Lentivirus उत्पादन

Summary

Lentiviruses बनाने के लिए, मानव 293 कोशिकाओं में डीएनए वैक्टर ट्रांसफ़ेक्ट हैं. फसल के बाद और ध्यान केंद्रित सतह पर तैरनेवाला, वायरस टिटर एक प्रवाह cytometer के साथ प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित किया जाता है.

Abstract

शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) जीवित कोशिकाओं में जीन मुंह बंद करने की एक प्रणाली है. आरएनएआई में, जीन मुताबिक़ कम दखल RNAs के अनुक्रम में (siRNA) के बाद transcriptional राज्य में खामोश हैं. लघु बाल के लिये कांटा RNAs, siRNA के लिए व्यापारियों, lentivirus का उपयोग करते हुए, सेल प्रकार की एक किस्म में आरएनएआई के लिए अनुमति देता है व्यक्त किया जा सकता है. मानव इम्यूनो वायरस जैसे Lentiviruses, दोनों विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए सक्षम हैं. हम एक प्रक्रिया है जो पैकेज lentiviruses का वर्णन करेंगे. पैकेजिंग डीएनए वैक्टर से सक्षम वायरस की तैयारी करने के लिए संदर्भित करता है. Lentiviral वेक्टर उत्पादन प्रणालियों एक 'विभाजन' प्रणाली है, जहां प्राकृतिक वायरल जीनोम व्यक्तिगत सहायक प्लाज्मिड constructs में विभाजित किया गया है पर आधारित हैं. चार अलग वैक्टर में विभिन्न वायरल तत्वों की इस बंटवारे lentiviral जीनोम के आकस्मिक पुनर्संयोजन द्वारा एक प्रतिकृति - सक्षम वायरस बनाने का जोखिम कम हो. यहाँ, एक ब्याज और तीन पैकेजिंग वैक्टर shRNA (पी VSVG, pRSV, pMDL) युक्त वेक्टर transiently मानव 293 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट हैं. कम से कम एक ऊष्मायन 48 घंटे की अवधि के बाद, वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला काटा है और ध्यान केंद्रित किया. अंत में, वायरस टिटर रिपोर्टर (फ्लोरोसेंट) एक प्रवाह cytometer के साथ अभिव्यक्ति के द्वारा निर्धारित किया जाता है.

Protocol

भाग 1: HEK 293 कक्ष के अभिकर्मक Lentiviruses निर्माण

* 24 घंटे पहले अभिकर्मक, 2.5 प्लेट 10 एक्स 50-70% अगले दिन के एक confluency के लिए एक 10cm पकवान ^में 6 कोशिकाओं .

1. डीएनए के साथ जो एक बाद एक वायरस बनाने कोशिकाओं transfect की तैयारी द्वारा इस प्रोटोकॉल का प्रारंभ. सबसे पहले, FuGENE 6 अभिकर्मक अभिकर्मक रॉश, एक लिपिड अभिकर्मक है कि कोशिकाओं को डीएनए ले जलमिश्रित. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब, पिपेट 30μl 6 FuGENE 600ul मध्यम सीरम मुक्त में (SFDMEM). FuGENE ट्यूब के पक्ष स्पर्श के रूप में यह माध्यम में कर दिया है नहीं करने के लिए सावधान रहें. इस FuGENE और SFDMEM मिश्रण और 5 मिनट के लिए सेते कमरे के तापमान पर चलो.
2. ट्यूब की टोपी में, 4 lentiviral μg 4 μg प्रत्येक 3 ^Rd पीढ़ी वायरल पैकेजिंग वैक्टर (pMDL, pRSV और pVSV जी) के साथ प्लाज्मिड मिश्रण . lentiviral प्लास्मिड डीएनए वायरस यह संक्रमित हर कोशिका के जीनोम में सम्मिलित करते हैं, जबकि अन्य सभी के लिए एक lentivirus बनाने के लिए आवश्यक प्रोटीन के लिए पैकेजिंग वैक्टर जीन होते हैं.
3. ढक्कन और inverting ट्यूब कुछ समय से मिश्रण को बंद करें.
4. कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट सेते हैं.
5. पिपेट 293 थाली में ट्यूब की संपूर्ण सामग्री. झुकने की थाली से धीरे आगे और पीछे मिक्स.
6. इनक्यूबेटर करने के लिए कोशिकाओं को लौटें और वायरल उत्पादन 48-96 घंटे के लिए फसल से पहले जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं.
7. ऊष्मायन के दौरान 293 कोशिकाओं lentiviral प्लाज्मिड से ब्याज की डीएनए अनुलेखन, lentiviral निर्माण के एक शाही सेना प्रतिलिपि बनाने. उन्होंने यह भी नक़ल और वायरल प्रोटीन में पैकेजिंग वैक्टर में जीन अनुवाद. ये प्रोटीन के लिए अपने lentiviral निर्माण के शाही सेना संस्करण है, जो वायरस टाइप करना रिवर्स और सभी कोशिकाओं को संक्रमित जीनोम में डालने जाएगा जिसमें वायरस बनाने के लिए आगे बढ़ना.

भाग 2: lentiviral हार्वेस्ट

1. ऊष्मायन अवधि के बाद, कोशिकाओं के बाहर ले इनक्यूबेटर और एक डिस्पोजेबल, 10ml सिरिंज का उपयोग करने के लिए सतह पर तैरनेवाला है, जो अब वायरस शामिल हटायें. सतह पर तैरनेवाला के 10ml के बारे में किया जाएगा.
2. टिप करने के लिए एक 0.45μM सिरिंज फिल्टर संलग्न है और एक Beckman ultracentrifuge ट्यूब में वायरस फिल्टर. फिल्टर केवल वायरस की अनुमति देता है, और के माध्यम से नहीं करने के लिए कोशिकाओं पास.
3. Discarding से पहले, सभी वायरस के उत्पादन की कोशिकाओं को सेते हैं, संस्कृति, प्लेटें, सीरिंज और 45 मिनट के लिए 10% ब्लीच में फिल्टर.

भाग 3: ultracentrifugation के माध्यम से lentiviral एकाग्रता

1. SW-41Ti या SW-28 रोटर बाल्टी में अपकेंद्रित्र ट्यूबों लोड.
2. सीरम - मुक्त DMEM प्रयोग के लिए सभी वायरस युक्त संतुलन 0.2g के भीतर ट्यूबों.
3. Ultracentrifuge अंदर रोटर रखने से पहले रोटर बाल्टी बंद हैं और उन्हें रोटर पर हुक सील
4. Ultracentrifuge एक में 90 मिनट के लिए 4 पर वायरस स्पिन ° सी SW-41Ti रोटर में 25,000 rpm या एक SW-28 रोटर में 24,000 rpm पर.
5. एक टिशू कल्चर हुड में, ट्यूब उल्टा पलटना करने के लिए एक 10% ब्लीच युक्त कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला डालना.
6. गोली के आसपास अतिरिक्त तरल अवशोषित और पांच मिनट से अधिक नहीं के लिए एक सुविधाजनक रैक में ट्यूब पलटना एक Kimwipe का प्रयोग करें.
7. वायरल गोली फिर से निलंबित करने के लिए एक फिल्टर टिप ट्यूब के लिए 100 μL बाँझ पीबीएस जोड़ने का उपयोग करें, तब विंदुक ऊपर और नीचे के बारे में 20 बार.
8. 4 में वायरस छोड़ो ° फिर निलंबन को पूरा करने के लिए रातोंरात सी. एक के बारे में 1 सप्ताह के लिए और एक वर्ष के लिए -80 डिग्री पर 4 डिग्री पर वायरल preps की दुकान कर सकते हैं. Discarding के पहले 10% ब्लीच के साथ सभी खाली ट्यूबों का इलाज करने के लिए याद रखें.
9. यदि एक 1 सप्ताह से अधिक समय के लिए वायरल प्रस्तुत करने का उपयोग करने का इरादा रखता है, भविष्य प्रयोगों और टाइट्रेट करना के लिए 1 की 3 विभाज्य 5μl के लिए कम से कम 5-20μl aliquots बनाते हैं. रुक और 80 ऋण पर aliquots दुकान.

भाग 4: lentiviral प्रवाह cytometry का उपयोग अनुमापन

1. अगले कदम के लिए प्रवाह cytometry द्वारा वायरल टिटर निर्धारित है. इस पद्धति का ही मामलों में जहां lentiviral प्लाज्मिड एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन शामिल काम करता है. विचार है कि जब वायरस एक सेल संक्रमित, यह है कि सेल जीनोम में lentiviral प्लास्मिड डीएनए परिचय. संक्रमित कोशिका तो नक़ल करना और lentiviral प्लाज्मिड में आप शामिल जीन अनुवाद, और यदि आप एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन शामिल हैं, संक्रमित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति. प्रतिदीप्ति का स्तर शक्ति, या वायरस के टिटर का प्रतिनिधित्व करता है.
2. प्रत्येक वायरल शेयर titered हो सकता है, पूरा मीडिया के 1.5 मिलीलीटर (DMEM, कलम strep, glutamine, FBS) में केंद्रित वायरस के 3 μl पतला.
3. सभी 6 कुओं पूरा DMEM मीडिया के 100 μl जोड़ने के लिए: एक 96 अच्छी तरह से थाली की एक पंक्ति में 1-6 कुओं में, निम्न धारावाहिक dilutions प्रदर्शन. पहले कोई वायरस के साथ अच्छी तरह से मीडिया के 100μl जोड़ (यह आपके अस्थिर नियंत्रण है), दूसरे ही पतला वायरस के 100 μl (जो undiluted वायरस के बराबर to1 मिलीलीटर) तीसरे, जोड़ अच्छी तरह से 100 μl जोड़नेअच्छी तरह से दूसरे से मिश्रण के अच्छी तरह से अच्छी तरह से 3 से 100 मिलीलीटर जोड़ने, पांचवें के लिए अच्छी तरह से 4 अच्छी तरह से, और छठे 100μl अच्छी तरह से जोड़ अच्छी तरह से 5 से 100 μl जोड़ने के चौथे. अंत में 6 अच्छी तरह से बाहर 100ul और ले ब्लीच में त्यागें. एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन किया गया था जहां प्रत्येक अच्छी तरह से वायरस के आधे से पहले यह एक की तुलना में मात्रा है.
4. 200μl सभी कुओं में कुल मात्रा लाओ. ध्यान दें कि इन ही सुझाव दिया है dilutions, जो अच्छी तरह से सबसे केंद्रित वायरस titering के लिए काम करना चाहिए रहे हैं. यदि वायरस टिटर में कम है, या unconcentrated एक dilutions समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
5. Discarding के पहले 45 मिनट के लिए एक biohazard अपशिष्ट कंटेनर में 10% ब्लीच के साथ किसी भी अप्रयुक्त पतला वायरस समझो.
6. 6 कुओं के प्रत्येक के लिए ~ +१५,००० स्वस्थ, सक्रिय विभाजन 293 कोशिकाओं जोड़ें. एक एकल 96 अच्छी तरह से थाली 16 वायरल preps टिटर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
7. ₂ 5% सीओ के साथ 37 डिग्री इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें और संक्रमण को कम से कम 48 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं.
8. ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं एक प्रवाह cytometer के साथ संवाददाता अभिव्यक्ति (हमारे मामले प्रतिदीप्ति में) के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. वायरल कणों को अच्छी तरह से प्रति फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत के द्वारा quantitated कर रहे हैं.

निम्न सूत्र के साथ मिलीलीटर प्रति संक्रामक इकाइयों की संख्या की गणना:

_{(अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के संक्रमण एक्स संवाददाता सकारात्मक कोशिकाओं के दिन पर) एक्स 1000}
^{______________________________________________________
वेक्टर के मिलीलीटर अच्छी तरह से जोड़ा}

भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम:

ऊष्मायन 48 घंटे के बाद की अवधि अभिकर्मक के बाद, 293 कोशिकाओं की थाली फ्लोरोसेंट पर 90% के आसपास होना चाहिए. फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत वायरस उत्पादक कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत का एक संकेत है.

Centrifugation के बाद, वायरल गोली मुश्किल से दिखाई देता है जब resuspending. यह सामान्य है के रूप में गोली स्पष्ट है और बहुत छोटी है.

ध्यान दें, जब प्रवाह cytometer परिणामों की व्याख्या है कि एक ही सटीक टिटर गणना हासिल जब (फ्लोरोसेंट) संक्रमित कोशिकाओं से अधिक नहीं एक सेल प्रति वायरल एकीकरण प्राप्त हुआ है हो सकता है. आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह मामला है, <15% की गणना के लिए संक्रमण की दर के साथ कोशिकाओं का उपयोग करें. उच्च संक्रमण दरों के साथ कक्ष की संभावना सेल प्रति एकाधिक वायरल integrants मिला है. चरण 2 में सुझाव दिया dilutions संक्रमण की इस सीमा के भीतर कई नमूने उपज चाहिए. आदर्श रूप में, कई नमूने का उपयोग करने के लिए एक टाइट्रेट करना साजिश (रैखिक लाइन) से जो आप अंतिम टिटर की गणना कर सकते हैं उत्पन्न है, लेकिन आप टिटर गणना एक एकल नमूने का उपयोग कर सकते हैं, यदि आवश्यक. एक की उम्मीद कर सकते हैं टिटर के 1.0 x 10 ⁷ टीयू संयुक्त राष्ट्र केंद्रित वायरस के लिए मिलीग्राम / और 1.0 ^x 10 8 टीयू केंद्रित वायरस के लिए मिलीग्राम /.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.