Summary
Zebrafisch stellen eine leistungsstarke Wirbeltier-Modell, das schon für metabolische Studien nicht ausreichend genutzt hat. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode, um die Messung
Abstract
Eine wachsende Ziel im Bereich des Stoffwechsels ist, die Auswirkungen der Genetik auf verschiedene Aspekte der mitochondrialen Funktion zu bestimmen. Das Verständnis dieser Zusammenhänge wird helfen, die zugrunde liegende Ätiologie für eine Reihe von Erkrankungen, die mit mitochondriale Dysfunktion, wie Diabetes und Fettleibigkeit zu verstehen. Jüngste Fortschritte in der Instrumentierung, hat die Überwachung der verschiedenen Parameter der mitochondrialen Funktion in Zelllinien oder Gewebe Explantate aktiviert. Hier präsentieren wir eine Methode für eine schnelle und empfindliche Analysen der mitochondrialen Funktion Parameter in vivo während der Zebrafisch Embryonalentwicklung mit der Seahorse Bioscience XF 24 extrazellulären Fluss-Analysator. Dieses Protokoll nutzt die Islet Capture-Mikrotiterplatten, wo ein einzelner Embryo in jedem gut platziert ist, so dass die Messung der Bioenergetik, einschließlich: (i) Basalatmung; (ii) basal mitochondriale Atmung (iii) die mitochondriale Atmung durch ATP Umsatz; (iv) mitochondriale entkoppelt Atmung oder prOton Leck und (iv) maximale Atmung. Mit diesem Ansatz embryonalen Zebrafisch Atmung Parameter können zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderte Embryonen (Mutante, Gen-Überexpression oder Gen-Knockdown) oder den manipulierten pharmakologisch verglichen werden. Es wird erwartet, dass die Verbreitung dieses Protokolls werden die Forscher mit neuen Tools bieten, um die genetischen Grundlagen von Stoffwechselstörungen in vivo in diesem relevanten Wirbeltier Modell zu analysieren.
Protocol
Teil 1: Chemische Behandlung von Zebrafisch-Embryonen
- Sammle Zebrafisch Embryonen nach der Befruchtung. Inkubation bei 28,5 ° C in E3 Medium in 100 mm × 15 mm Petrischalen. Hinweis: Für die in situ-Hybridisierung oder Oil-Red-O-Färbung, ist 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) in einer Endkonzentration von 0,2 mM hinzugefügt inhibieren Pigmentbildung, 1, aber ist nicht notwendig für Seahorse Analyse.
- Für pharmakologische Studien, fügen Sie die erforderlichen chemischen zu einem angemessenen Endkonzentration zu entwickeln Zebrafischembryonen bei rund 26 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit einem geeigneten Fahrzeug nur die Kontrolle. Hinweis: für lichtempfindliche pharmakologische Inhibitoren, Embryonen erlaubt werden kann, in der Entwicklung werden die dunkle vor der Analyse.
Teil 2: Live Metabolic Profil mit dem Seahorse XF 24 Analyser
- Vor jedem Lauf, der Seahorse XF 24 Analyser Patrone, beherbergt das O 2 und H
- Vorbereitung der 24-Well-XF 24 Inselchen Platte. Die folgenden experimentellen Sequenz verwendet wird:
- Da Sauerstoffverbrauch ist empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen, sind vier Bohrungen verwendet werden, um nach möglichen Temperaturschwankungen über die Platte zu steuern. Diese Vertiefungen enthalten keine Embryonen, sondern werden mit 700 ul Medium E3 (2A) gefüllt ist.
- Die verbleibenden 20 Bohrungen (siehe Abschnitt 2.2) werden mit 700 ul Medium und E3 ein Embryo jedes (2B) gefüllt.
- Für jedes Experiment werden 10 Embryonen mit Fahrzeug-only (Kontrolle) und 10 mit chemischen Inhibitor (behandelt) behandelt wurden. Kontroll-und behandelten Embryonen abgewechselt werden (zB auch A2: control Embryos, gut A3: behandelte Embryo: well A4: control Embryos, gut A5 behandelt Embryo, etc).
- Eine kleine Insel Capture-Bildschirm auf der Oberseite hinzugefügt. jede Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Probe in der Messkammer in der Assay (2B) bleibt Hinweis: chemisch behandelten Embryonen bleiben mit ihren ursprünglichen chemischen Lösung während des gesamten Verfahrens, ohne die Notwendigkeit zu waschen die chemische vor Ausführung der Seahorse-Analysator Programm.
- Einmal abgeschlossen, wird die Platte in das Seahorse Analyser geladen und der Assay wird gestartet.
- Analyse von Proben. Zwei verschiedene Tests werden routinemäßig durchgeführt.
- Basalatmung / Maximum Atmung Programm (Dauer ca. 90 min.). Veränderungen in Basalatmung untermauern metabolische Dysfunktion, während maximale Atmung ist ein Maß der gesamten Energieerzeugung Kapazität und Veränderungen dieser Parameter mit einer Reihe von sowohl pathologischen und physiologischen Zuständen zugeordnet. Das Reserverad Atemkapazität oder die Kapazität für das System weiter zu steigern ATP-Produktion, wird ebenfalls berechnetaus diesem Test durch die Subtraktion der Basal von maximal Atmung. Drei Wiederholungen von jeder Mischung (2 min) / wait (1 min) / Messung (2 min) Zyklus wird durchgeführt, um zuerst feststellen Basalatmung. Am Ende des dritten Zyklus wird eine Endkonzentration von 2,5 pM FCCP (mitochondriale protonophore / Entkoppler) in jede Vertiefung erlaubt die Messung der maximalen Atmung aufgenommen. Der Meßzyklus wird dann 5 bis 8 mal (Abbildung 3) wiederholt.
- ATP Umsatz / Proton Leck Programm (Dauer ca. 60 min.). Atmung durch ATP Umsatz repräsentiert die Hauptfunktion von Mitochondrien in Form von ATP-Produktion, während der Atmung durch Proton Leck oder ungekoppelten Atmung, ist untrennbar mit anderen Parametern der mitochondrialen Funktion einschließlich Basalatmung und Bildung reaktiver Sauerstoffspezies verknüpft. Atmung durch ATP Umsatz wird durch die Differenz in der Atmung nach der Zugabe von 25 uM Oligomycin (ein Inhibitor von A dargestellteTP-Synthase) an Basalatmung verglichen. Ungekoppelten Atmung, oder die Atmung durch Proton Leck, durch Berechnen der Differenz zwischen Oligomycin-vermittelte Beatmung und Atmung nach der Zugabe von 25 uM Rotenon (eine komplexe I-Inhibitor) ermittelt. Messzyklen 8 mal nach Zugabe jedes mitochondrialen Inhibitor wiederholt.
- Vorbereitung der 24-Well-XF 24 Inselchen Platte. Die folgenden experimentellen Sequenz verwendet wird:
Am Ende der Läufe, Mittelwerte der 10 Kontrolltieren und 10 chemisch behandelten Embryonen werden berechnet.
Teil 3: Oil-Red-O-Färbung
- Embryonen bei 50 hpf sind dechorionated mit feinen Pinzetten und in 4% PFA fixiert Nacht bei 4 ° C.
- Oil-Red-O-Färbung durchgeführt wird, wie zuvor 2 beschrieben (siehe Abbildung 4).
Representative Results
Wir sind daran interessiert zu verstehen, die Rolle bestimmter Gene auf den Stoffwechsel, insbesondere Atemfrequenz und Fettstoffwechsel. Daher behandelten wir Wildtyp Zebrafischembryonen aus 26 hpf vorwärts mit einer spezifischen pharmakologischen Inhibitor des Enzyms durch einen dieser Gene kodiert. Bei 50 hpf, die Hälfte des Fahrzeugs und Inhibitor-behandelten Embryonen wurden mit dem Seahorse für mitochondriale Funktion, während die andere Hälfte in 4% PFA wurden über Nacht bei 4 ° C und anschließend für die Lipid-Abscheidung mit Oil-Red-O gefärbt. Die Behandlung mit dem spezifischen Enzym-Inhibitor führte ein ~ 2 fache Erhöhung Basalatmung (4A), die mit einer Zunahme der Lipidablagerung insbesondere im Telencephalon und unterhalb des otisch Vesikel (4B, C) zugeordnet wurde.
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Abbildung 1. Schematische Darstellung der chemischen Behandlung von Zebrafisch-Embryonen. Wildtyp, genetisch manipuliert oder pharmakologisch behandelt Zebrafischembryonen sind Hintergrund.
Abbildung 2. XF24 Insel Platte auf. (A) Vier Brunnen embryonalen Medium enthalten nur Temperaturregelung (markiert durch ein X) und die anderen enthalten ein Embryo / gut. (B) Close-up von einem gut (C6) zeigt eine 50 hpf Wildtyp Embryo mit Vehikel (DMSO) von einer kleinen Insel Capture-Bildschirm (Pfeilspitze) abgedeckt behandelt.
Abbildung 3. Respiration Parameter für Wildtyp 50 hpf Zebrafischembryonen. (A) Für jede Messung wird der Mittelwert der 20 einzelnen Embryonen vorgestellt. Basalatmung (Mittelwert: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), Maximal Atmung (Mittelwert: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), Spare Respiratory Capacity (Mittelwert: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) Für jede Messung wird der Mittelwert aus den 20 Einzelmessungen dargestellten Ergebnisse. Basal mitochondriale Atmung; mitochondriale Atmung durch ATP Umsatz; Mitochondrien entkoppelt Atmung und nicht die mitochondriale Atmung. Mt: Mitochondrien, SRC: Spare Respiratory Kapazität; SD: Standardabweichung, SEM: Standardfehler des Mittelwerts. Die Ergebnisse werden in pmol von O 2 vorgestellt konsumiert / min / Embryo. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 4. Reprerepräsentativen Ergebnisse der chemischen Einwirkung auf die basale Atmung und Lipidablagerung. (A, B) 50 hpf Embryo mit Öl-Rot O in Seitenansicht angefärbt. Der Embryo mit der selektiven Inhibitor (B) inkubiert zeigt mehr Oil-Red-O-Färbung im Telencephalon (Pfeilspitze) und unterhalb des otic Vesikel (Pfeil) im Vergleich zu einem Fahrzeug-behandelten Kontrollgruppe Embryo. (C) zeigt ein Basalatmung ~ 2 fache Erhöhung der chemisch behandelten Embryonen (n = 10 Embryonen pro Gruppe). Ergebnisse sind in pMol von O 2 / min / Embryo präsentiert.
Discussion
Zebrafisch ist ein gut etabliertes genetisches Modell für sowohl vorwärts (ENU Mutagenese) und rückwärts (Tilling, Zinkfinger-Nuclease gezielte Knock-out-, Morpholino Knockdown) genetische Ansätze 3,4, während Genfunktion beim Zebrafisch Embryonen können auch einfach blockiert oder aktiviert werden Verwendung selektiver pharmakologischen Verbindungen spezifisch für den codierten Produkte. Aufgrund ihrer externen Entwicklung und geringen Größe sind Zebrafischembryonen besonders geeignet für metabolische Analyse. Allerdings hat sich das robuste Messung der metabolischen Profils und die Funktion der Mitochondrien in vivo in Zebrafisch-Embryonen nicht erreicht wurde, mit nur einer vorläufigen Beschreibung berichtete 5. Seahorse Analyse wurde ursprünglich für zellbasierte metabolischen Untersuchungen ausgelegt und hat sich gezeigt, um genaue und zuverlässige Ergebnisse 6. Die Anwendung dieser neuen Methode zur Zebrafisch-Embryonen ist bezeichnend, und wahrscheinlich die breitere Nutzung dieses Modells für metabolische Studien zu erhöhen.
In dieser Studie zeigen wir, Messung einer Reihe von Atmung Parameter in Zebrafisch-Embryonen mit dem Seahorse Analyser, einschließlich Basalatmung, maximal Atmung, Freizeit Atemkapazität, ATP Umsatz und Protonen Leckage. Wir stellen auch ein Beispiel, wie solche Messungen können mit anderen physiologischen Parameter, in diesem Fall Lipidakkumulation und der Verwendung pharmakologischer Inhibitoren in diesem Testsystem korreliert werden. In Kombination mit dem Einsatz von genetisch veränderten Embryonen, stellt dies eine starke experimentelle Plattform für das Verständnis Einflussfaktoren auf den Stoffwechsel.
Es gibt eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für diese neue Methodik, mit mitochondrialer Dysfunktion ist in vielen menschlichen Erkrankungen, wie Diabetes mellitus 7, 8 Fettleibigkeit, Multipler Sklerose 9, Parkinson-Krankheiten 10, Alzheimer 11 und irgendeine Art von Krebserkrankungen 12 gebracht. Wichtig ist, owie Zytokine, entwicklungsbezogenen Wachstum usw. - - ur Arbeit wird in vivo, wo alle Umwelteinflüsse durchgeführt aktiv sind, wodurch eine physiologisch relevante Sicht in vivo Atmung und metabolische Profil. Als chemische Bildschirme werden auch routinemäßig in Wildtyp und Mutante Hintergrund Zebrafischembryonen (Abbildung 1), neuartige Medikamente, die Einfluss auf die Atmung, Mitochondrien-Funktion oder Stoffwechsel leicht identifiziert werden konnte mit der Seahorse-Analysator durchgeführt. Die Ergebnisse unter Verwendung der Seahorse-Analysator könnte in Verbindung mit anderen Assays verwendet werden, um zusätzliche Informationen bereitzustellen. Dazu kann auch physiologische Analyse, wie Öl-Rot-Färbung oder der molekularen Analyse, wie in situ Hybridisierung für spezifische Marker wie Adipozyten cebpα, PPARalpha, PPAR &ggr;, FAS usw.
Es bleiben jedoch einige Einschränkungen zu dieser Methodik. Obwohl wir und andere konnten Oligomycin zum Messen verwendenure ATP-Produktion und Proton Leck auf junge Embryonen 5 (siehe Abbildung 3), in Embryonen älter als 60 hpf Oligomycin Behandlung ist ineffizient. Wir glauben, dass bei älteren Embryonen Oligomycin nicht so leicht als bei jüngeren Embryonen machen die Ergebnisse nicht zu interpretieren diffundieren. Da die Ergebnisse Oligomycin zwingend zur Bestimmung der Atmung durch ATP Umsatz und ungekoppelten Atmung sind, untersuchen wir derzeit höhere Konzentrationen an Oligomycin für ältere Embryonen. Allerdings bleiben Antimycin A Behandlungen wirksam länger, mit anderen Messungen wie Basalatmung, maximale Atmung und Ersatz Atemkapazität können bei älteren Zebrafischembryonen durchgeführt werden, bis zu 68 hpf (nicht dargestellt).
Eine weitere Einschränkung bei der Verwendung der aktuellen Seahorse Analyser Setup ist der physische Raum innerhalb der einzelnen Insel Fangplatte gut, so dass sie nur für Zebrafisch Embryonen und jungen Larven sind. Daher Durchführung metabolic Studien über ernährungsbedingte Fettleibigkeit bei erwachsenen Fische, zum Beispiel, ist technisch noch nicht machbar. Allerdings kann diese Studie fordert die Entwicklung von Platten speziell für jugendliche oder erwachsene Fische entwickelt, wodurch der Anwendungsbereich der Analysen möglich.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Deakin University Zebrafisch Facility for eine ausgezeichnete laufenden Tierhaltung Pflege danken. YG wird durch ein Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship und Central Research Grant von Deakin University unterstützt. SLM wird durch eine NHMRC Career Development Fellowship unterstützt. ACW wird von einem NHMRC Aktivieren Stipendium unterstützt. Alle Autoren werden von der Molecular & Medical Research Strategic Research Centre an der Deakin University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
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