Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
17 marca 2023
Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.
Złożona natura pojazdów elektrycznych sprawia, że trudno jest rozpoznać subpopulację będącą przedmiotem zainteresowania, a ten protokół może wykryć je na podstawie ich fenotypu, profilu wielkości i właściwości nanomechanicznych. Ta kombinacja techniki jest metodą bezznacznikową, która pozwala nam wykrywać EV w czasie rzeczywistym na podstawie pożywki stanowej i osocza krwi. Technika ta umożliwia dogłębne scharakteryzowanie podzbioru nanocząstek będących przedmiotem zainteresowania, w celu wykorzystania ich jako bioindykatorów patologii lub również wykorzystania jako nanocząstki do dostarczania leków.
Ponieważ jest to bardzo czuła metoda, konieczne jest zwrócenie uwagi na przygotowanie biochipa przed wstrzyknięciem interesującej Cię próbki. Po pokryciu i funkcjonalizacji chipów należy inkubować biochip w mieszaninie 200-milimolowego dimetyloaminopropylokarbodiiimidu/N-hydroksysukcynimidu etylu i N-hydroksysukcynimidu o stężeniu 50 milimoli na litr przez co najmniej 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Za pomocą spottera dodaj 300 nanolitrów roztworu liganda i inkubuj biochip pod kąpielą soniczną przez 30 minut.
Umyj biochip od góry ultraczystą wodą. Dodaj kroplę oleju o tym samym współczynniku załamania światła co pryzmat, aby utworzyć jednolitą cienką warstwę między biochipem a pryzmatem i delikatnie umieść ją na pryzmacie o tym samym współczynniku załamania światła co biochip. W przypadku obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego należy zamontować biochip w systemie SPRi.
Przejdź do menu rozwijanego po lewej stronie oprogramowania i kliknij Katalog roboczy. Znajdź obraz, na którym widoczne są różne miejsca, i kliknij, aby wybrać ten obraz. Następnie wpisz nazwę rodzin ligandów i kliknij definicję gatunku końcowego.
Przeciągnij czarną linię kursorem do optymalnego kąta roboczego. Kliknij Przesuń lustro do kąta roboczego i wybierz kąt roboczy. Teraz kliknij Kinetyka.
Gdy oprogramowanie poprosi użytkownika o zdefiniowanie kontroli ujemnej, wybierz w tym momencie opcję Brak kontroli ujemnej. Wstrzyknij albuminę surowicy szczura w ilości 50 mikrolitrów na minutę przez cztery minuty. Wstrzykiwać etanoloaminę w ilości 20 mikrolitrów na minutę przez 10 minut, aby dezaktywować grupy karboksylowe nadal obecne i reaktywne na powierzchni.
Następnie umyj biochip, wstrzykując 40 milimolowy OG w ilości 50 mikrolitrów na minutę przez cztery minuty. Wstrzyknij pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w określonym stężeniu na biofunkcjonalizowany chip, jednocześnie śledząc kinetykę interakcji pęcherzyków w różnych miejscach. Określ również wartość współczynnika odbicia i poziom interakcji.
Po ustabilizowaniu wstrzyknij aldehyd glutarowy na chip, aby utrwalić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w miejscu, w którym się znajdują, przed wykonaniem obrazowania AFM. Dopasuj biochip do górnej części maski na szklanym szkiełku. Użyj kamery CCD na górze AFM, aby zlokalizować wspornik we właściwym miejscu, które należy zeskanować.
Rozpocznij akwizycję AFM w trybie kontaktowym od trzech do pięciu dużych i małych obszarów. Następnie potraktuj obrazy AFM za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych JPK, wybierając najpierw kanał wysokości. Wybierz pasowanie wielomianowe, które ma zostać odjęte od każdej linii, aby uzyskać wyprostowane linie skanowania.
Wybierz próg wysokości na ziarnach złota, aby wyeliminować chropowatość powierzchni. Moduł ekstrakcji ziarna oznacza ziarna za pomocą progu wysokości 8,5 nanometra. Multipleksowane biochipy analizowano po pasywacji albuminy.
Układ bez wartości domyślnej. Chip z pewnymi wadami, spowodowanymi fuzją plam, słabym szczepieniem, pęcherzykami lub zanieczyszczeniami. Pokazano też nagi złoty chip bez mikroukładów do badania adsorpcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na złocie.
Eksperyment z wychwytywaniem na multipleksowanym biochipie wykazał dobre sygnały odbicia dla różnych ligandów i dobry stosunek sygnału do szumu dla różnych ligandów, ponieważ odpowiedź kontroli negatywnej była znikoma. Adsorpcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych po wstrzyknięciu próbki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wykazywała sygnał o wysokim współczynniku odbicia, co sugeruje, że pęcherzyki te były w stanie adsorbować się i pozostawać stabilne na złotym chipie. Po załadowaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wygenerowano wielkoskalowe i małoskalowe obrazy AFM pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na biochipach.
Bliższe spojrzenie w wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiary pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Efektywna średnica pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na biochipie wahała się od 30 do 300 nanometrów, przy czym zdecydowana większość wynosiła około 60 nanometrów. Wyniki uzyskane w powietrzu i cieczy były porównywalne.
Widmo Ramana pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zaadsorbowanych na nieosłoniętym chipie ujawniło wyraźne spektrum, z pikami odpowiadającymi głównie drganiom metylenu, które są związane z lipidami błon pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Ważne jest, aby rygorystycznie przygotować biochip, aby móc wykrywać pojazdy elektryczne dokładnie i w powtarzalny sposób. Konwencjonalne metody, takie jak Western blotting i analiza śledzenia nanocząstek, mogą być stosowane w celu skorelowania i potwierdzenia fenotypów i wzorców wielkości.
Co więcej, przewiduje się, że analizy multiomiczne jeszcze bardziej zagłębią się w charakterystykę molekularną EV i potencjalną dyskryminację podzbiorów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorską multiparametryczną platformę analityczną do wysokoprzepustowej charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Platforma łączy wielofunkcyjne metody biosensingu z mikroskopią sił atomowych oraz spektroskopią Ramana w celu analizy EV w czasie rzeczywistym, koncentrując się na ich fenotypach, profilach wielkości oraz właściwościach nanomechanicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
- Wieloparametryczne techniki analityczne
- Metody biosensoryczne
Wstęp
- Złożoność EV utrudnia identyfikację ich subpopulacji.
- Znaczenie EV jako biomarkerów patologii oraz w dostarczaniu leków.
- Potrzeba czułych metod detekcji w różnych próbkach biologicznych.
Zastosowane metody
- Łączy multipleksowe biosensorowanie, mikroskopię sił atomowych oraz spektroskopię Ramana.
- Wykorzystuje biofunkcjonalizowane mikromacierze do detekcji EV w czasie rzeczywistym.
- Podejście bezetykietowe w celu zminimalizowania zakłóceń w charakterystyce EV.
Główne wyniki
- Technika ta wykazuje skuteczną detekcję EV w oparciu o ich rozmiar i skład.
- Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości ujawnia, że średnica EV mieści się w zakresie od 30 do 300 nanometrów, przy czym dominuje wartość około 60 nanometrów.
- Widma Ramanowskie wskazują na skład błony lipidowej, co potwierdza skuteczność tej metody.
Wnioski
- Badanie pomyślnie demonstruje wiarygodną metodę rozległej charakterystyki EV.
- Praca ta ma istotne znaczenie dla badań nad biomarkerami oraz zastosowań terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Charakterystyka podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z wysoką swoistością i przepustowością stanowi krytyczne wyzwanie w wczesnym odkrywaniu biomarkerów oraz rozwoju platform terapeutycznych. Opisana multimodalna platforma analityczna integruje multipleksowe biosensorowanie, mikroskopię sił atomowych i spektroskopię Ramana, aby zapewnić ilościowe, bezetykietowe profilowanie fenotypowe i molekularne EV. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w walidacji biomarkerów opartych na EV i wspiera decyzje dotyczące portfolio skorygowane o ryzyko w badaniach translacyjnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia głębokie profilowanie fenotypowe i nanomechaniczne subpopulacji EV w celu walidacji celu.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez rozróżnianie podzbiorów EV na podstawie wielkości, składu i cech molekularnych.
- Ułatwia badanie EV jako bioindykatorów istotnych dla przebiegu choroby w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, multipleksowe biochipy do powtarzalnych procesów wychwytywania i analizy EV.
- Zapewnia ilościowe odczyty w czasie rzeczywistym dotyczące interakcji EV i profili adsorpcji.
- Standaryzuje warunki analizy, aby umożliwić wiarygodne porównania między próbkami i ligandami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność charakterystyki podzbiorów EV ze strategiami biomarkerów translacyjnych w monitorowaniu chorób.
- Zapewnienie ciągłości od profilowania EV na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji kandydatów na biomarkery.
- Zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w rozwoju terapii i diagnostyki opartych na EV.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta multimodalna platforma łączy wczesny etap odkryć, przesiewanie oraz badania translacyjne, umożliwiając kompleksową analizę podzbiorów EV z płynów biologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez multipleksowe, ilościowe profilowanie EV.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne wyniki testów bez użycia znaczników w celu rozróżnienia podzbiorów EV oraz swoistości ligandów.
- Analityka: Integruje odczyty morfomechaniczne i molekularne w celu przeprowadzenia porównań między różnymi warunkami oraz analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i zapewnia ciągłość przedkliniczną w diagnostyce opartej na EV.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, wielokrotnego użytku platformę analityczną dla zróżnicowanych programów badawczo-rozwojowych nad EV.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze biomarkerów EV oraz kandydatów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość w procesach analizy EV.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfolio skoncentrowanym na EV.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację projektów odkrywczych i translacyjnych opartych na EV z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu multipleksowego biosensingu, AFM i spektroskopii Ramana w celu optymalnego funkcjonowania platformy.
- Niezbędne jest rygorystyczne przygotowanie i funkcjonalizacja biochipów, aby zapewnić powtarzalność i czułość.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanej aparatury i infrastruktury analitycznej w celu wysokorozdzielczej charakterystyki EV.
- Wskazana jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów testowych i przepływów pracy analizy danych.
- Może być wymagana adaptacja do różnych matryc biologicznych lub źródeł EV, co jest możliwe dzięki elastyczności platformy.
