Name: Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj wieloparametryczną platformę analityczną do charakteryzacji podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem obrazowania rezonansu plazmonowego. Metoda bezetykietowa umożliwia wykrywanie EV w czasie rzeczywistym z osocza krwi i mediów warunkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kelly Aubertin i Fabien Picot z głównego ośrodka IVETh (Paryż) są uznani za uczestników eksperymentów z obrazowaniem ramanowskim. Thierry Burnouf (Uniwersytet Medyczny w Tajpej, Tajwan) i Zuzana Krupova (z Helincourt, Francja) zostali uznani za dostarczycieli próbek EV pochodzących odpowiednio z próbek krwi płytkowej i mleka krowiego. Prace były wspierane przez region Bourgogne Franche-Comté oraz szkołę podyplomową EUR EIPHI (projekt NOWICJUSZ, 2021-2024). Część tych prac została wykonana przy użyciu platformy CLIPP oraz w pomieszczeniach czystych RENATECH w FEMTO-ENGINEERING, za co dziękujemy Rabah Zeggari.

<ol><li>Silva, A. K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+extracellular+vesicle-based+medicinal+products%3A+A+position+paper+of+the+group+%26%2334%3BExtracellular+Vesicle+translatiOn+to+clinicaL+perspectiVEs+-+EVOLVE+France%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group &#34;Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France&#34;.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).</li>
<li>Xunian, Z., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes.</a> Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).</li>
<li>Hartjes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization%3A+Common+methods+and+emerging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7(2019).</li>
<li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+extracellular+vesicles+as+emerging+theranostic+nanoplatforms%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms.</a> Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506(2020).</li>
<li>Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+single+extracellular+vesicles+for+biomedical+applications+with+especial+emphasis+on+cancer+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations.</a> Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604(2022).</li>
<li>Boireau, W., Elie-Caille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Definition%2C+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Medecine+Sciences%3A+M%2FS%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization.</a> Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).</li>
<li>Brisson, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+activated+platelets%3A+A+semiquantitative+cryo-electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study.</a> Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).</li>
<li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+A+novel+approach+to+the+detection+of+nanosized+blood+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).</li>
<li>Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensional+characterization+of+extracellular+vesicles+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy.</a> Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006(2017).</li>
<li>Beekman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-capture+of+extracellular+vesicles+for+individual+multi-modal+characterization+using+AFM%2C+SEM+and+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy.</a> Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).</li>
<li>Malenica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+microscopy+methods+for+morphology+characterisation+of+extracellular+vesicles+from+human+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids.</a> Biomedicines. 9 (6), 603(2021).</li>
<li>Verweij, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+imaging+to+understand+extracellular+vesicle+biology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo.</a> Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+A+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBioAnalytical+characterization+of+extracellular+vesicles+in+75-nm+nanofiltered+human+plasma+for+transfusion%3A+A+tool+to+improve+transfusion+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977(2019).</li>
<li>Obeid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+NanoBioAnalytical+platform+for+%C2%ABon-chip%C2%BB+qualification+and+quantification+of+platelet-derived+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles.</a> Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).</li>
<li>Ridolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+high-throughput+nanomechanical+screening+of+single+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).</li>
<li>Vorselen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+membrane+determines+mechanics+of+erythrocyte+extracellular+vesicles+and+is+softened+in+hereditary+spherocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4960(2018).</li>
<li>Hardij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+tissue+factor+bearing+extracellular+vesicles+with+AFM%3A+Comparison+of+air-tapping-mode+AFM+and+liquid+Peak+Force+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045(2013).</li>
<li>Jorgensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicle+%28EV%29+Array%3A+Microarray+capturing+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+multiplexed+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920(2013).</li>
<li>Remy-Martin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+imaging+in+arrays+coupled+with+mass+spectrometry+%28SUPRA-MS%29%3A+Proof+of+concept+of+on-chip+characterization+of+a+potential+breast+cancer+marker+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).</li>
<li>Czamara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+of+lipids%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy of lipids: A review.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Penders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+automated+Raman+trapping+analysis+of+breast+cancer+cell-derived+extracellular+vesicles+as+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers.</a> ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).</li>
<li>Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+correction+using+asymmetrically+reweighted+penalized+least+squares+smoothing%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing.</a> Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).</li>
<li>Daaboul, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+detection+of+exosomes+by+interferometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital detection of exosomes by interferometric imaging.</a> Scientific Reports. 6, 37246(2016).</li>
<li>Ertsgaard, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanogap+platform+for+sub-volt+dielectrophoretic+trapping+and+real-time+Raman+imaging+of+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles.</a> Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).</li>
<li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Najnowsze metody identyfikacji EV, które są najczęściej stosowane, to immunoblotting specyficzny dla białka w celu potwierdzenia pochodzenia EV, TEM w celu potwierdzenia ich struktury oraz NTA w celu ilościowego określenia ich liczby i rozkładu wielkości w objętości próbki3. Niemniej jednak duże zainteresowanie EV w badaniach (bio)medycznych oraz ograniczenia istniejących narzędzi analitycznych skłoniły społeczność naukową do opracowania nowych metod charakterystyki, dyskryminacji i kwantyfikacji ...

Rosnące zainteresowanie badaniami nad EV w diagnostyce i terapeutyce1,2,3,4,5, w połączeniu z wyzwaniami, przed którymi stoi ta dziedzina, doprowadziło do opracowania i wdrożenia szerokiej gamy podejść i technik służących do ilościowego oznaczania lub charakteryzacji tych pęcherzyków. Najpowszechniej stosowanymi metodami identyfikacji EV są specyficzne dla białek immunoblotting i proteomika w celu potwierdzenia pochodzenia EV, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) w celu potwierdzenia ich struktury oraz analiza śledzenia nanocząstek (NTA) w celu ilościowego oznaczenia ich liczby i rozkładu wielkości w objętości próbki.
Żadna z tych technik samodzielnie nie dostarcza jednak wszystkich informacji niezbędnych do charakteryzacji podtypów EV. Wrodzona heterogeniczność EV, wynikająca z różnorodności ich właściwości biochemicznych i fizycznych, utrudnia przeprowadzanie wiarygodnych i powtarzalnych analiz globalnych, szczególnie w przypadku EV zawartych w mieszaninie (próbce surowej). Dlatego też niezbędne są metody detekcji i charakteryzacji EV, zarówno indywidualne, jak i ogólne, które uzupełniałyby inne metody, będące szybszymi, lecz nieselektywnymi6.
Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości za pomocą TEM (lub cryoTEM) lub AFM pozwala na określenie morfologii i metrologii EV z rozdzielczością nanometryczną7,8,9,10,11,12. Jednak głównym ograniczeniem stosowania mikroskopii elektronowej w przypadku obiektów biologicznych, takich jak EV, jest konieczność zastosowania próżni do przeprowadzenia badania, co wymaga utrwalenia i odwodnienia próbki. Taki sposób przygotowania utrudnia przełożenie obserwowanych struktur na morfologię EV w roztworze. Aby uniknąć odwodnienia próbki, do charakterystyki EV najodpowiedniejszą techniką jest cryoTEM13. Jest ona powszechnie stosowana do określania ultrastruktury EV. Immunoznakowanie pęcherzyków za pomocą biofunkcjonalizowanych nanocząstek złota umożliwia również identyfikację specyficznych subpopulacji EV i odróżnienie ich od innych cząsteczek obecnych w złożonej próbce biologicznej. Jednak ze względu na niewielką liczbę EV analizowanych za pomocą mikroskopii elektronowej, często trudno jest przeprowadzić charakterystykę reprezentatywną dla złożonej i heterogenicznej próbki.
Aby ukazać tę heterogeniczność rozmiarów, International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) sugeruje analizę odpowiedniej liczby obrazów w szerokim polu, uzupełnionych o obrazy o mniejszej skali, aby z wysoką rozdzielczością uwidocznić pojedyncze EV14. AFM stanowi alternatywę dla metod optycznych i technik dyfrakcji elektronowej w badaniu EV. Technika ta wykorzystuje ostrą końcówkę zamocowaną na elastycznym wsporniku, która skanuje próbkę osadzoną na podłożu, linia po linii, i reguluje odległość między końcówką a obecnymi elementami poprzez pętlę sprzężenia zwrotnego. Umożliwia to charakteryzację topografii próbki oraz gromadzenie informacji morfomechanicznych15,16,17,18. EV mogą być skanowane za pomocą AFM po osadzeniu na atomowo płaskim podłożu lub po ich wychwyceniu na specyficznym podłożu funkcjonalizowanym przeciwciałami, peptydami lub aptamerami w celu charakterystyki poszczególnych subpopulacji18,19. Dzięki możliwości ilościowego określania i jednoczesnego badania struktury, biomechaniki oraz błonowej zawartości biomolekularnej EV w złożonych próbkach biologicznych bez konieczności wstępnego przygotowania, znakowania czy odwodnienia, AFM jest obecnie coraz częściej stosowany do precyzyjnej i multiparametrycznej charakterystyki EV w fizjologicznych warunkach temperatury i środowiska.
W niniejszej pracy zaproponowano metodologię wykorzystującą złoty biochip, który może zostać funkcjonalizowany (bio)chemicznie w formacie multipleksowym. Podłoże to stanowi fundament potężnej platformy analitycznej łączącej biodetekcję podzbiorów EV za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych, a po adsorpcji, szczepieniu lub immunowychwyceniu EV na chipie, AFM umożliwia metrologiczną i morfomechaniczną charakterystykę tych pęcherzyków. W połączeniu z sygnaturą Ramana podzbiorów EV uchwyconych na chipie, platforma analityczna ta pozwala na kwalifikację EV obecnych w próbkach biologicznych w sposób bezetykietowy i bez konieczności przeprowadzania etapów przedanalitycznych. Niniejsza praca wykazuje, że połączenie zaawansowanych technik, wsparte rygorystyczną metodologią przygotowania podłoża i akwizycji danych, sprawia, że analiza EV jest pogłębiona, jednoznaczna i solidna.
Zasadą proponowanego podejścia jest przygotowanie złotego podłoża, adsorpcja/szczepienie lub wychwycenie podtypów EV, a następnie ich skanowanie za pomocą AFM w celu oszacowania rozmiaru i morfologii każdego podzbioru EV. Dodatkowo, zaadsorbowane EV są analizowane za pomocą spektroskopii Ramanowskiej. Podłoże to może w rzeczywistości reprezentować trzy rodzaje interfejsów o rosnącej złożoności: gołe, funkcjonalizowane chemicznie lub mikromacierze ligandowe. Przed opisaniem poszczególnych kroków protokołu, czytelników odsyłamy do schematycznej prezentacji podejścia opartego na nanobioanalitycznej platformie (NBA) w Rysunku 1, łączącej obrazowanie rezonansu plazmonowego powierzchni (SPRi), AFM i spektroskopię.
<img alt="Schemat platformy NanoBioAnalytical z SPRi, AFM, biochipem; analiza EV za pomocą spektroskopii i profilowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Platforma NanoBioAnalytical. Podejście to łączy (A) obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego, (B) mikroskopię sił atomowych oraz (nano)spektroskopię podczerwieni/Ramana, wszystkie zintegrowane na tym samym podłożu – multipleksowym chipie złotym. Skróty: NBA = platforma NanoBioAnalytical; SPRi = obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego; AFM = mikroskopia sił atomowych; EV = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rdzeń złotego biochipu stanowi serce platformy, ponieważ wszystkie techniki charakterystyki bez użycia znaczników są przeprowadzane na tym biochipie. W zależności od potrzeb charakterystyki EV (zarówno całkowitej populacji EV, jak i ich podzbiorów) oraz ograniczeń i wymagań stosowanych metod, opracowano trzy rodzaje powierzchni złotego biochipu: „nagą”, chemicznie funkcjonalizowaną „C11/C16” lub biofunkcjonalizowaną ligandem, zwaną powierzchnią złotą „ligand”.
The goły biochip, nazywany „odsłoniętyumożliwia prostą adsorpcję pęcherzyków zewydzielniczych (EV) na złocie. Możliwe jest dobranie odpowiedniego buforu i przeprowadzenie tej adsorpcji w sposób pasywny (etapy inkubacji, a następnie płukania) lub monitorowanie jej w przepływie (w SPRi). Ponadto pasywną adsorpcję można przeprowadzić na całym chipie (jako makromacierz) lub zlokalizować w mikromacierzach przy użyciu mikropipetowego aplikatora. „Procedura w przepływie” pozwala badaczom na śledzenie kinetyki oraz poziomu adsorpcji EV. Podejście to, z wykorzystaniem gołego podłoża złota, stosuje się w sytuacjach, gdy interfejs warstwy chemicznej mógłby zakłócać metodę analityczną (np. w spektroskopii Ramana).
Chemicznie funkcjonalizowany biochip, nazywany „C11/C16”, służy do tworzenia gętego i stabilnego „dywanu” EV kowalencyjnie związanych z powierzchnią złota poprzez tworzenie pierwotnych wiązań amidowych z tiolami, gdy celem jest uzyskanie globalnego obrazu próbki EV. W tym przypadku złoto jest funkcjonalizowane mieszaniną tioli: merkapto-1-undekanolu (11-MUOH: „C11”) oraz kwasu merkapto-1-heksadekanowego (16-MHA: „C16”), a część tioli jest aktywowana chemicznie w celu ustanowienia wiązania kowalencyjnego z celami. Strategia ta może być realizowanay zarówno pasywnie (kroki inkubacji, a następnie płukania, albo w formie „macroarray”, albo w wielu mikrotablicach z użyciem mikrodozownika), jak i w warunkach przepływu (w SPRi), aby śledzić kinetykę i stopień szczepienia EV na powierzchni złota.
Kiedyś/Ten/Ta/To (proszę podać pełny tekst do przetłumaczenia) biochip biofunkcjonalizowany ligandem, nazywany "ligandyjest chemicznie aktywowany w celu kowalencyjnego szczepienia różnych ligandów (np. przeciwciał, receptorów), aby selektywnie wychwytywać (z powinowactwem) różne podgrupy EV współistniejące w próbce biologicznej.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało CD41a</td><td>Diaclone SAS (Francja)</td><td>447528</td><td></td></tr><tr><td>CP920</td><td>Microparticles GmbH, Niemcy</td><td>448303</td><td></td></tr><tr><td>DXR3xi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma</td><td>A6272</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Evs pochodzące z koncentratów płytek krwi</td><td>Współpraca : Pr T. Burnouf (TMU, Tajpej)</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Evs z mleka krowiego</td><td>Współpraca : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - Francja)</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma</td><td>56845</td><td></td></tr><tr><td>Gwyddion&nbsp;</td><td></td><td>853.223.020</td><td></td></tr><tr><td>Napylanie magnetronowe</td><td>PLASSYS</td><td>SAB5300165</td><td></td></tr><tr><td>kwas merkapto-1-heksadekanowy</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Merkapto-1-undekanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>Góry SPIP Te</td><td>Digital Surf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoWizard 3 Bioscience&nbsp;</td><td>Bruker-JPK&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukozyd oktylowy (OG)&nbsp;</td><td>Przeciwciało przeciwko Sigmie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumine</td><td>Bufor fosforanowy Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Surowica</td> albuminy Sigma <td></td><td></td></tr><tr><td>Rat (RSA)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor octanu sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPR-Biacore 3000</td><td>GE Healthcare/ Cytiva life sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRi Biochip</td><td>Platforma</td><td></td> technologiczna MIMENTO <td>Biochipy zostały wyprodukowane we własnym zakresie w pomieszczeniu czystym, Besancon</td></tr><tr><td>SPRi Plex II</td><td>Horiba Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to pochodzące z błony, maleńkie pęcherzyki wytwarzane przez wszystkie komórki, o średnicy od 50 do kilkuset nanometrów i używane jako środek komunikacji międzykomórkowej. Stają się one obiecującymi narzędziami diagnostycznymi i terapeutycznymi dla różnych chorób. Istnieją dwa główne procesy biogenezy wykorzystywane przez komórki do produkcji EV różniących się wielkością, składem i zawartością. Ze względu na ich wysoką złożoność pod względem wielkości, składu i pochodzenia komórek, ich charakterystyka wymaga połączenia technik analitycznych. Projekt ten zakłada opracowanie nowej generacji wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki subpopulacji pojazdów elektrycznych. Aby osiągnąć ten cel, prace rozpoczynają się od stworzonej przez grupę platformy nanobioanalitycznej (NBA), która umożliwia oryginalne badanie pojazdów elektrycznych w oparciu o połączenie multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy. Celem było zakończenie tego badania EV analizą fenotypową i molekularną za pomocą spektroskopii Ramana. Osiągnięcia te umożliwiają zaproponowanie multimodalnego i łatwego w użyciu rozwiązania analitycznego do dyskryminacji podzbiorów EV w płynach biologicznych o potencjale klinicznym

Wyznaczenie optymalnych warunków pH dla szczepienia ligandów 
Różne ligandy wykorzystywane do przygotowania biochipów są testowane w zależności od pH oraz ich zdolności do oddziaływania z chemiczną warstwą tiolanową (Rysunek 3). Ligandy są rozcieńczane w buforze octanowym o różnych wartościach pH, a następnie wstrzykiwane na biochip funkcjonalizowany chemicznie warstwą C11C16. Roztwory są wstrzykiwane na powierzchnię w sposób losowy, a po każdym wstrzyknięciu ligandu poda...

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

Złożona natura pojazdów elektrycznych sprawia, że trudno jest rozpoznać subpopulację będącą przedmiotem zainteresowania, a ten protokół może wykryć je na podstawie ich fenotypu, profilu wielkości i właściwości nanomechanicznych. Ta kombinacja techniki jest metodą bezznacznikową, która pozwala nam wykrywać EV w czasie rzeczywistym na podstawie pożywki stanowej i osocza krwi. Technika ta umożliwia dogłębne scharakteryzowanie podzbioru nanocząstek będących przedmiotem zainteresowania, w celu wykorzystania ich jako bioindykatorów patologii lub również wykorzystania jako nanocząstki do dostarczania leków.Ponieważ jest to bardzo czuła metoda, konieczne jest zwrócenie uwagi na przygotowanie biochipa przed wstrzyknięciem interesującej Cię próbki. Po pokryciu i funkcjonalizacji chipów należy inkubować biochip w mieszaninie 200-milimolowego dimetyloaminopropylokarbodiiimidu/N-hydroksysukcynimidu etylu i N-hydroksysukcynimidu o stężeniu 50 milimoli na litr przez co najmniej 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Za pomocą spottera dodaj 300 nanolitrów roztworu liganda i inkubuj biochip pod kąpielą soniczną przez 30 minut.Umyj biochip od góry ultraczystą wodą. Dodaj kroplę oleju o tym samym współczynniku załamania światła co pryzmat, aby utworzyć jednolitą cienką warstwę między biochipem a pryzmatem i delikatnie umieść ją na pryzmacie o tym samym współczynniku załamania światła co biochip. W przypadku obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego należy zamontować biochip w systemie SPRi.Przejdź do menu rozwijanego po lewej stronie oprogramowania i kliknij Katalog roboczy. Znajdź obraz, na którym widoczne są różne miejsca, i kliknij, aby wybrać ten obraz. Następnie wpisz nazwę rodzin ligandów i kliknij definicję gatunku końcowego.Przeciągnij czarną linię kursorem do optymalnego kąta roboczego. Kliknij Przesuń lustro do kąta roboczego i wybierz kąt roboczy. Teraz kliknij Kinetyka.Gdy oprogramowanie poprosi użytkownika o zdefiniowanie kontroli ujemnej, wybierz w tym momencie opcję Brak kontroli ujemnej. Wstrzyknij albuminę surowicy szczura w ilości 50 mikrolitrów na minutę przez cztery minuty. Wstrzykiwać etanoloaminę w ilości 20 mikrolitrów na minutę przez 10 minut, aby dezaktywować grupy karboksylowe nadal obecne i reaktywne na powierzchni.Następnie umyj biochip, wstrzykując 40 milimolowy OG w ilości 50 mikrolitrów na minutę przez cztery minuty. Wstrzyknij pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w określonym stężeniu na biofunkcjonalizowany chip, jednocześnie śledząc kinetykę interakcji pęcherzyków w różnych miejscach. Określ również wartość współczynnika odbicia i poziom interakcji.Po ustabilizowaniu wstrzyknij aldehyd glutarowy na chip, aby utrwalić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w miejscu, w którym się znajdują, przed wykonaniem obrazowania AFM. Dopasuj biochip do górnej części maski na szklanym szkiełku. Użyj kamery CCD na górze AFM, aby zlokalizować wspornik we właściwym miejscu, które należy zeskanować.Rozpocznij akwizycję AFM w trybie kontaktowym od trzech do pięciu dużych i małych obszarów. Następnie potraktuj obrazy AFM za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych JPK, wybierając najpierw kanał wysokości. Wybierz pasowanie wielomianowe, które ma zostać odjęte od każdej linii, aby uzyskać wyprostowane linie skanowania.Wybierz próg wysokości na ziarnach złota, aby wyeliminować chropowatość powierzchni. Moduł ekstrakcji ziarna oznacza ziarna za pomocą progu wysokości 8,5 nanometra. Multipleksowane biochipy analizowano po pasywacji albuminy.Układ bez wartości domyślnej. Chip z pewnymi wadami, spowodowanymi fuzją plam, słabym szczepieniem, pęcherzykami lub zanieczyszczeniami. Pokazano też nagi złoty chip bez mikroukładów do badania adsorpcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na złocie.Eksperyment z wychwytywaniem na multipleksowanym biochipie wykazał dobre sygnały odbicia dla różnych ligandów i dobry stosunek sygnału do szumu dla różnych ligandów, ponieważ odpowiedź kontroli negatywnej była znikoma. Adsorpcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych po wstrzyknięciu próbki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wykazywała sygnał o wysokim współczynniku odbicia, co sugeruje, że pęcherzyki te były w stanie adsorbować się i pozostawać stabilne na złotym chipie. Po załadowaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wygenerowano wielkoskalowe i małoskalowe obrazy AFM pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na biochipach.Bliższe spojrzenie w wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiary pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Efektywna średnica pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na biochipie wahała się od 30 do 300 nanometrów, przy czym zdecydowana większość wynosiła około 60 nanometrów. Wyniki uzyskane w powietrzu i cieczy były porównywalne.Widmo Ramana pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zaadsorbowanych na nieosłoniętym chipie ujawniło wyraźne spektrum, z pikami odpowiadającymi głównie drganiom metylenu, które są związane z lipidami błon pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Ważne jest, aby rygorystycznie przygotować biochip, aby móc wykrywać pojazdy elektryczne dokładnie i w powtarzalny sposób. Konwencjonalne metody, takie jak Western blotting i analiza śledzenia nanocząstek, mogą być stosowane w celu skorelowania i potwierdzenia fenotypów i wzorców wielkości.Co więcej, przewiduje się, że analizy multiomiczne jeszcze bardziej zagłębią się w charakterystykę molekularną EV i potencjalną dyskryminację podzbiorów.

multimodal-analytical-platform-on-multiplexed-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Przedstawiamy tutaj protokół analizy pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) za pomocą bezoznakowanego, powierzchniowego spektroskopii Ramana (SERS), umożliwiającej minimalnie inwazyjną diagnostykę chorób i ocenę sEV jako środków dostarczania terapii.

Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii

Komora pomiarowa analitycznej ultrawirówki (AUC) mieści próbkę oraz bufor referencyjny i podczas eksperymentów jest poddawana działaniu wysokiej próżni oraz prędkościom rotacji do 60 000 rpm. Niniejszy film zaprezentuje rygorystyczną dbałość o szczegóły, która jest niezbędna podczas montażu, napełniania i centrowania tego kluczowego elementu eksperymentu AUC.

Montaż, napełnianie i centrowanie celi pomiarowej analitycznej ultrawirówki

Poznaj wieloparametryczną platformę analityczną do charakteryzacji podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem obrazowania rezonansu plazmonowego. Metoda bezetykietowa umożliwia wykrywanie EV w czasie rzeczywistym z osocza krwi i mediów warunkowych.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów