Summary
Inositol pyrofosfaten spelen een belangrijke rol in de menselijke ziekten zoals kanker, diabetes en obesitas, maar het exacte werkingsmechanisme is een kwestie van geschil. Het gebrek aan commercieel beschikbare inositol pyrofosfaten maakt gedetailleerde studies problematisch. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het produceren en isoleren milligram inositol pyro.
Abstract
Myo-inositol is aanwezig in de natuur of ongewijzigde of in meer complexe gefosforyleerde derivaten. Van de nieuwste, de twee meest voorkomende in eukaryote cellen zijn inositol pentakisphosphate (IP 5) en inositol hexakisphosphate (fytinezuur of IP-6). IP en IP 5 6 zijn de voorlopers van inositol pyrofosfaat moleculen die een of meer pyrofosfaat obligaties 1 bevatten. Fosforylatie van IP 6 genereert diphoshoinositolpentakisphosphate (IP-7 of PP-IP 5) en bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 of (PP) 2-IP 4). Inositol pyrofosfaten zijn geïsoleerd van alle eukaryote organismen tot nu toe bestudeerd. Daarnaast zijn de twee verschillende klassen van enzymen die verantwoordelijk zijn voor de inositol pyrofosfaat synthese sterk geconserveerd doorheen de evolutie 2-4.
Het IP-6 kinases (IP 6 KS) bezitten een enorme katalytische flexibiliteit, het omzetten van IP en IP 5 6 tot en met PP-IP en IP-4 7 respectievelijk vervolgens door het gebruik van deze producten als substraten, bevordering van het genereren van meer complexe moleculen 5,6 . Onlangs werd een tweede klasse van pyrofosfaat het genereren van enzymen die in de vorm van de gist-eiwit VIP-1 (ook wel aangeduid als PP-IP 5 K), die in staat is om IP-6 om te zetten in IP-7 en 8 IP 7,8.
Inositol pyrofosfaten reguleren veel ongelijksoortige cellulaire processen zoals insuline secretie 9, de lengte van telomeren 10,11, chemotaxis 12, vesiculair transport 13, fosfaat homeostase 14 en HIV-1 gag los 15. Twee mechanismen van acties die zijn voorgesteld voor deze klasse van moleculen. Ze kunnen invloed hebben op cellulaire functie door allosterically interactie met specifieke eiwitten, zoals AKT 16. Als alternatief kan de pyrofosfaat groep kan een fosfaat doneren aan pre-gefosforyleerde eiwitten 17. Het enorme potentieel van dit onderzoek gebied wordt bemoeilijkt door het ontbreken van een commerciële bron van inositol pyrofosfaten, dat veel wetenschappers is het voorkomen van het bestuderen van deze moleculen en deze nieuwe post-translationele modificatie. De methoden die momenteel beschikbaar zijn inositol pyrofosfaten isoleren vereisen geavanceerde chromatografische apparatuur 18,19. Deze procedures gebruik van zure omstandigheden die kunnen leiden tot inositol pyrofosfaat degradatie 20 en dus tot een slechte herstel. Bovendien is de omslachtige post-column ontzouten procedures beperken het gebruik ervan aan gespecialiseerde laboratoria.
In deze studie beschrijven we een weinig veeleisende methode voor het opwekken, isolatie en zuivering van de producten van de IP 6-kinase en PP-IP 5-kinases reacties. Deze methode was mogelijk door het vermogen van polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) op te lossen zeer gefosforyleerd inositol polyfosfaten 20. Volgende IP-6 K1 en PP-IP 5 K enzymatische reacties met behulp van IP-6 als de ondergrond, werd PAGE gebruikt om de gegenereerde inositol pyrofosfaten die vervolgens werden geëlueerd in water te scheiden.
Protocol
1. Enzymatische reactie - dag 1 (1 uur in de namiddag)
- De eerste stap is de voorbereiding van 10-20 onafhankelijke enzymatische reacties waarin IP-6 K1 of VIP1 IP-6 om te zetten in de pyrophosphorylated isovormen.
- We maken gebruik van His-IP 6 K1 en GST-Vip1 enzymen gezuiverd van E. coli volgens het protocol eerder beschreven 17,18.
- Bereid 50 pi reacties met 1X reactie buffer (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM creatinefosfaat (PCR), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg zout), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 ug His-IP 6 K1-of GST-Vip1. Het volume aanpassen met MiliQ DDH 2 O.
- Kort draaien de reactie en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht met rotatie.
2. Polyacrylamide gel gieten en laden - dag 2 (4 uur in de middag)
- De polyacrylamide gel is opgesteld op basis van 24 cm lang, 18 cm breed glazen platen en 1,5 mm breed afstandhouders. Meestal een 16 rijstrook of een voorbereidende enkele rijstrook kam wordt gebruikt.
- Maak een mix (50 ml / gel) met de volgende: 35,5% (w / v) Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1, 1X Tris / Boraat / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) ammoniumpersulfaat (APS ), 0,05% (w / v) TEMED. Giet de mix tussen de pre-gegoten glazen platen, plaatst u de kam en laat polymeriseren gedurende 30-60 minuten bij RT.
- Nadat de gel is gepolymeriseerd, overdracht van de apparatuur aan de koude kamer en pre-run in 1x TBE voor ongeveer 30-60 minuten op 200-300 Volt.
- Voeg 1X van OrangeG kleurstof (10 mM Tris-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, 30% glycerol, 0,1% OrangeG) naar elke reactie. Bereid een monster dat 2 nmol van IP-6 te laden als een standaard controle.
- Was elke well grondig met stromend buffer met behulp van een injectiespuit en een 21G naald om een neerslag te verwijderen, dan laadt u de gel. Vermijd het laden aan de zijkant putten.
- Laat de gel 's nachts op 450-550 Volt (7 MAMP / gel), tot de OrangeG kleurstof band is in de laatste 10 cm van de onderkant van de gel.
3. Isolatie van IP 7 - dag 3 (4 uur) en dag 4 (6-7 uur SpeedVac droogproces)
- Demonteer de gel apparaat en verwijder voorzichtig een glasplaat het verlaten van de gel op de andere. Snijd een klein deel van de gel van net boven de OrangeG kleurstof band tot op de bodem met het IP-6-norm en een monster baan, zoals weergegeven in figuur 1.
- Vlekken op de afgesneden gedeelte van de gel met Toluidine Blue (0,1% (w / v) toluïdineblauw, 20% (w / v) methanol, 2% (w / v) glycerol) voor een paar minuten (1-3 min) of totdat de inositol pyrofosfaat band verschijnt. Leg de glazen plaat die eerder terug verwijderd op de top van de gel op de ongekleurde gel niet uitdroogt.
Het IP-7 band zichtbaar moet zijn, omdat het draait iets trager dan het IP-6-norm. ATP, die loopt sneller dan de IP-6, moet ook zichtbaar zijn (Figuur 1). Breng de gekleurde deel van de gel in een de-kleuroplossing (20% (w / v) methanol) voor een paar minuten weg te wassen overtollige van Toluidine Blue en plaats de gel met de ongekleurd gel.
Als visualisatie van hogere pyrophosphorylated inositol isovormen (IP-8 en IP-9) is vereist, vlekken op de gel met Toluidine Blue kleuroplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens wegspoelen van de Toluidine Blue met de de-kleuroplossing voor ongeveer 15 minuten.
- Met een scheermesje snijd de IP-7 band op de onbesmet gedeelte van de gel met als referentie het IP-7 migreren positie bepaald met de gekleurde gel (figuur 1).
- Zet het IP-7 band die werd uit de gel gesneden op een 15 mL buis en voeg 10 ml MilliQ DDH 2 O. Zet buizen in rotatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de vloeistof te verwijderen overmaat van TBE en microscopische deeltjes acrylamide.
- Vervolgens voeren twee uitdroging-hydratatie cycli. Voeg 5 ml van 50% (w / v) methanol op de buis met de gel met IP-7 en draaien bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Breng de gel slice naar een nieuwe 15 ml buis met 5 ml van MilliQ DDH 2 O en draai bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Gooi de methanol en MilliQ H 2 O uit de buizen. Herhaal de uitdroging-hydratatie cyclus nog een keer door opnieuw de overdracht van de polyacrylamide gel in de buizen van 15 ml eerder gebruikte. Een van de wassingen kan worden uitgevoerd 's nachts.
- Om zich te concentreren de geëlueerde IP-7, samen droog de 10 ml (5 ml MilliQddH 2 O en 5 ml 50% (w / v) methanol) met behulp van een SpeedVac verwarmd op 60 ° C.
- Nadat de monsters zijn bijna droog, de overdracht van de resterende vloeistof (300-600 ul) om A1.5 ml centrifugebuis en spin gedurende 2 minuten bij 5000 tpm.
- Verzamel supernatant en overbrengen naar een frisse 1,5 ml centrifugebuis; verlatende onderste 20 tot 30 pi, omdat het kan acrylamide deeltjes bevatten.
- Indien nodig blijft het droogproces met behulp van een onverwarmde SpeedVac. Het herstel van IP-7 is drastisch verminderd indien de monsters helemaal droog is, dan beëindigen het droogproces wanneer de monsters bij de volume van 100-300 ul.
4. Bepaling van de IP-7 concentratie en zuiverheid.
- Gebruik 2-5 pi van de herstelde IP-7 monster om te draaien op een PAGE gel, vergelijkbaar met de artikelen 2.2-2.5. Plaats enkele verdunningen van IP-6 (dat wil zeggen 0,5, 1, 2, 4 nmol) als de concentratie standaard en 4 nmol van Poly-P marker. Na het uitvoeren van de gel, visualiseer de inositol pyrofosfaat isovormen door kleuring en de-kleuren van de hele gel met Toluidine Blue oplossing, volgens de procedure beschreven in paragraaf 3.2 (figuur 2A).
- Na Toluidine kleuring, kunnen de concentraties worden bepaald door het scannen van de gel en het vergelijken van de verschillen in intensiteit tussen 6 IP en IP-7, met behulp van imaging-software zoals Image-J, zoals weergegeven in figuur 2B.
5. Representatieve resultaten:
De voorbereidende enzymatische omzetting van IP-6 naar 7 met behulp van IP-IP 6 K1 en VIP1 enzymen kan eenvoudig worden opgelost met behulp van PAGE-analyse (figuur 1). Het laden van IP-6 als een grootte van controle, samen met Toluidine Blue gel vlekken maakt de identificatie van de pyrophosphorylated derivaten, want ze draaien langzamer, afhankelijk van het aantal fosfaatgroepen aanwezig op de inositol ring. De hierboven beschreven procedure maakt het mogelijk eenvoudig zuivering van IP-7. De analyse van de gezuiverde inositol pyrofosfaat door PAGE onthulde de zuiverheid van onze IP-7 (Figuur 2A). Interessant is dat de 1/3PP-IP 5 isomeer van IP-7 product van VIP1 migreert iets trager dan de 5pp-IP 5 isomeer van IP-7 die wordt gegenereerd door de IP-6 K1. Het gebruik van IP-6-normen mogelijk te maken een eenvoudige kwantificering van de concentratie van de gezuiverde IP-7 (Figuur 2B). Voor het gebruik van IP-7 voor verdere experimenten, kan de biologische activiteit te worden beoordeeld
(Figuur 3). 5pp-IP 5 is geïncubeerd met VIP1 en met de IP-7 fosfatase DDP1 (diphosphoinositol polyfosfaat phosphohydrolase). Routinematig wordt het gezuiverde IP-7 omgezet naar IP-8 door VIP1 en IP 6 door DDP1 (figuur 3).
Figuur 1:. Toluidine kleuring van PAGE en isolatie van de IP-7 band The gedeelte van de gel met de standaard (IP 6) werd gesneden en gekleurd met behulp van een Toluidine Blue oplossing. De drie bands vertegenwoordigen (van boven naar onder) 7 IP, IP 6 en ATP. Het gekleurde deel van de gel werd vervolgens uitgelijnd met de rest van de gel. Hierdoor kan de lokalisatie van het gedeelte van de gel met IP-7, die vervolgens kan worden gesneden en gezuiverd (gestippelde kader).
Figuur 2: PAGE-analyse van IP-6 K1 en VIP1 reactieproducten. A) Analyse van de IP-6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) door Toluidine Blue kleuring was gebruikt om de IP-7 concentratie gezuiverd van zowel IP-6 K1 (5pp-IP 5) en VIP1 (1/3PP-IP te bepalen 5) reacties. B) Scatter plot analyse om de concentratie van de gezuiverde IP-7 te bepalen. Concentraties werden bepaald volgens band intensiteit, berekend met behulp van ImageJ software, ten opzichte van vooraf bepaalde hoeveelheden van IP-6. De X-as staat voor intensiteit, de Y-as staat de concentratie uitgedrukt in nmol.
Figuur 3:. Analyse van IP zeven biologische activiteit Om de kwaliteit van het gezuiverde IP-7 bepalen we geïncubeerd 5pp-IP 5 (IP-6 K1 gegenereerd IP-7) met VIP1 of met de IP-7 fosfatase DDP1 en vervolgens opgelost de reactie op PAGE. De DAPI en Toluidine vlekken bleek de verwachte productie van IP-8 door VIP1 en de conversie van IP-7 om IP-6 door DDP1.
Discussion
Het gebruik van inositol pyrofosfaat in de biochemie wordt ernstig beperkt door de commerciële onbeschikbaarheid van dergelijke verbindingen en de slechte gevoeligheid van de bestaande detectiemethoden. De combinatie van pagina, die de scheiding van moleculen bezitten een verschillend aantal fosfaatgroepen, en Toluidine Blue (figuur 1), een metachromatische kleurstof die bindt aan fosfaat-groepen, maakt maakt het eenvoudig opsporen van inositol pyrophoshate isovormen het openen van nieuwe wegen van onderzoek 20.
De beschreven gebruik van de PAGE-technologie om inositol pyrofosfaat producten van de enzymatische reactie te zuiveren uitgevoerd outby ofwel IP-6 K1 of VIP1 is een eenvoudige, economische en betrouwbare methode die het mogelijk maakt voor de productie van grote hoeveelheden van hoge kwaliteit IP-7. De hierboven beschreven methode is niet beperkt tot de eenvoudige zuivering van IP-7, maar kleine wijzigingen van de beschreven protocol kan de zuivering van een andere reeks van inositol pyro mogelijk te maken. Hogere gefosforyleerd inositol pyrofosfaat isovormen, met meer dan acht fosfaat groepen kunnen worden gedetecteerd met behulp van IP-7 of verschillende hoeveelheden van IP-6 als een substraat 20,6. Deze inositol pyrofosfaten kan worden gedetecteerd door het verhogen van de lengte van de kleuring procedure en vervolgens gezuiverd (paragraaf 3.2). Bovendien zou het gebruik van IP-5 als substraat voor de enzymatische reactie kan de zuivering van PP-IP 5 en andere inositol pyrofosfaten met een hydroxylgroep op de inositol ring.
Kortom, deze niet veeleisend methode maakt het mogelijk om een betrouwbare zuivering van milligram hoeveelheden van inositol pyro met wijd beschikbare instrumenten, waardoor het openen van nieuwe wegen voor dit spannende onderzoeksveld.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken A. Riccio voor nuttige opmerkingen en om het manuscript te lezen. Dit werk werd ondersteund door de Medical Research Council (MRC) financiering van de Cell Biology Unit en door een Human Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
- Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling. Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).
- Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. Are inositol pyrophosphates signalling molecules? J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).
- Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function. Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).
- Shears, S. B.
- Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases. Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).
- Draskovic, P. Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups. Chem Biol. 15, 274-286 (2008).
- Mulugu, S. A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate. Science. 316, 106-109 (2007).
- Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases. J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).
- Illies, C. Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells. Science. 318, 1299-1302 (2007).
- Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).
- York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. Inositol diphosphate signaling regulates telomere length. J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).
- Luo, H. R. Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions. Cell. 114, 559-572 (2003).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).
- Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).
- Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).
- Bhandari, R. Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1). Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).
- Otto, J. C. Biochemical analysis of inositol phosphate kinases. Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).
