Рассечение глаз объектива: Техника для наблюдения Зебрафиш объектив Морфология

Overview

Это видео описывает протокол, который разработан для вскрытия взрослых и личинок зебры линзы для анализа морфологии корковых линз и структурной целостности шов объектива.

Protocol

1. Рассечение larval и взрослых объективов зебры

1. Анестезировать рыбу от 6 личинок dpf до взрослой жизни с трикайном до тех пор, пока не реагировать на прикосновения, но по-прежнему показывает сильное сердцебиение. Измерьте стандартную длину рыбы в соответствии с Schilling (2002) для постановки.
2. Немедленно акцизные глаза с помощью микро-рассечения ножницы и поместить в рассечение блюдо в PBS (Рисунок 1 показано для взрослых глаз).
   1. Сделать пользовательские 35 мм блюдо заполнено силиконом для вскрытия объектива. После того, как силикон установил, акциз divot около 2-3 мм в диаметре и 0,5 мм глубиной для обездвиживания взрослых глаз / линз во время вскрытия.
3. Рассечение взрослых линз зебры
   1. Поместите взрослый глаз в блюдо divot задней стороне заполнены PBS. Обездвижить глаз, вставив типсы под углом «lt;45» через оптический диск. Будьте осторожны, чтобы не ник или сжать объектив. Сделайте два или три радиальных разреза через сетчатку и склеру от зрительного диска до цилиарной зоны с ножницами для вскрытия.
   2. Очистите сетчатку и склеру, как лепестки цветов и инвертировать глаз, роговица стороне вверх. Обездвижить хрусталик косвенно с помощью манипуляции склеры и роговицы с плоской стороны ножниц, в то время как потянув от сетчатки и прилагается тканей с типсами. Тщательно обрезать излишки ткани из объектива.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно тщательно вскрыть, чтобы получить последовательно здоровые линзы.
4. Рассечение личинородных линз зебры
   1. Поместите личиночного глаза задней стороны на плоскую часть силиконовой блюдо заполнены PBS и использовать заточенные вольфрама иглы, чтобы сделать радиальные разрезы через сетчатку и склеры при обездвиживания глаза с другой иглой вольфрама или типсов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить объектив.
      1. Заострите кончик 2 см длиной 0,1 мм вольфрамовой проволоки электролитически, приостановив кончик провода на 10% (w/v) NaOH и применяя низкое напряжение переменного тока14. Закрепить иглу в пастер пипетку, расплавив стеклянный конец с помощью горелки Bunsen.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Можно также использовать альтернативные инструменты тонкого вскрытия.
         ВНИМАНИЕ: NaOH является коррозионным.
   2. Аккуратно вычерпыв хрусталик из разобщеного глаза тупой стороной иглы, и аккуратно вытащите прикрепленную ткань.

Representative Results

Рисунок 1: Вскрытие объектива зебры. (A) Глаза рассекают от анестезированой рыбы и помещают заднюю сторону вверх (B). C) глаза обездвижены типсами через зрительный диск (od) и два-три радиальных разреза делаются в сетчатке и склере от оптического диска до зонул. (D) Сложите закрылки, чтобы показать объектив. (E) Поверните глаз к лицу роговицы вверх, обездвижить объектив косвенно через роговицу и оторвать склеры сетчатки. (F) Обрезать оставшиеся сетчатки и цилиарной зоны / зонулы из объектива

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A