Summary
Pirofosfatos inositol juegan un papel importante en patologías humanas del cáncer, la diabetes y la obesidad, sin embargo, el mecanismo exacto de acción es un asunto de disputa. La falta de pirofosfatos inositol disponibles en el mercado hace que los estudios detallados problemática. A continuación se describe un protocolo sencillo para producir y aislar miligramos de pirofosfatos de inositol.
Abstract
Myo-inositol está presente en la naturaleza ya sea modificado o en derivados más complejos fosforilada. De los últimos, los más abundantes en las células eucariotas son dos pentaquifosfato inositol (IP 5) y hexakisfosfato inositol (ácido fítico o IP 6). IP 5 y 6 de IP son los precursores de las moléculas de pirofosfato de inositol que contienen uno o más bonos de un pirofosfato. La fosforilación de 6 de IP genera diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 o 5 PP-PI) y bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 o (PP) 2-IP 4). Pirofosfatos inositol se han aislado de todos los organismos eucariotas estudiados hasta ahora. Además, las dos clases distintas de las enzimas responsables de la síntesis de pirofosfato inositol son altamente conservado durante la evolución 2-4.
El 6 de IP quinasas (IP 6 Ks) posee una flexibilidad enorme catalizador, la conversión de IP 5 y 6 de IP a IP PP-4 y 7, respectivamente, IP y, posteriormente, mediante el uso de estos productos como sustratos, promover la generación de moléculas más complejas 5,6 . Recientemente, una segunda clase de enzimas generadoras de pirofosfato fue identificado en la forma de la proteína de levadura VIP 1 (también conocido como PP-IP 5 K), que es capaz de convertir 6 de IP a IP e IP 7 8 7,8.
Pirofosfatos inositol regulan muchos procesos celulares diferentes, tales como la secreción de insulina 9, 10,11 longitud de los telómeros, la quimiotaxis 12, el tráfico vesicular 13, 14 y homeostasis del VIH-1 gag versión 15. Dos mecanismos de acción han sido propuestos para esta clase de moléculas. Pueden afectar a la función celular por alostéricamente interactuar con proteínas específicas como AKT 16. Por otra parte, el grupo pirofosfato puede donar un grupo fosfato a la pre-fosforilados proteínas 17. El enorme potencial de este campo de investigación se ve obstaculizada por la ausencia de una fuente comercial de pirofosfatos de inositol, que está impidiendo que muchos científicos del estudio de estas moléculas y esta nueva modificación después de la traducción. Los métodos actualmente disponibles para aislar pirofosfatos inositol requieren sofisticados aparatos de cromatografía 18,19. Estos procedimientos utilizan condiciones ácidas que pueden conducir a la degradación del pirofosfato de inositol 20 y por lo tanto a una mala recuperación. Además, el engorroso columna post-procedimientos de desalinización restringir su uso a laboratorios especializados.
En este estudio se describe un método poco exigente para la generación, el aislamiento y la purificación de los productos de las 6 de IP-cinasa y PP-IP reacciones 5-quinasas. Este método fue posible gracias a la capacidad de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver los polifosfatos inositol altamente fosforilada 20. Después de 6 de IP K1 y PP-IP 5 K reacciones enzimáticas con 6 de IP como el sustrato, PAGE se utiliza para separar los pirofosfatos genera inositol que se eluyen posteriormente en el agua.
Protocol
1. La reacción enzimática - día 1 (1 hora de la tarde)
- El primer paso es preparar a los 10-20 reacciones enzimáticas independientes en el que 6 de IP K1 o VIP1 convertir 6 de IP a las isoformas pyrophosphorylated.
- Nosotros usamos su IP-6 K1 y las enzimas GST-VIP1 purificada de E. coli según el protocolo descrito anteriormente 17,18.
- Preparar 50 l reacciones que contiene 1X tampón de reacción (30 mM Hepes pH 6,8, NaCl 50 mM, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM fosfocreatina (PCr), 25 U / mL creatinfosfoquinasa (CPK), 5 mM ATP (Mg sal), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 mg Su IP-6 K1 o GST VIP1. Ajustar el volumen con MiliQ ddH 2 O.
- En pocas palabras girar la reacción y se incuba a 37 ° C durante la noche con la rotación.
2. Poliacrilamida fundición de gel y la carga - día 2 (4 horas por la tarde)
- El gel de poliacrilamida se prepara utilizando placas de 24 cm de largo, 18 cm de ancho y 1,5 de vidrio espaciadores mm de ancho. Por lo general, un carril de 16 o con un peine de preparación de un solo carril se utiliza.
- Prepare una mezcla de (50 ml / gel) que contenga lo siguiente: 35,5% (w / v) acrilamida: bis-acrilamida 19:1, 1X Tris / Borato / EDTA (TBE), 0,05% (w / v) persulfato de amonio (APS ), un 0,05% (w / v) TEMED. Vierta la mezcla entre las placas de vidrio pre-fundido, insertar el peine y dejar polimerizar durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.
- Una vez que el gel se polimeriza, la transferencia del aparato a la sala de frío y pre-run en TBE 1X durante unos 30-60 minutos a 200-300 voltios.
- Añadir 1X de OrangeG tinte (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 30% de glicerol, 0,1 OrangeG%) a cada reacción. Prepare una muestra que contiene 2 nmol de 6 de IP para cargar en un control estándar.
- Lave bien a fondo con cada funcionamiento de amortiguación con una jeringa y una aguja de 21G para eliminar cualquier precipitado, a continuación, cargar el gel. Evitar la colocación de los pozos secundarios.
- Dejar correr el gel durante la noche a 450-550 voltios (7 mAmp / gel), hasta que la banda tinte OrangeG está dentro de los últimos 10 cm del fondo del gel.
3. El aislamiento de IP 7 - 3 días (4 horas) y el día 4 (07.06 horas SpeedVac proceso de secado)
- Desmontar el aparato del gel y retirar con cuidado una placa de vidrio dejando el gel en la otra. Cortar una porción pequeña del gel de poco más de la banda tinte OrangeG a la parte inferior que contiene el 6 de IP estándar y un carril de la muestra, como se muestra en la Figura 1.
- Mancha la parte cortada del gel con azul de toluidina (0,1% (w / v) azul de toluidina, el 20% (w / v) de metanol, el 2% (w / v) de glicerol) por unos minutos (1-3 min) o hasta que la banda inositol pirofosfato parece. Coloque la placa de vidrio previamente eliminado de nuevo en la parte superior del gel para evitar que el gel se seque sin mancha.
La IP de 7 bandas deben ser visibles, ya que corre más lento que el 6 de IP estándar. ATP, que se ejecuta más rápido que el 6 de IP, también debe ser visible (Figura 1). La transferencia de la parte manchada del gel en una solución de la tinción (20% (w / v) metanol) durante unos minutos, lavar el exceso de azul de toluidina y la posición del gel con el gel sin mancha.
Si la visualización de mayor isoformas pyrophosphorylated inositol (IP IP 8 y 9) es necesario, manchar el gel con una solución de tinción con azul de toluidina durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, lavar el azul de toluidina con la solución de tinción de unos 15 minutos.
- Con una navaja cortar la IP de 7 bandas en la parte sin teñir el gel usando como referencia la posición de la migración de IP 7 determinado con el gel teñido (Figura 1).
- Ponga la IP de 7 bandas que se cortó del gel en un tubo de 15 ml y agregar 10 ml de MilliQ ddH 2 O. Poner los tubos en rotación durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el líquido para eliminar el exceso de partículas de acrilamida TBE y microscópicas.
- Posteriormente, realizar dos ciclos de hidratación-deshidratación. Añadir 5 ml de 50% (w / v) de metanol al tubo con el gel que contiene 7 IP y rotar a temperatura ambiente durante 2 horas. La transferencia de la porción de gel en un tubo de 15 ml nuevo que contiene 5 ml de MilliQ ddH2O y rotar a temperatura ambiente durante 2 horas. No deseche el metanol y MilliQ H 2 O de los tubos. Repita el ciclo de deshidratación-hidratación, una vez más por volver a transferir el gel de poliacrilamida en tubos de 15 ml utilizados anteriormente. Uno de los lavados se pueden realizar durante la noche.
- Para concentrar la IP eluye 7, secar el de 10 ml junto (5 ml MilliQddH 2 O y 5 ml de metanol al 50% (w / v)) con un SpeedVac calienta a 60 ° C.
- Una vez que las muestras son casi seco, transferir el líquido restante (300 a 600 l) a A1.5 tubo de centrífuga mL y girar durante 2 minutos a 5000 rpm.
- Recoger el líquido sobrenadante y transferir a un nuevo tubo de centrífuga de 1.5 ml, dejarla parte inferior 20 a 30 l, ya que puede contener partículas de acrilamida.
- Si es necesario continuar con el proceso de secado mediante un SpeedVac sin calefacción. La recuperación de la propiedad intelectual 7 se reduce drásticamente si las muestras se seque por completo, por lo tanto, terminar el proceso de secado cuando las muestras de alcanzar el volumen de 100-300 mL.
4. Determinación de la IP 7 de concentración y la pureza.
- 5.2 l uso de la IP se recuperó 7 muestra a correr en un gel de PAGE, de manera similar a las secciones 2.2-2.5. Cargar varias diluciones de 6 de IP (es decir, 0,5, 1, 2, 4 nmol) como estándar de concentración y 4 nmol de Poly-P marcador. Después de ejecutar el gel, visualizar las isoformas inositol pirofosfato de manchas y de-tinción del gel con una solución completa de toluidina, siguiendo el procedimiento descrito en la Sección 3.2 (Figura 2).
- Después de la tinción de toluidina, la concentración se puede determinar mediante el análisis del gel y la comparación de las diferencias de intensidad entre IP 6 y 7 IP, utilizando el software de imagen como la imagen-J, como se muestra en la Figura 2B.
5. Los resultados representativos:
La conversión de preparación enzimática de 6 de IP a IP 7 usando enzimas IP 6 K1 y VIP1 puede ser fácilmente resuelto mediante análisis PAGE (Figura 1). La carga de 6 de IP como un control de tamaño, junto con la tinción de toluidina azul gel permite la identificación de los derivados pyrophosphorylated, ya que correr más lento, dependiendo del número de grupos fosfatos presentes en el anillo de inositol. El procedimiento descrito anteriormente permite la purificación fácil de IP 7. El análisis del pirofosfato purificada inositol por PAGE reveló la pureza de nuestra IP 7 (Figura 2A). Curiosamente, el isómero 1/3PP-IP 5 de 7 productos IP de VIP1 desplaza ligeramente más lento que la 5PP-IP 5 isómero de IP 7, que es generado por la IP 6 K1. El uso de IP 6 normas permiten una sencilla cuantificación de la concentración de la propiedad intelectual purificada 7 (Figura 2B). Antes de utilizar 7 IP para nuevos experimentos, su actividad biológica puede ser evaluado
(Figura 3). 5PP-IP 5 se incuba con VIP1 y con la IP 7 fosfatasa DDP1 (phosphohydrolase diphosphoinositol polifosfato). Rutinariamente, el IP purificada 7 se convierte en IP 8 por VIP1 y 6 de IP por DDP1 (Figura 3).
Figura 1:. Tinción de toluidina de PAGE y el aislamiento de la IP de 7 bandas La porción del gel que contiene la norma (IP 6) fue cortado y teñido con una solución de azul de toluidina. Las tres bandas representan (de arriba a abajo) IP 7, 6 de IP y ATP. La parte manchada del gel se alineó entonces con el resto del gel. Esto permite la localización de la porción del gel que contiene 7 IP, que puede ser cortado y purificado (cuadro de líneas discontinuas).
Figura 2: PAGE análisis de productos de la reacción IP 6 K1 y VIP1. A) Análisis de las 6 de IP (4, 2, 1, 0,5 nmol) por tinción con azul de toluidina se utilizó para determinar la concentración de propiedad intelectual 7 purificada a partir de los 6 de IP K1 (5PP IP-5) y VIP1 (1/3PP-IP 5) las reacciones. B) Análisis Gráfico de dispersión para determinar la concentración de la propiedad intelectual purificada 7. Las concentraciones se determinaron de acuerdo a la intensidad de la banda, calculada utilizando el software ImageJ, en comparación con cantidades predeterminadas de 6 de IP. El eje X representa la intensidad, el eje Y representa la concentración expresada en nmol.
Figura 3:. Análisis de IP 7 actividad biológica para determinar la calidad de la IP purificada siete se incubaron 5PP IP-5 (IP 6 K1 IP generadas 7) con VIP1 o con la IP 7 fosfatasa DDP1 y luego resolver la reacción en la página. El DAPI y toluidina reveló la producción esperada de 8 por VIP1 IP y la conversión de IP a IP 7 6 por DDP1.
Discussion
El uso de pirofosfato de inositol en la bioquímica está severamente limitada por la falta de disponibilidad comercial de estos compuestos y la escasa sensibilidad de los métodos de detección existentes. La combinación de la página, que permite la separación de las moléculas que poseen distinto número de grupos fosfato, y el azul de toluidina (Figura 1), un colorante metacromática que se une a los grupos de fosfatos, permite la fácil detección de las isoformas de pyrophoshate inositol apertura de nuevas vías de investigación 20.
El uso de la tecnología descrita PAGE para purificar productos inositol pirofosfato de la reacción enzimática llevado outby ya sea IP 6 K1 o VIP1 es un método sencillo, económico y fiable que permite la producción de grandes cantidades de IP de alta calidad 7. El método descrito anteriormente no se limita a la simple purificación de IP 7, pero pequeñas modificaciones del protocolo descrito podría permitir la purificación de un rango diferente de pirofosfatos de inositol. Isoformas inositol fosforilado mayor pirofosfato, que contiene más de ocho grupos de fosfato pueden ser detectados utilizando IP 7 o diferentes cantidades de 6 de IP como un sustrato de 20,6. Estos pirofosfatos inositol puede ser detectado por el aumento de la duración del procedimiento de tinción y posteriormente purificado (sección 3.2). Por otra parte, el uso de IP 5 como sustrato para la reacción enzimática que permite la purificación del PP-5 de IP y otros pirofosfatos inositol que contiene un grupo hidroxilo en el anillo de inositol.
En conclusión, este método permite que poco exigente para la purificación confiable de cantidades de miligramos de pirofosfatos inositol con instrumentos ampliamente disponible, lo que abre nuevas vías para este campo de investigación apasionante.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a A. Riccio por sus valiosos comentarios y de leer el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Medical Research Council (MRC) de financiamiento a la Unidad de Biología Celular y por un ser humano Frontier Science Programa de Subvenciones (RGP0048/2009-C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 | |
| Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 | |
| ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 | |
| PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab | |
| Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 | |
| Temed | VWR | 43083G | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 | |
| SpeedVac | Christ | 100218 | |
| Gel apparatus | Hoeffer Scientific Instruments | SE600 | |
| Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 | |
| Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |
References
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