość, film rentgenowski może szybko ulec prześwietleniu, tracąc informacje ilościowe. Dlatego badacz poszukujący precyzyjnej ilościowej liczby swoich wyników powinien używać cyfrowego systemu obrazowania lub szczególnie uważać, aby nie prześwietlić rozwijających się immunoblotów filmem rentgenowskim.
Jeśli wyniki immunoblottingu są niezadowalające po zastosowaniu protokołu, jak określiliśmy, na przykład pojawią się słabe lub "rozmyte" pasy podczas badania obrazowego, można wprowadzić wiele korekt, aby poprawić wynik. Na przykład ilość analizowanej mieszaniny białek Xenopus może być dostosowana. Całkowite białko już z jednej piątej zarodka może dać silne rezultaty, choć możliwe jest załadowanie do dwóch zarodków lub oocytów na jeden kanał żelowy. Zbyt duże obciążenie białka może skutkować powstawaniem artefaktów lub fałszywych, silnych sygnałów tła podczas obrazowania. Dodatkowo, elektroforeza przy niższym napięciu (100 V) przy dłuższym czasie pracy zazwyczaj prowadzi do ostrzejszych pasm białek. Podobnie, przeprowadzenie transferu białka w nocy przy 4°C przy niskim napięciu (30 V) zamiast godziny przy 100 V może poprawić wykrywalność białek, zwłaszcza dla gatunków o wysokiej masie cząsteczkowej. Na koniec, niektóre pierwotne inkubacje przeciwciał wykrywają swoje cele bardziej intensywnie, stosując inkubacje trwające godzinę w temperaturze pokojowej, w porównaniu do 4 °C w nocy. Ta modyfikacja protokołu musi być testowana dla każdego pierwotnego przeciwciała.
Identyfikacja przeciwciał do wykrywania endogennych białek stanowi poważne wyzwanie dla immunoblottingu u Xenopus, ponieważ stosunkowo niewiele przeciwciał specyficznych dla Xenopusa jest dostępnych komercyjnie. Naukowcy mogą korzystać z niekomercyjnych źródeł przeciwciał Xenopus, takich jak Xenbase37 (https://www.xenbase.org/xenbase/), Developmental Studies Hybridoma Bank (https://dshb.biology.uiowa.edu/) oraz Europejskie Centrum Zasobów Xenopus (https://xenopusresource.org/). Alternatywnie, przeciwciała wytwarzane do rozpoznawania białek ludzkich lub myszych mogą być przydatne do wykrywania homologicznych białek Xenopus, w zależności od zachowania obszarów wykorzystywanych do produkcji przeciwciał. Na przykład przeciwciało Bicc1 przedstawione w tym protokole zostało podniesione przeciwko ludzkiemu białkowi Bicc1. Dla takich odczynników zdolność do reakcji krzyżowej z białkami Xenopus musi być określona empirycznie. Chociaż dokładne typy epitopów, których firmy produkują do tworzenia przeciwciał, są zazwyczaj zastrzeżone, wiele z nich udostępnia zakres aminokwasów dla epitopu na żądanie. Ten obszar można następnie wyrównać z odpowiadającym mu obszarem homologicznego białka Xenopusa. Chociaż sukces nie jest gwarantowany, zazwyczaj odnosiliśmy sukces, gdy epitop używany do produkcji przeciwciał u gatunku docelowego wykazywał co najmniej 75% lub więcej podobieństwa do porównywalnego fragmentu sekwencji u Xenopus. Przeciwciała wytwarzane przeciwko białkom niebędącym Xenopus powinny być walidowane przed szerokim zastosowaniem, ponieważ nieprawidłowa weryfikacja przeciwciał jest głównym czynnikiem rozwoju badań niepowtarzalnych 38,39. Można to osiągnąć poprzez ekspresję oznaczonego białka Xenopus interesującego embrionów za pomocą mikroiniekcji mRNA40. Analiza tych samych próbek z użyciem przeciwciała do tagu powinowactwa służy następnie do potwierdzenia, że przeciwciało do endogennego białka i przeciwciało do oznakowanego białka rozpoznają tę samą jednostkę (jak na Rysunku 3B).
Analiza białek wiążących RNA, zwłaszcza tych o funkcjach regulacyjnych, takich jak Bicc1, może okazać się trudna ze względu na niedobór odczynników i zazwyczaj niską ekspresję silnych cząsteczek regulacyjnych. Problem ten staje się bardziej widoczny w immunoblowtingu, gdzie każdy odczynnik musi być zoptymalizowany osobno, a znalezienie przeciwciał o wystarczającej swoistości i czułości może być trudne. Naszym celem w tym protokole jest uwzględnienie konkretnych ograniczeń immunobblotingu u Xenopus oraz opracowanie kroków stosujących się do innych systemów, aby naukowcy mogli pokonać trudności związane z analizą białek wiążących RNA.

Zrozumienie mechanizmów komórkowych wymaga monitorowania określonych gatunków białek. Najczęściej pojawiają się pytania obejmujące, jak zmieniają się w ekspresji przestrzennej i czasowej, z jakimi białkami wchodzą w interakcję oraz czy są modyfikowane w odpowiedzi na różne warunki. Immunoblotowanie, potocznie nazywane "Western blotting", jest kluczową metodologią radzenia sobie z tymi wyzwaniami. Eksperyment immunoblot oddziela białka od złożonej próbki – na przykład lizatu całokomórkowego – i identyfikuje je za pomocą przeciwciał. Konkretnie, białka są denaturowane, a następnie rozdzielane elektroforezą sodu dodecylowo-siarczanowo-poliakrylamidowej elektroforezą (SDS-PAGE) według rozmiaru. Frakcjonowane białka są przenoszone na stałe podłoże, takie jak błona nitrocelulozowa, a interesujące białko jest identyfikowane za pomocą odczynników przeciwciał. Immunoblotting stał się standardową częścią zestawu narzędzi biologa molekularnego. Jest powszechnie stosowany do monitorowania ekspresji białek w różnych kontekstach lub jako punkt końcowy w eksperymentach, takich jak testy immunoprecipitacyjne. Pomimo tych zalet, analiza poziomów białek w stanie stacjonarnym za pomocą immunoblottingu okazuje się trudna, ponieważ test musi być zoptymalizowany pod kątem każdego etapu i kontekstu eksperymentalnego (Rysunek 1).
Jednym z trudnych kontekstów jest analiza materiału afrykańskiej żaby pazurzastej Xenopus laevis. X. laevis jest ważnym organizmem do badania interakcji RNA-białko. Ten system ma wiele zalet, z których najważniejsza jest to, że X. laevis produkuje setki oocytów, a następnie synchronicznie rozwija się zarodki. Każdy oocyt zawiera ~25 μg białka1 nie-żółtkowego, co zapewnia obfitość materiału do eksperymentów biochemicznych. Duży rozmiar (~1250 μm)1 oocytów i zarodków ułatwia również mikroiniekcję mRNA w celu egzogennej ekspresji oznakowanych lub zmutowanych białek w skali2. Te cechy umożliwiają przeprowadzenie potężnych eksperymentów mających na celu badanie kontroli translacyjnej u X. laevis, takie jak test funkcji powiązanej, w którym wpływ translaacyjnego białka regulacyjnego na mRNA można ocenić niezależnie od zdolności tego białka do wiązania RNA 3,4,5,6. Jednak immunoblotting w oocytach i zarodkach Xenopus wiąże się z trudnościami, w tym z zakłóceniami spowodowanymi dużymi masami płytek żółtkowych w tych wczesnych komórkach7, co może zaciemnić wyniki, jeśli nie zostanie usunięte.
Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany protokół skutecznego immunoblottingu u X. laevis, ze szczególnym naciskiem na wykrywanie translacyjnych białek regulacyjnych. Udzielamy instrukcji, jak pobierać i przetwarzać oocyty oraz embriony do końcowego obrazowania immunopłotu. Zawiera także szczegółowe instrukcje dotyczące optymalnego ładowania białka i obrazowania, a także zapobiegania zanieczyszczeniu próbki żółtkiem. Ponadto omawiamy możliwe modyfikacje protokołu oraz strategie mające na celu znalezienie przeciwciał zgodnych z białkami Xenopus . Zamierzamy zapewnić badaczom wskazówki, aby bez wysiłku przeprowadzać immunoblotting w ramach własnych eksperymentów na tym niedostatecznie wykorzystywanym organizmie modelowym.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69139/69139fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Przepływ pracy przy przygotowywaniu próbki Xenopus i późniejszej analizie immunoplotycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/69139fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Ciężka folia premium o powierzchni 100 stóp kwadratowych</td><td>Saran</td><td>2570000130</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor lizy komórek</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#9803</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>2-kwartowe podłużne naczynie do pieczenia/serwowania</td><td>Pyrex</td><td>71160010116</td><td></td></tr><tr><td>2x bufor próbek Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało o wysokim powinowactwie anty-HA</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>Przygotowane zgodnie z instrukcjami i użyte w rozcieńczeniu 1:10 000.</td></tr><tr><td>Przeciwciało IgG przeciw królikom i HRP</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>7074S</td><td>Używany w rozcieńczeniu 1:30 000.</td></tr><tr><td>Kaseta radiograficzna, 5 x 7 cali</td><td>Research Products International</td><td>420057</td><td>Nie jest to konieczne, jeśli używasz cyfrowego systemu obrazowania.</td></tr><tr><td>Jednorazowe tłuczki Bel-Art</td><td>Millipore Sigma</td><td>BAF199230001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Bicaudal-C (ludzkie) królicze</td><td>Envigo Bioproducts (obecnie Inotiv)</td><td>N/A</td><td>Zamówione na zamówienie. Używany w rozcieńczeniu 1:20 000.</td></tr><tr><td>Przeciwciało Bicaudal-C (Xenopus) Królika</td><td>Envigo Bioproducts (obecnie Inotiv)</td><td>N/A</td><td>Zamówione na zamówienie. Używany w rozcieńczeniu 1:20 000. Ref. Park i in., 2016</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Zamiennik mleka odtłuszczonego w buforze blokującym.</td></tr><tr><td>Wirówka 5425</td><td>Eppendorf</td><td>13-864-456</td><td></td></tr><tr><td>CL-XPosure Film</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34091</td><td>Nie jest to konieczne, jeśli używasz cyfrowego systemu obrazowania.</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne u królika CNOT1 (D5M1K)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#44613</td><td>Stosowany w rozcieńczeniu 1:2 000.</td></tr><tr><td>DDX6/RCK (D26C11) Przeciwciało monoklonalne dla królika</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#8988</td><td>Stosowany w rozcieńczeniu 1:5 000.</td></tr><tr><td>E-Z Store i Pour Developer</td><td>MXR Imaging</td><td>103633</td><td>Nie jest to konieczne, jeśli używasz cyfrowego systemu obrazowania.</td></tr><tr><td>Sklep E-Z i naprawca wylewów</td><td>MXR Imaging</td><td>114511</td><td>Nie jest to konieczne, jeśli używasz cyfrowego systemu obrazowania.</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne GAPDH</td><td>ProteinTech</td><td>60004-1-Ig</td><td>Stosowany w rozcieńczeniu 1:40 000.</td></tr><tr><td>Żelowy wypuszczacz</td><td>Bio-Rad</td><td>#1653320</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw mysim IgG (H+L) u koz, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>A16066</td><td>Przygotowane zgodnie z zaleceniami i użyte w rozcieńczeniu 1:40 000.</td></tr><tr><td>Okład z lodu, 8 oz, 5 x 3 x 1"</td><td>Uline</td><td>S-18256</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Procesor medycznych filmów</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td>Nie jest to konieczne, jeśli używasz cyfrowego systemu obrazowania.</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Dźwignia otwierania kasety</td><td>Bio-Rad</td><td>#4560000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Ogniwo Tetra Vertical Electroforesis,</td><td>Bio-Rad</td><td>#1658004</td><td></td></tr><tr><td>MSE PRO 700ml zbiornik elektroforezy Western Blot</td><td>Zaopatrzenie MSE</td><td>BB2369</td><td></td></tr><tr><td>Błona nitrocelulozowa, 0,45 i mikro; m</td><td>Bio-Rad</td><td>#1620115</td><td></td></tr><tr><td>Mleko suche bez tłuszczu</td><td>Sanalac</td><td>1570000180</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniCzysty kozi anty-szczurzy IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-035-003</td><td>Przygotowane zgodnie z zaleceniami i użyte w rozcieńczeniu 1:100 000.</td></tr><tr><td>Polisorbat (Tween) 20</td><td>Bioreagenty Fishera</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Nauki o Życiu</td><td>K793-500ML</td><td>Można przybliżyć to z 0,5% kwasu Ponceau S, 1% kwasu octowego</td></tr><tr><td>Zasilacz PowerPac Basic</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>PR1MA Zmienna prędkość 2D</td><td>MidSci</td><td>R2D-30</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka standardów podwójnych kolorów Precision Plus Protein</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610374</td><td>Można użyć dowolnej drabiny białkowej.</td></tr><tr><td>Papier filtrujący do chromatografii celulozy, 0,35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-4</td><td></td></tr><tr><td>Przywrócenie bufora demontażowego Western Blot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#21059</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S640-10</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik magazynowy 300 mL</td><td>Rosti Mepal</td><td>RST46608</td><td>Do blokowania błony nitrocelulozy, inkubacji przeciwciał i płukania</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto – podłoże o maksymalnej czułości</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#34094</td><td>Wzmocnione podłoże chemiluminescencyjne (ECL) zawierające dwa składniki: luminol i wzmacniacz. Ten odczynnik ECL ma niską czułość na femtogram.</td></tr><tr><td>Podłoże chemiluminescencyjne SuperSignal West Pico PLUS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#34580</td><td>Wzmocnione podłoże chemiluminescencyjne (ECL) zawierające dwa składniki: luminol i wzmacniacz. Ten odczynnik ECL ma czułość pikogramu na femtogram.</td></tr><tr><td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4&ndash; 12%, 10 dołków żeli poliakrylamidowych</td><td>GenScript</td><td>M00652</td><td></td></tr><tr><td>Proszek buforowy transferowy</td><td>GenScript</td><td>M00652</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>USBiologia</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-MOPS-SDS Proszek buforowy działający</td><td>GenScript</td><td>M00138</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja analizy białek z oocytów i zarodków xenopus przez immunoblotting

Optimized Analysis of Proteins from Xenopus Oocytes and Embryos by Immunoblotting

Analiza białek za pomocą elektroforezy żelu sodowego dodecylowo-siarczanowo-poliakrylamidowego (SDS-PAGE), a następnie immunoblottingu (western blotting), jest kluczowym elementem narzędzi biologa molekularnego. Technika ta rozdziela złożoną mieszaninę białek według masy cząsteczkowej, a następnie testuje obecność białek docelowych za pomocą specyficznych przeciwciał. Immunoblotting ma wiele zastosowań. Przykłady to zastosowanie jako celowane podejście do badania interaktorów białko-białko lub jako kontrola potwierdzająca ekspresję lub uszczupanie celów białkowych. Jednak skuteczne wykonanie immunoblottingu wymaga skomplikowanych, wieloetapowych eksperymentów. Protokoły muszą być zoptymalizowane pod kątem każdego organizmu, docelowego białka i zastosowania. W związku z tym istnieją luki w wiedzy dotyczącej stosowania immunoblitu w wielu modelach, w tym w modelu żaby Xenopus laevis.
Ze względu na ich duże rozmiary, obfitość materiału do eksperymentów biochemicznych oraz łatwe obsługi, oocyty i zarodki X. laevis okazały się kluczowe dla badania zasad kontroli translacyjnej. Jednak ten gatunek nie posiada specyficznych protokołów dotyczących solidnego i rutynowego immunolottingu. Tutaj oferujemy szczegółowy protokół western blotting, zoptymalizowany pod kątem próbek z różnych etapów rozwojowych Xenopus . Następnie analizujemy regulatory translacyjne na różnych etapach rozwoju.

Aby wykazać skuteczność naszego protokołu immunoblotingu, przeanalizowaliśmy białka translacyjne oznaczone tagowaniem powinowactwa i endogenne w trzech typach próbek X. laevis: oocytach stadium VI, zarodkach stadium 7 (blastula) oraz zarodkach stadium 10,5 (gastrapa). Te etapy zostały wybrane, ponieważ obejmują przejście środkowe blastuli (stadium 8.5), które oznacza początek solidnej transkrypcji zygotycznej13,14. Ponieważ rozwój przed przejściem w środkową blastulę odbywa się bez transkrypcji, zarodki przedzygotyczne (czyli kontrolowane przez matkę) w dużej mierze polegają na mechanizmach kontroli translacyjnej, aby wyrazić białka losu komórkowe z prawidłową rozdzielczością czasową i przestrzenną15. Dlatego przejście środkowe blastuli jest kluczowym kontekstem do badania interakcji RNA-białko.
Aby analizować ekspresję białek za pomocą immunoblottingu, do oocytów i embrionów X. laevis wstrzyknięto 500 pg mRNA kodującego C-końcową połowę X. laevis Bicaudal-C (Bicc1), połączoną z 3x znakami powinowactwa hemaglutyniny (HA). Wybraliśmy analizę Bicc1 ze względu na jego znaczenie dla biologii Xenopus oraz interakcji białko-RNA. Bicc1 to białko wiążące mRNA oraz translacyjny represor, które kieruje decyzjami o losie komórek we wczesnym zarodku 16,17,18. W późniejszym etapie rozwoju wpływa na wzorce lewo-prawe19, 20, 21 oraz na funkcjonowanie narządów, w tym nerek22, 23, 24, 25. Bicc1 zawiera obszar, który kieruje domenami translacyjnej represji5 oraz hnRNP K (KH), które pośredniczą w wiązaniu z konkretnymi mRNA 5,26,27,28.
Ekstrakty przygotowano z pięciu oocytów lub zarodków wstrzykniętych HA-Bicc1, wraz z odpowiadającymi im niewstrzykniętymi próbkami jako kontrolą negatywną. Jedna dziesiąta każdego ekstraktu była elektroforowana na żelu bis-tris o gradientzie 4-12% i przenoszona na mokrą powierzchnię na membranę nitrocelulozową. Barwienie błony Ponceau w celu wykrycia całkowitego białka potwierdziło sukces transferu (Rysunek 3A). W ramach naszych badań wygenerowaliśmy przeciwciało u królików, które rozpoznaje C-terminalną połowę ludzkiego białka Bicc1. To przeciwciało zostało użyte do wykrywania endogennego i egzogennego białka Xl-Bicc1 (Rysunek 3B). Wcześniejsze badania wykazały, że białko Bicc1 jest nieobecne w oocytach X. laevis , ale jest eksprymowane w embrionach sprzed MBT, zanim genom zygoty zostanie aktywny16. Sugeruje to, że choć mRNA Bicc1 gromadzi się podczas oogenezy, jest translacyjnie represyjne. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, endogenny Bicc1 nie został wykryty w oocytach. Dla porównania, przeciwciało rozpoznało endogenny Bicc1 (~MW 107 kDa) zarówno w stadium 7, jak i 10,5 zarodków. Łącznie te wyniki potwierdzają, że przeciwciało rozpoznaje endogenne białko Bicc1 (Rysunek 3B, górny panel, czerwona strzałka). Przeciwciało Bicc1 rozpoznało mniejsze białko o masie około 70 kDa w ekstraktach przygotowanych z próbek wstrzykniętych przez mRNA (Rysunek 3B, górny panel, grot strzały, porównaj tory 2, 4 i 6 z torami 1, 3 i 5). W celu kontroli specyficzności przeciwciała Bicc1, błona została usunięta i ponownie zbadana przeciwciałem przeciwko tagowi powinowactwa HA. Przeciwciało HA zidentyfikowało białko 70 kDa w wstrzykniętych próbkach, ale nie rozpoznało endogennego Bicc1 (Rysunek 3B, drugi panel, strzałka). Wykrywanie wyciągu C-term HA-Bicc1 różni się w zależności od etapów ze względu na różnice w ekspresji białek w porównaniu z wstrzykniętym mRNA w różnych typach komórek.
Następnie rozszerzyliśmy wyniki, testując ekspresję endogennych białek translacyjnych regulujących oddziałujące z Bicc1. Najpierw przeanalizowaliśmy ekspresję podjednostki Ccr4-Not Transcription Complex Subunit 1 (Cnot1), dużej białki rusztowania i części kompleksu Ccr4-Not deadenylazy (CNOT). Wielojednostkowy kompleks CNOT jest jedną z głównych eukariotycznych deadenylaz i jest przede wszystkim znany z przycinania ogona poli(A) na końcu mRNA posłańca jako wstęp do ich degradacji. Jednak ten kompleks pełni różnorodne role w kontroli translacyjnej, wykraczające poza deadenylację29. Byliśmy zainteresowani badaniem ekspresji Cnot1 ze względu na znaczenie kompleksu CNOT dla regulacji mRNA oraz wcześniejsze obserwacje, że Cnot1 oddziałuje z Bicc120,30. Do analizy ekspresji węzła 1 użyliśmy przeciwciała rozpoznającego endogenne białko węzła 1. Zidentyfikowano dwa białka o masach 250 kDa i 270 kDa w każdej próbce, co odpowiada przewidywanemu rozmiarowi węzła Cnot1 (Rysunek 3B, trzeci panel). Dzięki temu protokół pozwala nam łatwo zidentyfikować kluczowy komponent kompleksu regulacyjnego. Ponadto dane te wspierają zdolność protokołu do skutecznej identyfikacji białek o wysokiej masie cząsteczkowej.
Aby dodatkowo przetestować uogólnialność tych wyników, następnie przeanalizowaliśmy próbki pod kątem obecności wyraźnej helikazy DEAD-box zaangażowanej w represję translacyjną, helikazy DEAD-box 6 (Ddx6, wcześniej znanej jako xp54 u Xenopus i me31b u Drosophila). Ddx6 jest ważnym składnikiem granulek rybonukleoprotein, bierze udział w magazynowaniu mRNA i oddziałuje z Bicc1 oraz Cnot1 6,31,32. Przeciwciało rozpoznające endogenne Ddx6 zidentyfikowało białko o masie około 54 kDa w każdej próbce (Rysunek 3B, czwarty panel). Ekspresja była zmniejszona w zarodkach zygotycznych (Rysunek 3B, porównaj tory 5 i 6 do 1-4), jak wcześniej zgłoszono33.
Na koniec, aby upewnić się, że różnice obserwowane między próbkami wynikają z różnic w ekspresji, posunęliśmy i ponownie zbadaliśmy immunoblot za pomocą przeciwciała rozpoznającego enzym gliceraldehydu 3-fosforanu dehydrogenazy (Gapdh). Gapdh pełni rolę powszechnie wyrażanej "kontroli obciążenia". Równoważne poziomy ekspresji Gapdh potwierdzają barwienie Ponceau: równa ilość całkowitego białka jest analizowana w różnych próbkach (Rysunek 3B, piąty panel).
Razem te wyniki potwierdzają skuteczność tej metody immunoblokowej. Udało nam się zidentyfikować egzogenne i endogenne Bicc1 w wielu etapach rozwojowych X. laevis istotnych dla badania interakcji RNA-białko: oocytach i zarodkach pre-MBT, które zawierają jedynie mRNA zdeponowane przez matkę, oraz zarodkach po MBT, które również zawierają zygotalnie transkrybowane mRNA. Udało nam się uogólnić te wyniki, analizując ekspresję wielu białek translacyjnych kontrolnych o różnych masach cząsteczkowych (Bicc1, Cnot1 i Ddx6) oraz kontroli obciążenia (Gapdh). Pokazujemy również, że protokół ten może być stosowany w przypadku zarodków X. tropicalis z modyfikacją, aby zwiększyć ilość materiału użytego do uwzględnienia ich mniejszych rozmiarów (Rysunek uzupełniający 1).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69139/69139fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Identyfikacja poziomów translacyjnych białek regulacyjnych za pomocą immunoblottingu u X. laevis. (A) Barwienie Ponceaua immunoblotu w celu identyfikacji całkowitego białka z oocytów X. laevis stadium VI, zarodków stadium 7 oraz zarodków 10,5. Każda ścieżka stanowi 10% białka przygotowanego z ekstraktu (0,5 oocytu lub zarodka). (B) Analiza immunoblot wybranych translacyjnych białek regulacyjnych X. laevis w oocytach stadium VI, zarodkach stadium 7 oraz zarodkach stadium 10,5. Ścieżki 2, 4 i 6 odpowiadają próbkom mikrowstrzykniętym mRNA HA-Bicc1 przed analizą, natomiast ścieżki 1, 3 i 5 pełnią funkcję negatywnych (niewstrzykniętych) kontroli. Przeciwciało α-Bicc1 zostało użyte do testowania ekspresji endogennego Bicc1 na różnych etapach (górny panel). Następnie blot został usunięty i ponownie zbadany za pomocą przeciwciała do tagu powinowactwa HA jako kontroli specyficzności przeciwciał α-Bicc1 (drugi panel). Bloty zostały usunięte i ponownie zbadane pod kątem dodatkowych białek regulacyjnych przy użyciu α-Cnot1 (trzeci panel) oraz α-Ddx6 (czwarty panel). α-Gapdh (dolny panel) służył jako kontrola równomiernego obciążenia białkiem. Czerwone grotki strzałek oznaczają lokalizację endogennego Bicc1, natomiast czarne groty strzałek wskazują na egzogennie wyrażany C-term HA-Bicc1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/69139fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Ilustracja uzupełniająca 1: Analiza immunoblowa białka Bicc1 u Xenopus laevis w porównaniu do Xenopus tropicalis. Przeciwciało α-Bicc1 zostało użyte do testowania ekspresji endogennego i egzogennego Bicc1 w różnych ilościach X. laevis i ekstraktu zarodka X. tropicalis . Pas 1: 0,5 niezastrzykniętego zarodka X. laevis . Pas 2: 0,5 HA-Bicc1 wstrzyknięte zarodku X. laevis . Pas 3: 3 niezastrzyknięte zarodki X. tropicalis . Pas 4: 1 niezastrzyknięty zarodek X. tropicalis . Pas 5: 0,5 niezastrzykniętego zarodka X. tropicalis . Zastosowano dwa przeciwciała rozpoznające endogenny Bicc1: jedno podniesione przeciwko ludzkiemu Bicc1 (górny panel), a drugie przeciwko X. laevis Bicc1 (panel środkowy). α-Gapdh (dolny panel) był używany do kontroli równomiernego obciążenia białkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł opisuje protokół analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus za pomocą immunoblottingu. Opisane są etapy pobierania, po których następują kroki odpowiadające przetwarzaniu próbek, SDS-PAGE, transferowi, barwieniu przeciwciał oraz obrazowaniu. Protokół kładzie nacisk na badanie translacyjnych kompleksów białek regulacyjnych z endogennymi przeciwciałami oraz przeciwciał przeciwko znacznikom powinowactwa białkowego.

Optymalizacja analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus przez immunoblotting

Analysis of proteins by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by immunoblotting (western blotting) is a vital ...

W ciągu życia zwierzęcia decyzje dotyczące siarczanów podejmowane są nieustannie, co pozwala na prawidłowy rozwój i zdrowie organizmu dorosłego. Decyzje te zależą od konkretnych białek przypisanych regulatorom siarczanów. Celem naszych badań jest znalezienie mechanizmów kontrolujących syntezę tych kluczowych regulatorów.Oprócz szczegółowego zarysu immunoblottingu oraz oocytów i embrionów Xenopus, nasz protokół daje wgląd w wyzwania typowe dla tego organizmu modelowego, takie jak pozyskiwanie przeciwciał. Dzięki dogłębnym badaniom mechanizmów wiązania i represji w Bicaudal C nasze badania pomogły stworzyć podstawę informacji umożliwiającą porównanie innych regulatorów translacji. Aby rozpocząć przetwarzanie komórek do immunoblotowania, dodaj 10 mikrolitrów buforu do lizy komórek schłodzonych, rozcieńczonego do jednokrotnego stężenia podwójnie dejonizowaną wodą na zarodek lub oocyt.Używając mikrotłuczka, ujednolic próbki na lodzie. Umieść probówki w wirówce stołowej i obracaj próbki w temperaturze 5 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, aby rozpylić zanieczyszczenia, w tym żółtko i nierozpuszczalne pigmenty. Przenieś supernatant do czystej rurki o pojemności 1,5 mililitra, zapewniając, że podczas transferu nie zostanie naruszona pellet.Do zebranego supernatantu dodaj równą objętość dwukrotnego buforu próbki Laemmli, uzupełnioną o 5% wagi objętościowej 2-merkaptoetanolu. Podgrzej mieszankę w temperaturze 95 do 100 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby denaturować białka. Teraz wyjmij prefabrykowany żel SDS o zawartości 4 do 12% bis-tris z opakowania i zdejmij naklejkę z dołu żelu.Wkładaj żel do zespołu elektrod naprzeciwko zapory buforowej i umieszczaj cały zespół w pionowym zbiorniku elektroforetycznym. Następnie wypełnij zarówno elektrodę, jak i dno zbiornika buforem Tris-MOPS-SDS. Delikatnie wyjmij grzebień żelowy i pipetę prowadząc bufor do dołków, aby usunąć pęcherzyki i wyrównać bufor.Teraz załaduj pięć mikrolitrów wcześniej barwionych standardów białkowych do pierwszego dołku i 10 mikrolitrów każdej przygotowanej próbki do pozostałych dołków. Załóż pokrywę na zbiornik elektroforezy i podłącz go do zasilania. Następnie ustaw napięcie na 200 woltów, aby rozpocząć elektroforezę.Elektroforeza zatrzymać, gdy przód barwnika próbki-buforu opuści żel. Przed zakończeniem elektroforezy zacznij składać kanapkę transferową w klipsie. Napełnij szklaną naczynkę do pieczenia schłodzonym buforem transferowym i zanurz wszystkie materiały transferowe w tym buforze podczas montażu.Włóż klips transferowy do miseczki, z czarną połową opartą o dno, białą połową skierowaną do góry, a klipsem otwartym w lewo. Połóż jedną lub dwie gąbki z włókna płasko na czarnej połowie klipsa transferowego. Po wycięciu dwóch kawałków papieru chromatograficznego o średnicy 0,35 milimetra na odpowiedni rozmiar, połóż jeden na gąbkach.Po zakończeniu elektroforezy usuń żel z zbiornika elektroforezy. Używając dźwigni otwierającej kasetę żelową, ostrożnie rozchyl płyty żelowe, dbając o to, aby żel pozostał przymocowany do jednej strony. Przytnij wgłębienia od góry żelu za pomocą zwalniacza.Połóż żel, który nadal jest przyklejony do jednej połowy plastikowej kasety, na papierze filtracyjnym i usuń pozostałą połowę kasety, aby żel pozostał płaski na papierze. Następnie wytnij kawałek membrany nitrocelulozowej o średnicy 0,45 mikrometra, aby dopasował go do wymiarów żelu. Usuń membranę z papieru ochronnego, krótko zwilż ją w buforze transferowym i ostrożnie umieść na żelu.Następnie połóż drugi kawałek papieru filtracyjnego na membranę nitrocelulozową. Używając rolki, delikatnie, ale stanowczo wyciskaj wszystkie pęcherzyki powietrza. Ułóż jedną lub dwie dodatkowe gąbki z włókna na papierze filtracyjnym, aby dokończyć kanapkę.Zamknij kasetę transferową i mocno ją przypięj, aby uszczelnić złożoną kanapkę. Następnie włóż zamkniętą kanapkę transferową do rdzenia transferowego z klipsem skierowanym do góry i upewnij się, że strona klipsa jest skierowana do czarnej strony rdzenia. Włóż rdzeń transferowy do zbiornika elektroforezy.Dodaj do zbiornika okład z lodem i batonik mieszanki, aby batonik mógł swobodnie się obracać. Napełnij zbiornik schłodzonym buforem transferowym, aż urządzenie będzie całkowicie zanurzone, i zabezpiecz pokrywę na wierzchu. Podłącz urządzenie do zasilacza, dopasuj kolory elektrod i ustaw warunki na 100 woltów przez godzinę, obracając się barkiem mieszającego.Po zakończeniu transferu ostrożnie otwórz kasetę i rozłóż kanapkę. Usuń błonę nitrocelulozową i zaznacz stronę, która miała kontakt z żelem. Następnie umieść membranę nitrocelulozową w małym pojemniku, tak aby leżała płasko na dnie.Całkowicie pokryj membranę bejcą Ponceau i delikatnie kołysz na buźce przez 5 do 10 minut. Po wylaniu barwnika Ponceau spłucz membranę kilkakrotnie wodą podwójnie dejonizowaną, aż nadmiar barwy zostanie usunięty i w pasach pojawią się pasma białkowe. Następnie wykonaj blokowanie błon, inkubację przeciwciał oraz płukanie, zgodnie z pokazaniem.Po zakończeniu inkubacji i płukania przeciwciał wtórnych, błona jest gotowa do obrazowania. W ciemnym pomieszczeniu włącz wywoływacz i pozwól mu się rozgrzać. Wytnij dwa kwadraty folii foliowej na tyle dużej, by całkowicie zakryć membranę.Za pomocą kleszczy umieść membranę nitrocelulozową do góry na pierwszym kwacie folii spożywczej. W probówce o pojemności 1,5 mililitra wymieszaj równe ilości luminolu z wzmocnioną chemiluminescencją oraz odczynników wzmacniających. Następnie użyj około jednego mililitra tej mieszaniny, aby pokryć większość błon.Używając folii plastikowej, delikatnie manipuluj membraną, aby cała powierzchnia była równomiernie pokryta i inkubuj przez minutę. Następnie usuń nadmiar odczynnika ECL, chwytając membranę kleszczami i lekko strząśnij płyn. Umieść membranę twarzą do góry na drugim kwacie folii plastikowej, luźno ją złóż na membranę i mocno przyklej taśmą do kasety do autoradiografii.Następnie zrób zdjęcie błony za pomocą filmu radiograficznego w ciemnym pomieszczeniu, wykonując poniesione kroki. Po uzyskaniu pożądanej wizualizacji białka wyrównaj wywołaną warstwę z markerami świecącymi w ciemności i użyj ich jako przewodnika do oznaczenia pozycji wcześniej barwionych standardów białka na warstwie. Po zakończeniu obrazowania ostrożnie wyjmij membranę z folii plastikowej i zanurz ją w TBSTW, aby zmyć pozostałości odczynnika ECL.Barwienie błony metodą Ponceau potwierdziło pomyślny transfer białka. Endogenne białko B1 nie zostało wykryte w próbkach oocytów, ale wyraźnie wykryto je w próbkach zarodków w stadium siódmym i dziesiątym i 10,5 o masie około 107 kilodaltonów. W próbkach wstrzykiwanych we wszystkich stadiach z użyciem przeciwciała Bicc1 wykryto mniejsze pasmo białka o długości 70 kilodaltonów, co wskazuje na skuteczną ekspresję fuzji C-terminalnej HA-Bicc1.Przeciwciało HA wykrywało ten sam pas 70-kilodaltonowy tylko w wstrzykniętych próbkach, co potwierdza specyficzność przeciwciała Bicc1 dla białka fuzji. Dwa pasma o masie cząsteczkowej, około 250 i 270 kilodaltonów, wykryto we wszystkich próbkach z użyciem przeciwciała CNOT1. Ekspresja białka DDX6 o stężeniu 54 kilodalton została wykryta we wszystkich próbkach, ale widocznie zmniejszona w zarodkach stadium 10,5.

optimized-analysis-proteins-from-xenopus-oocytes-embryos

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Immunoblotting (western blotting) to szybka i czuła metoda detekcji i charakterystyki białek, która wykorzystuje specyficzność rozpoznawania antygen-przeciwciało. Niniejsze wideo przedstawia protokoły rozdziału białek, transferu białek na membrany, immunodetekcji oraz wizualizacji z wykorzystaniem substratów chromogennych lub chemiluminescencyjnych.

Analiza immunoblottingowa

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Poznaj protokół immunoblottingu do analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus. Metoda obejmuje lizę komórek, SDS-PAGE, transfer na membranę i detekcję przeciwciałami.

Optymalizacja analizy białek z oocytów i zarodków Xenopus przez immunoblotting

Przeglądaj więcej filmów