Eliminación de puparium insecto: un método para la investigación pupal

Overview

Este artículo describe una técnica para eliminar el pupario de un insecto mientras mantiene intacta la pupa interior y, por lo tanto, apta para una investigación posterior. El protocolo de ejemplo muestra el procedimiento con Drosophila guttifera; sin embargo, esta técnica es aplicable a otras especies de Drosophila.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Fukutomi et al., Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera, J. Vis. (2018).

1. Eliminación del puparium

NOTA Pupas de Drosophila están cubiertas por una estructura llamada puparium. Un insecto de Muscomorpha (moscas) no derrama su cutícula larvaria en la pupación; en su lugar, endurece la cutícula después de la apólisis, y la utiliza como una cubierta protectora de la pupa, el puparium. Una pupa que reside dentro de un puparium tiene una verdadera cutícula pupal, que es muy suave y frágil. Antes de que la apolisis tenga lugar alrededor de P4(ii), la epitelelia y el puparium se unen, y por lo tanto la eliminación del puparium sin daño es muy difícil. Después de P5, la eliminación del pupario es laboriosa, pero útil para la observación morfológica y la definición de etapas pupales. El proceso se lleva a cabo de la siguiente manera.

1. Coloque un trozo de cinta de doble cara en una toalla de papel.
2. Coloque una pupa en el lado ventral de cinta de doble cara hacia arriba (Figura 1A).
3. Localice el espacio entre el lado anterior del puparium y la pupa interna. Sujete y retire el pupario alrededor de esta brecha usando fórceps, y exponga el lado anterior de la cabeza de la pupa.
4. Inserte la punta de un fórceps moviéndolo paralelo al eje anterior-posterior. Levante la punta de los fórceps para romper localmente el puparium. Repita esta acción hasta que la rotura llegue a la parte posterior del puparium. Asegúrese de que también se forme un hueco entre el pupario y las patas pupales, y rompa el lado ventral del puparium y minimice el daño a la pupa interna(Figura 1B).
5. Después de romper el puparium tanto como sea posible, saque la pupa usando un pincel fino (#5/0) (Figura 1C).
6. Coloque la pupa en un pedazo de papel tisú que ha sido humedecido con ddH₂O y colocado en una placa de plástico Petri (diámetro 60 mm x altura 15 mm). Tome fotografías lo antes posible porque la pupa expuesta es vulnerable y se seca fácilmente.
    

Representative Results

Figura 1. Ilustración de la eliminación del puparium. (A) Coloque un lado ventral pupa en un pedazo de cinta de doble cara. Retire la parte anterior del puparium. (B) Romper el puparium con fórceps del lado ventral. (C) Después de romper el puparium, saque la pupa usando un pincel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)