Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Złożona natura pojazdów elektrycznych sprawia, że trudno jest rozpoznać subpopulację będącą przedmiotem zainteresowania, a ten protokół może wykryć je na podstawie ich fenotypu, profilu wielkości i właściwości nanomechanicznych. Ta kombinacja techniki jest metodą bezznacznikową, która pozwala nam wykrywać EV w czasie rzeczywistym na podstawie pożywki stanowej i osocza krwi. Technika ta umożliwia dogłębne scharakteryzowanie podzbioru nanocząstek będących przedmiotem zainteresowania, w celu wykorzystania ich jako bioindykatorów patologii lub również wykorzystania jako nanocząstki do dostarczania leków.

Ponieważ jest to bardzo czuła metoda, konieczne jest zwrócenie uwagi na przygotowanie biochipa przed wstrzyknięciem interesującej Cię próbki. Po pokryciu i funkcjonalizacji chipów należy inkubować biochip w mieszaninie 200-milimolowego dimetyloaminopropylokarbodiiimidu/N-hydroksysukcynimidu etylu i N-hydroksysukcynimidu o stężeniu 50 milimoli na litr przez co najmniej 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Za pomocą spottera dodaj 300 nanolitrów roztworu liganda i inkubuj biochip pod kąpielą soniczną przez 30 minut.

Umyj biochip od góry ultraczystą wodą. Dodaj kroplę oleju o tym samym współczynniku załamania światła co pryzmat, aby utworzyć jednolitą cienką warstwę między biochipem a pryzmatem i delikatnie umieść ją na pryzmacie o tym samym współczynniku załamania światła co biochip. W przypadku obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego należy zamontować biochip w systemie SPRi.

Przejdź do menu rozwijanego po lewej stronie oprogramowania i kliknij Katalog roboczy. Znajdź obraz, na którym widoczne są różne miejsca, i kliknij, aby wybrać ten obraz. Następnie wpisz nazwę rodzin ligandów i kliknij definicję gatunku końcowego.

Przeciągnij czarną linię kursorem do optymalnego kąta roboczego. Kliknij Przesuń lustro do kąta roboczego i wybierz kąt roboczy. Teraz kliknij Kinetyka.

Gdy oprogramowanie poprosi użytkownika o zdefiniowanie kontroli ujemnej, wybierz w tym momencie opcję Brak kontroli ujemnej. Wstrzyknij albuminę surowicy szczura w ilości 50 mikrolitrów na minutę przez cztery minuty. Wstrzykiwać etanoloaminę w ilości 20 mikrolitrów na minutę przez 10 minut, aby dezaktywować grupy karboksylowe nadal obecne i reaktywne na powierzchni.

Następnie umyj biochip, wstrzykując 40 milimolowy OG w ilości 50 mikrolitrów na minutę przez cztery minuty. Wstrzyknij pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w określonym stężeniu na biofunkcjonalizowany chip, jednocześnie śledząc kinetykę interakcji pęcherzyków w różnych miejscach. Określ również wartość współczynnika odbicia i poziom interakcji.

Po ustabilizowaniu wstrzyknij aldehyd glutarowy na chip, aby utrwalić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w miejscu, w którym się znajdują, przed wykonaniem obrazowania AFM. Dopasuj biochip do górnej części maski na szklanym szkiełku. Użyj kamery CCD na górze AFM, aby zlokalizować wspornik we właściwym miejscu, które należy zeskanować.

Rozpocznij akwizycję AFM w trybie kontaktowym od trzech do pięciu dużych i małych obszarów. Następnie potraktuj obrazy AFM za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych JPK, wybierając najpierw kanał wysokości. Wybierz pasowanie wielomianowe, które ma zostać odjęte od każdej linii, aby uzyskać wyprostowane linie skanowania.

Wybierz próg wysokości na ziarnach złota, aby wyeliminować chropowatość powierzchni. Moduł ekstrakcji ziarna oznacza ziarna za pomocą progu wysokości 8,5 nanometra. Multipleksowane biochipy analizowano po pasywacji albuminy.

Układ bez wartości domyślnej. Chip z pewnymi wadami, spowodowanymi fuzją plam, słabym szczepieniem, pęcherzykami lub zanieczyszczeniami. Pokazano też nagi złoty chip bez mikroukładów do badania adsorpcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na złocie.

Eksperyment z wychwytywaniem na multipleksowanym biochipie wykazał dobre sygnały odbicia dla różnych ligandów i dobry stosunek sygnału do szumu dla różnych ligandów, ponieważ odpowiedź kontroli negatywnej była znikoma. Adsorpcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych po wstrzyknięciu próbki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wykazywała sygnał o wysokim współczynniku odbicia, co sugeruje, że pęcherzyki te były w stanie adsorbować się i pozostawać stabilne na złotym chipie. Po załadowaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wygenerowano wielkoskalowe i małoskalowe obrazy AFM pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na biochipach.

Bliższe spojrzenie w wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiary pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Efektywna średnica pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na biochipie wahała się od 30 do 300 nanometrów, przy czym zdecydowana większość wynosiła około 60 nanometrów. Wyniki uzyskane w powietrzu i cieczy były porównywalne.

Widmo Ramana pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zaadsorbowanych na nieosłoniętym chipie ujawniło wyraźne spektrum, z pikami odpowiadającymi głównie drganiom metylenu, które są związane z lipidami błon pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Ważne jest, aby rygorystycznie przygotować biochip, aby móc wykrywać pojazdy elektryczne dokładnie i w powtarzalny sposób. Konwencjonalne metody, takie jak Western blotting i analiza śledzenia nanocząstek, mogą być stosowane w celu skorelowania i potwierdzenia fenotypów i wzorców wielkości.

Co więcej, przewiduje się, że analizy multiomiczne jeszcze bardziej zagłębią się w charakterystykę molekularną EV i potencjalną dyskryminację podzbiorów.