Summary
Ein Mausmodell für Myokardischämie und ischämische Präkonditionierung ist ein wichtiges Instrument Studie kardioprotektive Mechanismen
Abstract
Murine Studien zur akuten Verletzungen sind ein Gebiet intensiver Untersuchung, als Knockout-Mäusen für verschiedene Gene immer sind zunehmend 1-38. Kardioprotektion durch ischämische Präkonditionierung (IP) ist ein Gebiet intensiver Untersuchungen. Zur weiteren Aufklärung der molekularen Basis, ist der Einsatz von Knockout-Maus-Studien besonders wichtig, 7, 14, 30, 39. Trotz der Tatsache, dass frühere Studien haben bereits erfolgreich kardialen Ischämie und Reperfusion in Mäusen durchgeführt, ist dieses Modell technisch sehr anspruchsvoll. Insbesondere ist die visuelle Identifizierung der Koronararterie, die Platzierung der Naht um das Schiff und koronaren Okklusion durch Abbinden des Gefäßes mit einem unterstützten Knoten technisch schwierig. Darüber hinaus fügt Neueröffnung der Knoten für den intermittierenden Reperfusion der Koronararterien bei IP ohne chirurgischen Traumas zusätzliche Herausforderung. Darüber hinaus kann, wenn der Knoten nicht nach unten stark genug ist, unbeabsichtigte Reperfusion durch mangelhafte Verschluss der Koronararterien gebunden Einfluss auf die Ergebnisse. In der Tat kann dies leicht durch die Bewegung des schlagenden Herzens auftreten.
Basierend auf mögliche Probleme bei der Verwendung einer verknoteten koronaren Verschluss-System verbunden sind, haben wir einen zuvor veröffentlichten Modell der chronischen Kardiomyopathie auf ein hängendes Gewicht für intermittierende Okklusion während IP 39 zu. In der Tat kann der Okklusion somit ohne die koronare durch einen Knoten verschließen erreicht werden. Darüber hinaus kann der Reperfusion des Schiffes leicht durch die Unterstützung der hängenden Gewichte, die in einem abgelegenen Lokalisierung von Herzgewebe erreicht werden.
Wir testeten dieses System systematisch, einschließlich Variation der Ischämie und Reperfusion Zeiten Vorkonditionierung Regimenter, die Körpertemperatur und genetischen Hintergründen 39. Neben Färbung Infarkt, testeten wir Troponin I (cTnI) als Marker für Myokardinfarkt in diesem Modell. In der Tat, die Plasmaspiegel von cTnI mit Infarktgrößen (R2 = 0,8) korreliert. Schließlich konnten wir in mehreren Studien zeigen, dass diese Technik sehr gut reproduzierbare Infarktgrößen Ausbeuten bei murine IP und Myokardinfarkt 6, 8, 30, 40, 41. Daher kann diese Technik hilfreich sein für Forscher, die molekularen Mechanismen in Kardioprotektion von IP mit einem genetischen Ansatz in Mäusen mit gezielter Gendeletion beteiligt zu verfolgen. Weitere Studien über Herz-IP mit Hilfe transgener Mäuse können dieses Verfahren.
Protocol
Allgemeine Bemerkungen:
Alle Arbeiten sind unter einer aufrechten Präpariermikroskop (Olympus, SZX10 mit Z-Axis Crank Post mit STU2 StandBoom Stand) durchgeführt werden und mit Hilfe eines chirurgischen Koagulator. Ventilation ist von entscheidender Bedeutung für das Verfahren und damit eine gewisse Zeit sollte bei der Auswahl des Ventilators und der Optimierung der Lüftungstechnik ausgegeben werden. Temperatur, Blutdruck und Anästhesie sollte stabil sein ganz.
1. Anästhesie, Intubation und Überwachung
- Verwenden Sie C57BL / 6 Mäusen, die mindestens 10 Wochen alt sind. Induce Narkose unter Verwendung von Natrium-Pentobarbital in einer Dosierung von 70 mg / kg Körpergewicht ip Pflege Anästhesie mit ca. 10 mg / kg / h Natrium-Pentobarbital. Seien Sie vorsichtig mit einer Überdosierung, da diese deutlich geringere könnte den Blutdruck. Re-Dosierung von Pentobarbital - auch nach Stunden-können zu schweren Anstieg der Plasmaspiegel führen. Basierend auf einer starken Beweise für Isofluran als kardioprotektive Verbindung empfehlen wir die Verwendung des "inert" und etablierte Pentobarbital in ein Modell für Myokardischämie 46-56.
- Legen Mäusen auf eine Temperatur gesteuerte beheizte Tisch (RT, Effenberg, München, Deutschland) mit einer rektalen Sonde Thermometer an thermischer Rückführung Steuerung der Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten
- Nach Narkoseeinleitung sichere Mäuse in Rückenlage, mit den oberen und unteren Extremitäten an den Tisch mit einem Klebeband und eine Naht befestigt zu den Knöcheln. Machen Sie dasselbe für den Kopf durch die Zähne. Eine ausreichende einstweilige ist für eine erfolgreiche Intubation und gut kontrollierte Chirurgie wichtig. Vor der Operation, decken Sie die Maus mit Mineralöl, das Risiko der Maus Haare Allergien zu reduzieren.
- Expose der Luftröhre operativ und führen Sie eine Intubation mit bluntpolyethylene Kanülen (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Sie müssen die Nadel stumpf in der Lage sein, sie als Mandrin verwenden.
- Ziehen Sie die Zunge heraus mit einer Pinzette und dann vorsichtig in einem 15-Grad-Winkel zum Körper hin. Auch nach der Exposition der Luftröhre und mit Hilfe eines Mikroskops kann dafür eine Ausbildung. Seien Sie sich bewusst, dass eine kleine Beschädigung der Luftröhre kann die Unfähigkeit, das Tier während der Naht lüften führen. Also, wenn Sie stoßen Atemwegsprobleme überprüfen die Luftröhre für kleine Löcher.
- Überprüfen Sie die korrekte Tubuslage durch direkte Visualisierung der Kanüle in der Luftröhre zuvor ausgesetzt über dem carina.
- Verbinden Sie den Schlauch an ein Beatmungsgerät. Wir empfehlen einen Druck kontrollierte Lüftung Technik mit einem Servo 900 C von Siemens (DRE Veterinary, USA). Die Tiere werden dann belüftet mit inspiratorischen Spitzendruck von 10 mbar, Frequenz von 110 Atemzügen / min und einem positiven endexspiratorischen Druck von 3-5 mbar mit einer FiO 2 = 0,4 sein. Einstellungen Möglicherweise müssen einige Anpassungen, die am leichtesten, indem der Lunge beim offenen Thorax Chirurgie erreicht werden kann. Stellen Sie sicher, dass die Lunge nicht zusammengebrochen oder überfordert. Trotz der Tatsache, dass die Servo 900 C als Beatmungsgerät für Menschen gebaut ist, funktioniert die Verwendung in einem Druck gesteuerter Lüfter Einstellung für die Lüftung von Mäusen ausgezeichnet.
- Führen Blutgasanalyse zur normalen Gasaustausch (Sauerstoff-Partialdruck, paO 2 von 115 ± 15 mmHg und Partialdruck von Kohlendioxid, paCO 2 von 38 ± 6 mmHg) nach 4 bis 6 Stunden Ablüftzeit mit dem i-STAT bestätigen System (Abbott, USA).
- Überwachen der Herzfrequenz mit einem EKG (zB Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland). Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz nicht unter 450 sinken. Wenn die Maus entwickelt bradicardia überprüfen Sie die Temperatur und die Narkose-Dosis / Konzentration. Xylacin / Ketamin Anästhesie induziert eine herz von 250 / min und wird daher nicht empfohlen.
- Tragen Sie eine geeignete Flüssigkeit ersetzt werden. Eine Infusion mit Kochsalzlösung 0,1 ml / Stunde über einen arteriellen und venösen Katheter vor dem Einsetzen der Ischämie durchgeführt werden soll. Auch könnte eine Kochsalzlösung Bolus von 500 ul gegeben ip vor der Operation sein. Thorakotomie kann zu einer Senkung des Blutdrucks und kann zusätzliche Kochsalzlösung boli erfordern. Nach Ischämie, könnte eine Infusionsrate von bis zu 1 ml / h notwendig sein, einen mittleren arteriellen Blutdruck über 60 mmHg zu halten und eine ausreichende Reperfusion entscheidend für Infarkt Färbung mit TTC garantieren.
- Legen Sie eine Halsschlagader (PE10, Tip OD (mm / "), Tapered> 0,024 mm/.011") für die kontinuierliche Aufzeichnung des Blutdrucks. Die Halsschlagader wird über stumpfe Präparation der paratracheal Muskeln ausgesetzt werden. Nach weiteren Exposition und sorgfältiger Vermeidung jeglicher Traumatisierung des Gewebes (insbesondere des Nervus vagus), wird ein Katheter in das Gefäß mit zwei Nähten und einer kleinen Klemme gesteckt. Befestigen Sie den Arm an den Körper, bevor Sie sezieren die Arterie zu starten. Dies legt ein längeres Stück der Arterie. Knot ganz am Ende des proximalen Teils der Halsschlagader. Bringen Sie eine größere Klammer an das Ende des Fadens zuerhalten Spannung. Stellen Sie ein weiteres Naht um die Arterie und sezieren die Arterie, die sehr distalen Ende. Hier legen einer kleinen Klemme. Verwenden Sie Mikro-Schere, eine kleine diagonale Öffnung in der Arterie geschnitten. Halten Sie die Öffnung mit einer feinen Pinzette (Dumont, WPI) und vorher die richtige Größe Katheter mit den Händen / Pinzette. Machen Sie einen Knoten mit dem zweiten Faden und sichern die Arterie. Lösen Sie die Klemme und vorab den Katheter weiter. Sichern Sie den Katheter mit mehreren Knoten und Band.
2. Technik der Okklusion
- Präparieren Sie die Haut und setzen den linken Thoraxwand mit einem stumpfen Dissektionstechnik.
- Schneiden Sie die Muskeln Brustmuskeln Majors und Jugendlichen in der Thoraxwand mit einem Brenneisen aussetzen. Durch Ziehen des Pectoralis major, fällt die Lunge, wodurch eine Zange aus dem HF-Gerät kann eingesetzt werden, und, 1-3 mm oberhalb der Lunge, eine horizontale Linie über den Rippen koaguliert werden sollte.
- Durch die Verwendung einer stumpfen Schere, schneiden Sie die Thoraxwand. Geändert Sicherheitsnadeln, wo der Fang Platte entfernt und ist das stumpfe Ende gebogen ist, werden dann zu halten, den Brustkorb zu öffnen.
- Zur Erleichterung der endgültigen Platzierung der Naht, gerinnen und schneiden Sie die Thoraxwand entlang der Membran in Richtung der unteren linken Seite des Brustkorbs.
- Expose das Herz durch Sezieren des Perikards. Um zu vermeiden, Zwerchfell-Bewegungen und den Abbau des Nervus phrenicus.
- Mit einem kleinen nassen Wattestäbchen mit einer Zange und drehen Sie das Herz auf der rechten Seite. Identifizieren Sie die linke Koronararterie (LCA) und stellen Sie sicher, dass die Lungen nicht zu aufgeblasen. Optimieren Sie die Öffnung des Thorax, um einen sicheren Halt des Herzens haben bei der Platzierung der Naht. Wenn der Blutdruck zu niedrig ist die Identifizierung könnte kompliziert werden. Zusätzliche Boli von Kochsalzlösung verbessern könnte Identifizierung der LCA. Die LCA ist eine leuchtend rote Schiff überquert das Herz horizontal (im Gegensatz zu den wiederkehrenden Venen). Manchmal ist die LCA am besten ohne ein Mikroskop gesehen. Verwenden Sie nicht zu viel Licht. Dies kann zu Reflexionen machen Visualisierung unmöglich zu trennen.
- Sobald das LCA visuell identifiziert wird, statt einer 8,0 Nylonfaden (Prolene, Ethicon, Notiefies, USA) um die LCA. Für die Zwecke der intermittierenden LCA Okklusion, haben wir eine chronische Modell der Kardiomyopathie 42 unter Verwendung einer hängenden Gewichts-System.
- Thema der Naht durch ein kleines Stück Plastik (PE-10-Schlauch) mit stumpfen Kanten und befestigen Sie zwei kleine Gewichte (1g, z. B. die Verwendung Eppendorf-Röhrchen mit Wasser gefüllt) an jedem Ende. Mit dem frei hängenden Gewichte über eine Stange, sollte der LCA sofort verschlossen werden. Darüber hinaus, wenn das Gewicht entlastet wird, ist LCA Okklusion auf einmal beendet. Erfolgreiche LCA Okklusion sollte durch eine sofortige Farbänderung des Schiffes von hellrot bis dunkel violett, Veränderung der Farbe des Herzmuskels durch das Schiff (von hellrot bis weiß) und das Vorhandensein von ST-Erhebungen im EKG geliefert bestätigt werden. Während der Reperfusion, die Änderungen der Farbe sofort verschwinden. Halten Sie das Herz nass mit einem 37 ° C, Kochsalzlösung getränkt, ein Stück Watte in (siehe auch Abbildung 1).
- Wählen Sie Ihre Ischämiezeit nach Ihrem primären Interesse. In der Tat, für Studien über kardioprotektive Wirkung von IP, wäre es ideal, eine Ischämie zu Zeit mit einem in Infarktgrößen von ca. 30 bis 40% der AAR verbundenen verwenden. So wäre es möglich, Änderungen in beide Richtungen, z. B. kleinere Infarktgrößen mit Herz-IP oder größer Infarktgrößen mit einem experimentellen therapeutischen oder ein bestimmtes Gen Löschung zu demonstrieren. Darüber hinaus Mäuse mit einer Infarktgröße von weniger als 50% in der Regel überleben den Versuch, während Infarkt Größen von 60 bis 80% häufig nicht überlebt haben und die Tiere sterben, bevor der Reperfusion Zeit abgeschlossen ist. Mit unserem Modell 10 Minuten einer Myokardischämie durch 2 Stunden Reperfusion führen zu einer Infarktgröße von 3,5 ± 1,3%, gefolgt von der AAR. Im Gegensatz dazu eine Ischämie von 60 Minuten ergibt eine mittlere Infarktgröße von 42 ± 5,2% der AAR (p <0,01) 39. So betrachten wir eine 60 Minuten der Ischämie als ideal, um Änderungen in beide Richtungen zu studieren. Dennoch müssen Sie eventuell die Ischämiezeit in Gen gezielt Mäuse einrichtet mit einem sever Phänotyp.
- Wählen Sie die richtige Reperfusion Zeit. Die Reperfusion Zeit ist von entscheidender Bedeutung für die TTC-Färbung. Die farblosen Farbstoff ist ein Backstein-rot gefärbten Niederschlag durch Dehydrogenasen in der Gegenwart des Co-Enzym NADH reduziert. Absterbenden Zellen verlieren ihre Fähigkeit, NADH und sind daher als blasse Bereiche innerhalb der rot gefärbten vitales Myokard abgegrenzt bleiben. Infarktgröße Abgrenzung von TTC setzt voraus, dass NADH wurde vollständig von den nekrotischen Bereich gewaschen. Allerdings, wenn Reperfusion nicht lang genug ist, kann die Infarktgröße Abgrenzung von TTC-Färbung in einer Unterschätzung der tatsächlichen Infarktgröße 43 Resultat. In unseren Händen, nach einer Ischämiezeit von 60 min, die Infarktgröße Messung von 11,5 ± 4,5% gestiegen nach 30 Minuten auf 42,2 ± 5,1%nach 120 Minuten. Kein weiterer Anstieg der Infarktgröße konnte mit mehr Reperfusion Zeiten (240 Minuten) 39 nachgewiesen werden. So haben wir eine 2-stündige Reperfusion Zeitraum, scheint auch im Rahmen der kardialen Enzyme determination.If man bedenkt, Ischämie Vorkonditionierung angemessenen empfehlen, empfehlen wir 4 Zyklen von IP (5 min Ischämie, 5 min Reperfusion), gefolgt von einer Ischämiezeit von 60 min und einer Reperfusion von 2 Stunden. Unter diesen Bedingungen war IP mit einem 3,2-fachen Reduktion der Infarktgröße von 42,2 ± 5,1% auf 13,3 ± 3,3% der AAR 39 zugeordnet. Aufgrund der hängenden Gewichts-System könnten verschiedene Vorkonditionierung Regimenter leicht angewendet werden.
3. Bestimmung der Fläche At Risk (AAR) und Myokardinfarkt Größe
Nach der Induktion eines Myokardinfarktes (mit oder ohne IP), ist der Bereich von der LCA (gefährdete Gebiet, AAR) und die Größe des Infarktes selbst bestimmt mit einer Maltechnik wird durchblutet. Anschließend wird Infarkt dann als Prozentsatz des Myokardinfarkts im Vergleich zu den AAR berechnet werden. Um dies zu tun, ist eine zuvor beschriebene Doppel-Maltechnik mit blauen und Triphenyltetrazoliumchlorid Evans (TTC) 44 verwendet.
- Bestimmen Sie die AAR durch retrograde Injektion von 1% blauen Farbstoff Evans in die Aorta während der LCA ist verschlossen. Alternativ, wenn ein Katheter in carotis Ort ist, verwenden Sie diese Route für Evans-Blau-Injektion. Evans-Blau färbt alle Herzmuskelgewebe blau, mit Ausnahme der AAR. Es ist entscheidend für diesen Schritt, um Luftblasen im Katheter zu vermeiden, wie sie in das Herz-Kreislauf injiziert würde und verhindern, dass Evans-Blau-Färbung. Vor der Evans-Blau-Färbung möchten Sie vielleicht Blut für Herz-Enzym-Messungen zu sammeln. Darüber hinaus ist die Entfernung von Blut durch die Injektion von 5 ml Kochsalzlösung über einen Aorten-oder carotis Katheter empfohlen.
- Excise Herzen und waschen in eiskaltem 0,9% iger Kochsalzlösung
- Embed in 2% Agarose. Verwenden Sie kein heißes Agarose seit dieser erfolgreichen Färbung verhindern.
- Nach 30 Minuten bei +4 ° C (oder 15 Minuten -20 ° C), schneiden das Herz in Scheiben von 1 mm unter Verwendung einer Herz-Matrix oder Mikrotom. Wenn Sie das Herz in den Gefrierschrank Platz zu vermeiden trocken Einfrieren, die nicht gefärbt Herzen führen wird.
- Inkubieren Sie die Schnitte mit 1% TTC bei 37 ° C für 10 min mit einer 15 ml blaue Kappe in einem Wasserbad. Dies ermöglicht dem Infarktareal als eine weiße Fläche abgegrenzt werden, während lebensfähiges Gewebe Flecken rot.
- Fixieren Sie die bunten Scheiben mit 10% fomaldehyde über Nacht. Dadurch ist die Infarktareal besser kontrastiert die Verbesserung der Qualität der Bilder.
- Die Fläche at-Risk (AAR) und der Infarktgröße mittels Planimetrie mit der NIH-Software-Image 1,0 45.
- Berechnen Sie den Prozentsatz der Infarktareal aus dem Bereich gefährdet.
4. Cardiac Enzyme Measurement
Aufgrund von Einschränkungen mit TTC-Färbung verbunden, empfehlen wir als zusätzliche Anzeige für Herzinfarkt Schwere der Bestimmung von kardialem Troponin I (cTnI) im Serum von Mäusen. Das Blut wird aus der Pfortader und Serum cTnI Werte erhalten werden dann mit einer schnellen quantitative cTnI-Assay (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA) bestimmt.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. (A) Modell der kardialen IP mit einem hängenden Gewicht System der koronaren Okklusion. Diese Technik erfordert nicht einen Knoten für Koronarokklusion. (B, C) Chirurgische Setup. (D) Bild von einer Maus Herz mit der linken Koronararterie (LCA, Pfeile) nach Okklusion. Visuelle Überprüfung der LCA ist notwendig für die Ligation und ischämische Präkonditionierung in Mäusen. Der 8,0 Nylonfaden ist rund um die LCA 1-2 mm unterhalb der linken Ohrmuschel platziert. Die Naht wird durch einen kleinen Plastikschlauch (*) eingefädelt. Das Ende jeder Naht mit einem kleinen Gewicht (1g) angebracht ist und die Naht wird über Stangen auf beiden Seiten platziert. (E) Bestimmung der AAR nach LCA Okklusion und retrograde Injektion von blauem Farbstoff Evans in die Aorta. Die AAR ungefärbt bleibt, während der Rest des Herzmuskels ist blau. Nach der Inkubation von AAR Gewebe mit TTC, das Infarktareal gebeizt weiß, während lebensfähiges Gewebe rot gefärbt.
Discussion
Die vorliegende Studie beschreibt eine neue Technik, bei der IP in einer intakten Mausmodell mit einem hängenden Gewicht und damit die Vermeidung einer koronaren Okklusion durch einen Knoten. In der Tat zeigt diese Studie sehr gut reproduzierbare Infarktgrößen und Herz-Schutz von IP und minimiert so die Variabilität mit Knoten-basierte Koronarokklusion Modelle verbunden. Die Ermittler, die ein Studium Kardioprotektion von IP in Mäusen überlegen können von diesem Modell profitieren.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die vorliegenden Studien sind von National Heart, Lung, and Blood Institute Stipendium R01-HL0921, R01-DK083385 und R01-HL098294 HK Eltzschig, die 1K08HL102267-01 bis T. Eckle und Stiftung für Anästhesie Bildung und Forschung Zuschüsse an T. unterstützt Eckle und HK Eltzschig und American Heart Association Grant T. Eckle und HK Eltzschig und eine Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Forschungsstipendium an M. Koeppen. Wir bedanken uns bei Shelley Eltzschig für das Kunstwerk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| TTC | Sigma-Aldrich | 17779 Fluka | 1.5 % in PBS |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | 10g in 1 L PBS |
| Insyte 22 G | BD Biosciences | n/a | |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| Heart Matrix | Zivic Instruments | # HSMS001 | |
| Siemens 900 C | DRE Veterinary | # 336 | refurbished |
| dissecting microscope (SZX10 ) | Olympus Corporation | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Blood pressure device | Cyber Sense, Inc | BPM02 | |
| I STAT | Abbott Laboratories | n/a |
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