Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii
March 13th, 2026
Przedstawiamy tutaj protokół analizy pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) za pomocą bezoznakowanego, powierzchniowego spektroskopii Ramana (SERS), umożliwiającej minimalnie inwazyjną diagnostykę chorób i ocenę sEV jako środków dostarczania terapii.
Wykorzystujemy powierzchniowe rozpraszanie Ramana w połączeniu z uczeniem maszynowym do wczesnej diagnostyki raka, a także dostarczamy aplikacje biomedyczne. Kluczowym wyzwaniem eksperymentalnym jest wrodzona heterogeniczność próbek egzosomów, czyli wysoce złożonych, wysokowymiarowych danych spektroskopowych, która dodatkowo potęguje niski stosunek sygnału do szumu. Na początek pipetuj około pięciu mikrolitrów małej próbki pęcherzyka zewnątrzkomórkowego na wyznaczony substrat plazmoniczny.
Włóż podłoże do osuszacza, aby kropla całkowicie wyschła przez około 15 minut. Następnie przenosi wysuszone podłoże do konfokalnego mikroskopu Ramana. Korzystając z oprogramowania instrumentalnego WiRE w wersji 4.4, rozpocznij zbieranie danych.
Ustaw laser wzbudzający na 785 nanometrów przy mocy pięciu miliwatów i skalibruj system. Aby uzyskać widma ze złotego podłoża, wykonaj skan rozpoznawczy na obszarze 300 na 300 mikrometrów, aby zlokalizować pojedyncze pęcherzyki w trybie statycznym o kroku 10 mikrometrów, ekspozycji 0,1 sekundy i przy 50% mocy lasera. Po zlokalizowaniu pęcherzyków wykonaj mapowanie o wysokiej rozdzielczości w trybie statycznym w siatce pięć na pięć, z użyciem kroku o krok jeden mikrometr, ekspozycję 0,2 sekundy na punkt i 50% mocy lasera.
Następnie pobierz widma z podłoża grafenowego, wykonując następujące skany. Przesiewaj początkowe surowe widma i wyklucz te, które wykazują nadmierny szum lub nieprawidłowe kształty widmowy. Zastosuj filtr Savitsk-Golay do każdego widma, aby zmniejszyć tło fluorescencyjne i wygładzić dane widmowy.
Oblicz stosunek sygnału do szumu dla każdego widma za pomocą metody szczyt do wartości bazowej lub odchylenia standardowego. Dla każdego widma oblicz stosunek sygnału do szumu jako stosunek maksymalnej intensywności po odejmowaniu linii bazowej w reprezentatywnym paśmie Ramana do odchylenia standardowego szumu. Szum oszaczaj, odejmując wygładzoną wersję widma Savitsky'ego i Golaya, używając rozmiaru okna 11 i rzędu wielomianów trzech od oryginalnego widma.
Uszereguj wszystkie widma rosnąco względem stosunku sygnału do szumu i oceń trwałość pików diagnostycznych w tych widmach, aby określić próg. Następnie ustaw próg w punkcie, w którym którykolwiek z tych szczytów znika w szum bazowy, odpowiadający stosunkowi sygnału do szumu 28. Wyklucz widma poniżej progu stosunku sygnału do szumu wynoszącego 28, aby zapewnić zachowanie tylko wysokiej jakości widm do analizy dalszej.
I normalizuj każde pozostałe widmo do maksymalnej intensywności szczytowej lub całkowitej powierzchni pod krzywą. Przypisz etykietę każdemu pomiarowi spektralnemu na podstawie jego pochodzenia, na przykład pacjenta z rakiem żołądka lub zdrowej kontroli. Wprowadź oznaczone dane spektralne do klasyfikatora wektora wsparcia z jądrem liniowym i zastosuj stratyfikowany podział tasowania dla pięciokrotnej walidacji krzyżowej, aby zapewnić zrównoważoną reprezentację w każdym fałdzie.
Teraz uśrednij metryki dokładności we wszystkich fałdach, aby ocenić ogólną wydajność modelu. Na koniec użyj analizy liniowej dyskryminacyjnej, czyli LDA, aby zmniejszyć wymiarowość powierzchniowego zestawu danych o rozpraszaniu Ramana do wizualizacji. Stosuj wytrenowany model analizy liniowej dyskryminującej do bezpośredniej klasyfikacji między grupami prób.
Widma Ramana wraz z odpowiadającymi im średnimi widmami ujawniły odrębne sygnatury molekularne dla każdego typu próbki, uzyskane z pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z tkanek, krwi i śliny. Liniowa analiza dyskryminująca wykazała wyraźne skupienie danych o pęcherzykach zewnętrznych według tkanki źródłowej, krwi lub śliny. Klasyfikacja binarna z użyciem klasyfikatora maszynowego wektora wsparcia osiąga najwyższą dokładność dla próbek tkanek na poziomie 90,1%, następnie dla krwi na poziomie 70,9%, a śliny na poziomie 60,7%. Klasyfikacja oparta na LDA wyraźnie rozdziela próbki zdrowego i raka żołądka w danych z pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z tkanki.
Podobne podziały klasyfikacji oparte na LDA dla danych z pęcherzyków zewnętrznych krwi i śliny wykazały mniej optymalnego rozdzielenia próbek zdrowych i nowotworowych. Widma Ramana pęcherzyków inkubowanych doksorubicyną bez grafenu wykazywały stałe piki w zakresie około 1 081, 1, 206 i 1 440 centymetrów odwrotnych. W przypadku grafenu zaobserwowano dodatkowy pik D o długości około 1 350 centymetrów odwrotnej oraz pik G o długości około 1 580 centymetrów odwrotnych jako standardy wewnętrzne.
Stosunek piku doksorubicyny wynoszący 442 centymetry odwrotnie do piku grafenu G wzrastał wraz z wyższym stężeniem leków i dłuższym czasem inkubacji. Ustanowiliśmy biochemiczne odciski palców pojedynczych pęcherzyków, aby wyróżnić źródła chorób, co ma potencjał do wczesnej diagnozy. Trzy kluczowe zalety naszej techniki.
Po pierwsze, jest bardzo wrażliwy. Po drugie, jest nieinwazyjny. po trzecie, nie wymaga to lizowania ani fizycznego rozkładu cząstek.
W przyszłości skorelujemy profil spektralny z profilem proteomicznym, co z kolei pomoże korelować zawartość egzomu z konkretnymi funkcjami, takimi jak komunikacja komórkowa i transport.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This protocol presents a label-free analytical platform that integrates surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) with machine learning to detect and molecularly profile individual small extracellular vesicles (sEVs). The method enables high-specificity detection and classification of disease states, such as distinguishing gastric cancer from healthy controls, and quantifies drug loading in single vesicles, supporting both diagnostic and therapeutic applications.
Key Study Components
Area of Science
- Analytical chemistry
- Biomedical diagnostics
- Nanotechnology
- Machine learning applications in biosensing
Background
- Small extracellular vesicles (sEVs) are promising biomarkers for disease diagnosis and therapeutic monitoring.
- Traditional detection methods often require labeling or lysis, which can limit sensitivity and throughput.
- SERS provides molecular fingerprinting capabilities with high sensitivity.
- Machine learning enhances the analysis of complex, high-dimensional spectral data.
Purpose of Study
- To develop a label-free, high-throughput platform for single-vesicle analysis using SERS and machine learning.
- To distinguish between healthy and disease states (e.g., gastric cancer) using sEVs from various biofluids.
- To quantify drug (doxorubicin) loading in individual sEVs for therapeutic assessment.
Methods Used
- Isolation of sEVs via size exclusion chromatography or ultracentrifugation.
- Deposition of sEVs onto engineered plasmonic gold nanopyramid 2D array substrates.
- SERS data acquisition using a confocal Raman microscope with specific laser settings and mapping protocols.
- Preprocessing of spectra (noise filtering, normalization, signal-to-noise thresholding).
- Machine learning analysis using support vector classifiers (SVC) and linear discriminant analysis (LDA) for classification and visualization.
- Use of graphene-coated substrates as internal standards for drug quantification.
Main Results
- Distinct molecular signatures were observed for sEVs from tissue, blood, and saliva.
- Classification accuracies for distinguishing gastric cancer from healthy controls were 90.1% (tissue), 70.9% (blood), and 60.7% (saliva).
- LDA revealed clear clustering of sEVs by source and disease state, especially for tissue-derived samples.
- Quantification of doxorubicin loading in single sEVs was achieved, with graphene peaks serving as internal standards.
Conclusions
- The platform enables sensitive, non-invasive, and label-free detection of sEVs at the single-vesicle level.
- It allows for high-throughput analysis and captures population heterogeneity, aiding early disease detection.
- The method supports both diagnostic and therapeutic applications, including drug loading assessment.
