Summary
イノシトールピロリン酸は人間の病態、例えば癌、糖尿病や肥満の重要な役割を果たしているが、作用の正確なメカニズムは、紛争の問題です。市販のイノシトールピロリン酸の不足は、詳細な研究が問題とレンダリング。ここでは、イノシトールピロリン酸のミリグラムを生成し、分離するために単純なプロトコルを記述する。
Abstract
ミオイノシトールは、修正されていないか、より複雑なリン酸化誘導体のいずれかに自然に存在しています。最新の、真核細胞の中で最も豊富な二人はイノシトールpentakisphosphate（IP 3）とイノシトール六リン酸（フィチン酸またはIP 6）です。 IP 5とIP 6は、1つまたは複数のピロリン酸結合1を含むイノシトールピロリン酸の分子の前駆体である。 IP 6のリン酸化がdiphoshoinositolpentakisphosphate（IP 7またはPP - IP 5）及びbisdiphoshoinositoltetrakisphosphate（IP 8または（PP）2 - IP 4）を生成します。イノシトールピロリン酸塩は、これまでに学んだすべての真核生物から単離されている。さらに、イノシトールピロリン酸の合成を担う酵素の2つの別個のクラスは、高度に進化2月4日にわたって保存されている。
IP 6キナーゼ（IP 6 KS）保有基質として、これらの製品を使用することにより、それぞれ、その後IP 5、PP - IP 4、IP〜7 IP 6を変換する巨大な触媒柔軟性は、より複雑な分子5,6の生成を促進する。最近、酵素を生成するピロリン酸第二のクラスは、IP 7やIP 8 7,8にIP 6を変換することができる酵母タンパク質VIP 1（また、PP - IP 5 Kと呼ぶ）、の形で同定された。
イノシトールピロリン酸は、インスリンの分泌9、テロメアの長さ10,11、走化性12、小胞輸送13、リン酸の恒常性14およびHIV - 1のgagリリース15として、多くの異なる細胞プロセスを調節する。アクションの2つのメカニズムが分子のこのクラスのために提案されている。彼らは、アロステリックAKT 16のような特定の蛋白質と相互作用することにより細胞機能に影響を与える可能性があります。また、ピロリン酸基は、事前にリン酸化タンパク質17にリン酸を寄付することができます。この研究分野の大きな潜在力は、これらの分子の研究から多くの科学者を妨げているイノシトールピロリン酸の商業的供給源、およびこの新しい翻訳後修飾の欠如によって妨げられている。イノシトールピロリン酸塩を分離するために現在利用可能なメソッドは、洗練されたクロマトグラフ装置18,19が必要です。これらの手順は、イノシトールピロリン酸の分解20とこうして貧しい回復につながる可能性のある酸性条件を使用してください。さらに、面倒なポストカラムの脱塩の手続きは専門の研究所にその使用を制限する。
本研究では、IP 6 -キナーゼとPP - IP 5 -キナーゼ反応の生成物の生成、単離および精製の ための多くを求めない方法を説明します。このメソッドは、高度にリン酸化されたイノシトールポリリン酸20を解決するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）の能力によって可能であった。 IP 6 K1と基質としてのIP 6を使用してPP - IP 5 Kの酵素反応に続いて、PAGE、続いて水で溶出し、生成されたイノシトールピロリン酸塩を分離するために使用されていました。
Protocol
1。酵素反応 - 1日目（午後の1時間）
- 最初のステップは、IP 6 K1またはVIP1がpyrophosphorylatedアイソフォームにIP 6に変換する10月20日独立した酵素反応を準備することです。
- 我々はE.から精製された彼の- IP 6 K1とGST - VIP1酵素を使用以前に17,18を記載されたプロトコールに従って大腸菌 。
- 1X反応バッファー（30mMのHepes緩衝液pH6.8、50mMのNaCl、6 mMのMgSO 4を 、1mMのDTT）、6 mMのクレアチンリン酸（PCR）、25 U / mLのCreatinePhosphoKinase（CPK）、5mMのATP（Mgを含む50μL反応を準備する塩）、0.3mMのIP6、0.05から0.1μgの彼- IP 6 K1またはGST - VIP1。 MiliQのddH 2 Oで音量を調節
- 簡単に言うと37℃の反応とインキュベート℃で一晩回転でも回転させています。
2。ポリアクリルアミドゲルキャスティングと荷重 - 2日目（午後の4時間）
- ポリアクリルアミドゲルは、24センチ、18センチ幅のガラス板と1.5 mm幅のスペーサを用いて調製される。通常16車線または取シングルレーンコームが使用されます。
- 35.5パーセント（w / v）のアクリルアミド：ビスアクリルアミド午前19時01分、1Xトリス/ホウ酸/ EDTA（TBE）、0.05％（w / v）の過硫酸アンモニウム（APS以下を含む混合（50mLの/ゲル）を準備する）、0.05％（w / v）をTEMED。 、事前に鋳造ガラスプレートの間にミックスを注ぎコームを挿入し、室温で30-60分間重合させる。
- ゲルが重合した後、寒い部屋に装置に転送し、200から300ボルトで約30〜60分間、1 × TBEで事前に実行してください。
- 各反応にOrangeG染料（10mMトリス- HCl pH7.0、1mMのEDTA、30％グリセロール、0.1％OrangeG）の1Xを追加。標準コントロールとしてロードするためにIP 6の2 nmolのを含むサンプルを準備します。
- 沈殿物を除去するためにシリンジと21G針を使用してバッファを実行しているとよく徹底的にそれぞれを洗い、その後、ゲルをロードします。側のウェルにローディングすることは避けてください。
- OrangeG染料のバンドがゲルの底から最後の10cm以内になるまで、450から550ボルト（7 MAMP /ゲル）で一晩ゲルを実行します。
3。 IP 7の分離- 3日目（4時間）と4日目（6-7時間のSpeedVac乾燥工程）
- ゲル装置を分解し、慎重に他のいずれかにゲルを残して1枚のガラスプレートを取り外します。 図1に示すように、ちょうどOrangeG色素のバンドを上からIP 6の標準を含む底部と一つのサンプルのレーンにゲルのわずかな部分をカット。
- トルイジンブルー（0.1％（w / v）のトルイジンブルー、20％（w / v）のメタノール、2％（w / v）のグリセロール）数分間（1〜3分）とゲルの切断部を染色またはイノシトールピロリン酸のバンドが表示されるまで。以前に乾燥から未染色ゲルを防ぐためにゲルの上に戻って取り外したガラス板を置く。
それはIP 6標準よりも少し遅くなるので、IP 7バンドが見えるはずです。 IP 6よりも速く実行されるATPは、、また、（ 図1）可視でなければなりません。数分間脱染色液（20％（w / v）のメタノール）でゲルの染色された部分を転送する、トルイジンブルーの余った部分を洗い流すと染色ゲルでゲルを再配置。
高いpyrophosphorylatedイノシトールアイソフォーム（IP 8 IP 9）の可視化が必要な場合は、室温で20分間、トルイジンブルー染色液でゲルを染色。その後、約15分間脱染色液でトルイジンブルーを洗い流す。
- かみそりの刃でリファレンスとして染色ゲル（ 図1）で決定したIP 7移行の位置を用いて、ゲルの染色部分にIP 7バンドをカット。
- 15 mLの試験管にゲルから切り出されたIP 7バンドを入れて、ミリQのddH 2 O 10mLを追加する室温で10分間回転でチューブを入れる。 TBEおよび顕微鏡アクリルアミド粒子の過剰を削除するには、液体を捨てる。
- その後、二つの脱水和のサイクルを実行します。 IPの7を含むゲルをチューブに50％（w / v）のメタノール5 mLを加え、2時間室温で回転する。ミリQのddH 2 O 5 mLを含む新しい15mLのチューブにゲルスライスを移し、2時間室温で回転する。チューブからメタノールとミリQ H 2 Oを破棄しないでください。以前に使用されて15 mLの試験管にポリアクリルアミドゲルを再転送することにより、再び脱水和のサイクルを繰り返します。洗浄の一つを一晩行うことができます。
- 溶出されたIP 7を集中して、60℃に加熱SpeedVac℃を用いて（5 mLをMilliQddH 2 O及び5mLの50％（w / v）のメタノール）を一緒10mLを乾燥させる
- サンプルはほぼ乾燥していると、± 1.5 mLの遠心分離管と5000 rpmで2分間スピンして、残りの液体（300〜600μl）を移す。
- 新しい1.5 mLの遠心チューブに上清と転送を収集する。残すそれは、アクリルアミドの粒子を含んでいる可能性があるため、底部20〜30μL。
- 必要な非加熱SpeedVacを使用して、乾燥プロセスを続行する場合。サンプルは100〜300μLの容積に達したときにサンプルが完全に乾く場合は、IP 7の回復が劇的に減少され、したがって、乾燥工程を終了する。
4。 IP 7濃度及び純度の決定。
- セクション2.2から2.5までと同様に、PAGEゲル上で実行するように回復したIP 7サンプル2〜5μLを使用してください。濃度の標準とポリ- Pマーカーの4 nmolのようにIP 6のいくつかの希釈（すなわち0.5、1、2、4ナノモル）を読み込みます。ゲルを実行した後、3.2節（ 図2A）で説明されている手順に従って、染色とトルイジンブルー液で脱染色ゲル全体によるイノシトールピロリン酸のアイソフォームを可視化する。
- トルイジン染色した後、濃度は、 図2Bに示すように、イメージ- J、などのイメージングソフトウェアを使用して、ゲルをスキャンし、IP 6とIP 7の間の強度の違いを比較することによって決定することができます。
5。代表的な結果：
IP 6 K1とVIP1酵素を使用してIP〜7 IP 6の調製用酵素的変換は、簡単にページの解析（ 図1）を使用して解決することができます。彼らはイノシトール環上に存在するリン酸基の数に応じて実行速度が遅くなるので、トルイジンブルーのゲルの染色と一緒にサイズのコントロールとしてIP 6のローディングは、pyrophosphorylated誘導体の同定が可能になります。上記の手順では、IP 7の容易に精製することができます。 PAGEで精製したイノシトールピロリン酸の分析は、当社のIP 7（ 図2A）の純度を明らかにした。興味深いことに、VIP1の1/3PP-IP 5 IPの異性体7の製品は、IP 6 K1によって生成されるIP 7 5PP - IP 5異性体より僅かに遅い移行されます。精製したIP 7（ 図2B）の濃度を容易に定量化を可能にするIP 6の基準を使用してください。さらなる実験のためにIP 7を使用する前に、その生物活性を評価することができます。
（ 図3）。 5PP - IP 5は VIP1でとIP 7ホスファターゼDDP1（diphosphoinositolポリリン酸のリン酸ヒドロラーゼ）でインキュベートする。日常的に、精製されたIP 7 DDP1（ 図3）によってVIP1でIPを8にし、IP 6に変換されます。
図1：IP 7バンドのページと分離のトルイジン染色は、標準（IP 6）を含むゲルの部分を切断し、トルイジンブルー液を用いて染色した。 3つのバンド（上から下へ）IP 7、IP 6とATPを表しています。ゲルの染色された部分は、ゲルの残りに整列した。これは、（点線で囲まれた部分）切断して精製することができるIPの7を含むゲルの部分のローカライズが可能になります。
図2：IP 6 K1とVIP1反応生成物のPAGE分析。 A）トルイジンブルー染色によるIP 6の解析（4、2、1、0.5 nmolのは）IP 6 K1（5PP - IP 5）とVIP1（1/3PP-IP両方から精製したIP 7濃度を決定するために使用されていました5）精製されたIP 7の濃度を決定するために反応が。B）散布図の分析。濃度は、IP 6の所定の量と比較するとImageJのソフトウェアを用いて計算したバンド強度、、にしたがって決定した。 X -軸は強度を表し、Y軸は、ナノモルで表した濃度を表します。
図3：IP 7生物学的活性の解析精製されたIP 7の品質を判断するには、我々は、DDP1 VIP1、またはIP 7ホスファターゼと5PP - IP 5（IP 6 K1生成されたIP 7）インキュベートし、ページ上で反応して解決。 DAPIとトルイジン染色はVIP1でIP 8の予想される生産とDDP1でIP 6〜IP 7の変換を明らかにした。
Discussion
生化学におけるイノシトールピロリン酸の使用は厳しく、このような化合物の商業利用できないと、既存の検出方法の乏しい感度によって制限されます。異なるリン酸基の数、およびトルイジンブルー（ 図1）、リン酸基に結合する異染染料を、有する分子の分離を可能にするページ、の組み合わせは、研究20の新たな道を開くイノシトールpyrophoshateのアイソフォームの容易な検出を行うことができます。
酵素反応のイノシトールピロリン酸の製品を精製するためにこのページの技術を説明する使用はoutbyどちらIP 6 K1またはVIP1を行い、高品質のIP 7の大量の生産を可能にするシンプルで、経済的かつ信頼性の高い方法です。上記の方法は、7 IPの簡易精製法に限定されるものではなく、記述されたプロトコルのマイナーな修正は、イノシトールピロリン酸の異なる範囲の精製を可能にすることができる。個以上のリン酸基を含む高リン酸化イノシトールピロリン酸のアイソフォームは、基板20,6として、IP 7またはIP 6の異なる量を用いて検出することができる。これらのイノシトールピロリン酸は、染色手順の長さを増加させ、続いて（セクション3.2）、精製によって検出することができます。また、酵素反応の基質としてIP 5の使用は、PP - IP 5の精製とイノシトール環に ヒドロキシル基を含む他のイノシトールピロリン酸塩をできるようになります。
結論として、この多くを求めない方法は、このように、このエキサイティングな研究分野のための新しい道を開いて、広く利用可能な楽器とイノシトールピロリン酸のミリグラム単位の信頼性の高い精製が可能になります。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、有益なコメントをA. Riccioのを感謝し、原稿を読み取るために。この作品は、細胞生物学ユニットの医学研究評議会（MRC）の資金によって、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムのグラント（RGP0048/2009-C）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
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