Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Resumo

Óptico com resolução de microscopia fotoacústica (OR-PAM) é uma tecnologia emergente capaz de imagem absorção óptica contrastes In vivo Celulares com resolução e sensibilidade. Aqui, fornecemos uma instrução visualizado em protocolos experimentais de OR-PAM, incluindo o sistema de alinhamento do sistema, configuração, típico In vivo Procedimentos experimentais, e esquemas de imagens funcionais.

Resumo

Microscopia óptica, fornecendo informações valiosas a nível celular e organelas, tem sido amplamente reconhecida como uma tecnologia que permite biomédica. Como os principais pilares da in vivo tridimensional (3-D) microscopia óptica, microscopia de fluorescência single-/multi-photon e tomografia de coerência óptica (OCT) têm demonstrado a sua sensibilidade a contrastes extraordinários de fluorescência e de espalhamento óptico, respectivamente. No entanto, o contraste de absorção óptica dos tecidos biológicos, que codifica a informação fisiológica / patológica essencial, ainda não foi avaliável.

O surgimento de photoacoustics biomédica levou a um novo ramo da microscopia óptica, microscopia óptica resolução fotoacústica (OR-PAM) ^1, onde a irradiação óptica é voltado para o limite de difração para alcançar ^um celular ou resolução mesmo nível subcelular ^duas laterais. Como um complemento valioso para as tecnologias existentes microscopia óptica, OR-PAM traz em pelo menos duas novidades. Primeiro e mais importante, OR-PAM detecta contrastes absorção óptica com extraordinária sensibilidade (ou seja, 100%). Combinando OR-PAM com microscopia de fluorescência com ³ ou óptico-espalhamento baseado ⁰⁴ de outubro (ou com ambos) fornece abrangente propriedades ópticas dos tecidos biológicos. Segundo, OR-PAM codifica absorção óptica em ondas acústicas, em contraste com os processos de pura óptica em microscopia de fluorescência e outubro, e fornece fundo sem detecção. A detecção acústica em OR-PAM reduz os impactos da dispersão óptica em degradação de sinal e, naturalmente, elimina as interferências possíveis (ou seja, crosstalks) entre a excitação e detecção, que é um problema comum em microscopia de fluorescência devido à sobreposição entre os espectros de excitação e de fluorescência.

Único para a imagem latente de absorção óptica, OR-PAM demonstrou ampla aplicações biomédicas desde sua invenção, incluindo, mas não limitado a, neurologia ^{5, 6,} oftalmologia ^{7, 8,} biologia vascular ⁹ e ¹⁰ de dermatologia. Neste vídeo, nós ensinamos a configuração do sistema e alinhamento de OR-PAM, bem como os procedimentos experimentais para a imagem in vivo microvascular funcional.

Protocolo

1. Configuração do sistema

1. Irradiação óptica
   1. Fonte de radiação óptica: um diodo-bombeada de estado sólido pulsado laser (INNOSLAB, Edgewave) e um laser de corante (CBR-D, Sirah).
   2. A saída do feixe laser (largura de pulso: 7 ns) é focalizado por uma lente condensadora (LA1131, Thorlabs) para passar através de uma pinhole 50 mícrons (P50C, Thorlabs).
   3. O pinhole é posicionado um pouco longe do foco da lente condensadora para coincidir com o diâmetro pinhole com o diâmetro do feixe fundamentais de modo eficaz para a filtragem espacial.
   4. O feixe filtrado é atenuado por um filtro de densidade neutra (NDC-50C-2M, Thorlabs) e, em seguida, acoplada em uma fibra óptica monomodo (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
   5. A saída de fibra enche a abertura traseira de uma objetiva de microscópio (RMS4X, Thorlabs) para atingir um foco de difração limitada óptica de ~ 2,6 mM no comprimento de onda de 570 nm.
2. Detecção ultra-sônica
   1. Transdutor de ultra-som: 50-MHz centrais freqüência (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
   2. O transdutor de ultra-som é acoplado a um home-made combinador de feixe acústico-ótico ¹¹ para detecção ultra-sônica, que está alinhada coaxialmente com a irradiação de difração limitada óptica.
   3. Uma cavidade esférica é um terreno fora do fundo do combinador para produzir uma lente acústica. Esta lente acústica tem uma abertura numérica de 0,5 em água e dá um diâmetro acústico focal de 43 mM na freqüência central de 50 MHz.
   4. Os focos visuais e acústicos estão alinhados confocally para maximizar a sensibilidade de detecção.
3. Acoplamento acústico
   1. Acoplamento ultra-sônico seca é empregada para evitar a submersão em água animais experimentais, que foi utilizado no início de sistemas de imagem fotoacústica ^12.
   2. Uma janela de imagem é aberta no fundo de uma placa de Petri (9 cm de diâmetro) e é selado com uma membrana de polietileno de ultra-som e opticamente transparentes.
   3. Gel ultra-sônico (Image Clear, SonoTech) entre a membrana de polietileno e do objeto a ser fotografado casais a onda gerada fotoacústica do objeto para a placa de Petri, e água deionizada na placa de Petri casais ainda mais a onda até a cabeça submersa imagem OR-PAM .
4. Eletrônica
   1. O sinal fotoacústico detectada pelo transdutor de ultra-som é amplificado por dois amplificadores em cascata (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
   2. O sinal amplificado é digitalizada por uma aquisição de dados 14-bit (DAQ) bordo (CompuScope 14200, Gage Ciências Aplicadas) a uma taxa de amostragem de 200 MS / s.
5. Digitalização esquema
   1. Bidimensional (2-D) de varredura da cabeça de digitalização de imagens OR-PAM ao longo do plano (xy) horizontal é controlada por um computador pessoal, o que desencadeia tanto na placa DAQ eo laser da bomba. O sinal de disparo é sincronizado com o sinal de clock-out da placa DAQ.
   2. O eixo rápido do scanner 2-D é definida como a direção da varredura transversal (B-scan).
   3. Uma seqüência de B-scan imagens podem ser adquiridas por traduzir a imagem de cabeça ao longo do eixo lento para formar uma imagem volumétrica, que pode ser visto tanto em uma renderização 3-D direta ou em uma projeção 2-D amplitude máxima (MAP) de imagem .

2. Alinhamento do sistema

1. Use pulso-eco ultra-som e um refletor ultra-som para determinar a posição do plano focal acústica (ou seja, o tempo de atraso do sinal de gatilho para o sinal de pulso-eco ultra-som no máximo). Este passo é necessário para ser realizada apenas uma vez quando a construção do sistema de OR-PAM.
2. Maximizar a eficiência de acoplamento da fibra monomodo.
3. Aplique gel ultra-som em cima de um objeto opticamente absorvente (por exemplo, um pedaço de fita preta) e anexá-lo delicadamente debaixo da janela de imagem em placa de Petri com água deionizada.
4. Baixar a cabeça de imagens na água, e remover as bolhas de ar presas sob a lente acústica.
5. Ajustar a cabeça de imagem até que o sinal fotoacústico do objeto absorver é a partir do plano focal acústico, que pode ser julgado a partir do atraso acústico.
6. Ajustar a posição vertical (ou seja, a posição z) da objetiva do microscópio para maximizar a amplitude do sinal fotoacústico gerado a partir do objeto plano. A amplitude do sinal maximizada sugere que o foco óptico está alinhado com o foco acústica na direção vertical.
7. Ajustar as posições horizontal (posições ou seja, x, y) da objetiva do microscópio até que o sinal fotoacústico gerado a partir do destino mostra um padrão simétrico. A simetria sugere que o foco óptico está alinhado com o foco acústica na direção horizontal.
8. Repita os passos 2.6 e 2.7 até que o sinal fotoacústico é otimizado em ambos os simetria e amplitude.

3. A sa procedimento experimental mple-in vivo OR-PAM do mouse ouvido vasculatura

1. Esta etapa não é necessária para ratos nude. Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de um cocktail [receita: 1 ml de ketamina (100 mg / ml), 0,1 ml de xilazina (100 mg / ml), e 8,9 ml de soro; dosagem: 0,1 ml/10 g]. Raspar o cabelo no ouvido, e ainda depilar os cabelos residual com Surgi Cream (Categoria #: 82565, American International Industries) antes de limpá-lo com água deionizada. Note-se que tais depilação pode irritar um pouco a vascularização da pele e, assim, é melhor realizada 24 horas antes do experimento planejado.
2. Ligue o sistema a laser fotoacústica, e verificar o alinhamento do sistema.
3. Anestesiar o rato com 3% de isoflurano vaporizado pelo gás inalação (a taxa de fluxo típico é 1,0-1,5 l / min, dependendo do peso corporal do animal), e manter a anestesia com isoflurano a 1% durante todo o experimento. Médico-grade do ar é recomendada como o gás de inalação para manter o mouse no estado fisiológico normal.
4. Transferir o mouse para um estágio estereotáxica, e controlar a sua temperatura corporal a 37 ° C com uma almofada de aquecimento.
5. Achatar o ouvido do rato sobre uma placa de plástico e aplique uma camada de gel de ultra-som em cima da orelha. Evite bolhas de interceptação no interior do gel. Em seguida, coloque o ouvido na janela de imagem e lentamente eleve a fase animal até os contatos de ultra-som gel na parte inferior da membrana de polietileno. De contato gelatinosas é necessário porque pressionar a orelha contra a membrana pode afetar o fluxo de sangue no ouvido.
6. Pinça um oxímetro de pulso para a perna do mouse ou a cauda para monitorar seu estado fisiológico e aplique pomada para os olhos para evitar ressecamento e danos acidentais a laser para os olhos mouse.
7. Baixar a cabeça de imagens até a lente acústica é imerso em água deionizada, e remover as bolhas de ar presas sob a lente acústica.
8. Verificar a influência do laser para se certificar de que está dentro dos padrões de laser de segurança da American National Standards Institute ^13. A influência do laser não deve exceder 20 mJ / cm ^2, que se traduz em 80 nJ de laser de pulso de energia quando o feixe de laser é focado em 150 M abaixo da superfície da pele.
9. Definir a laser para o modo de external-gatilho e começar a digitalizar julgamento. Ajustar a posição z da cabeça de imagem até o mais forte sinal fotoacústico é a partir do plano focal acústico.
10. Conjunto correto parâmetros de digitalização e começar a aquisição de imagem formal.
11. Após a experiência, desligue o laser, levante a cabeça de imagem para fora da água deionizada, menor o estágio animal para soltar o mouse, limpar o ouvido do rato com água deionizada, desligue o sistema de anestesia eo controlador de temperatura, e descarregar o mouse desde a fase de estereotáxica.
12. Se imagens repetitivas é necessário, coloque o mouse em uma incubadora com a temperatura ambiente a 37 ° C. Devolver o mouse para a instalação de animais depois que acorda naturalmente. Caso contrário, siga os protocolos animal Eutanásia e descartá-la.

4. Funcional ou-PAM de concentração total e saturação de oxigênio da hemoglobina

1. Oxihemoglobina (HBO ₂₎ e desoxihemoglobina (HBR) são as duas principais formas de hemoglobina, a fonte endógena fotoacústica predominante na faixa visível do espectro. HbO ₂ e HBR têm espectros de absorção óptica distinta e, portanto, podem ser espectralmente diferenciadas para quantificar tanto a concentração total (HBT) e saturação de oxigênio (SO ₂₎ de hemoglobina ^5. Aqui estão duas diretrizes para ajudar a selecionar comprimentos de onda ópticos adequada para o SO ₂ medidas:
2. Comprimentos de onda deve ser selecionado dentro do Q banda do espectro de absorção da hemoglobina (ou seja, 550-600 nm) para garantir uma relação sinal-ruído suficiente e uma penetração adequada.
3. Comprimentos de onda onde os coeficientes de absorção da HBO ₂ e HBR tem uma diferença acentuada (por exemplo, HBR-561 nm dominante e HBO _2-dominante 578 nm) são recomendados.

Além de SO _2, HBT pode ser calculado pela adição [HBR] e [HbO _2] juntos, ou ele pode ser medido diretamente em comprimentos de onda do espectro isosbestic extinção molar coeficiente de hemoglobina (por exemplo, 530 nm, 545 nm, 570 nm, e 584 nm) ^14, onde HBR e HBO ₂ têm iguais coeficientes de extinção molar.

5. Resultados representativos:

Mostrado na Figura 1 é a anatomia vascular e sO ₂ em uma orelha de rato vivo nua fotografada pela dupla de comprimento de onda (561 e 570 nm) OR-PAM. O tempo de aquisição típicos imagem para comprimento de onda duplo para _duas medições de uma região de interesse (tamanho da imagem: 10 mm x 10 mm; tamanho do passo: 2,5 M x 5 mm) é de aproximadamente 80 min.

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Figura 1. Em microscopia óptica com resolução vivo fotoacústica. Imagens MAP de (A) a concentração de hemoglobina total mostrando a anatomia vascular (adquirida a 570 nm) e (B) a saturação de oxigênio da hemoglobina (adquirida em 561 nm e 570 nm) em uma orelha do camundongo nude. (C) Close-up da região encaixotado no painel (A). A barra de escala no painel (A) aplica-se tanto (A) e (B).

Discussão

Neste vídeo, nós fornecemos um instruções detalhadas sobre os protocolos experimentais de OR-PAM, incluindo configuração do sistema, alinhamento do sistema, e típica procedimentos experimentais. PAM OR-label-free, não-invasivo tem permitido estudos de funcionamento microvascular e metabolismo em uma base única capilar e, portanto, tem potencial para expandir nossa compreensão da microcirculação relacionados com fisiologia e patologia. Microphotoacoustics já está fabricando este sistema OR-PAM.

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