Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Félix Legendre; Neal Cody; Carole Iampietro; Julie Bergalet; Fabio Alexis Lefebvre; Gaël Moquin-Beaudry; Olivia Zhang; Xiaofeng Wang; Eric Lécuyer

doi:10.3791/50057

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Artigo de método

Todo o Monte RNA Fluorescente

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DOI:

10.3791/50057

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30 de janeiro de 2013

Félix Legendre^*¹^,² , Neal Cody^*¹ , Carole Iampietro¹ , Julie Bergalet¹ , Fabio Alexis Lefebvre¹^,² , Gaël Moquin-Beaudry¹^,² , Olivia Zhang¹ , Xiaofeng Wang¹ , Eric Lécuyer¹^,²

¹Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), ²Department of Biochemistry, Université de Montréal

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui nós descrevemos um fluorescente todo-mount In situ Protocolo de hibridização (FISH) para determinar as propriedades de expressão e localização de RNAs expressas durante a embriogênese na mosca da fruta, Drosophila melanogaster.

Resumo

Avaliar o padrão de expressão de um gene, assim como as propriedades de localização subcelular dos seus transcritos de ARN, são características chave para a compreensão da sua função biológica durante o desenvolvimento. RNA de hibridação in situ (RNA-ISH) é um poderoso método utilizado para visualização de propriedades de distribuição de RNA, seja nos organismos, níveis celulares ou subcelular ^1. RNA-ISH baseia-se na hibridação de uma sonda marcada de ácido nucleico (por exemplo, ARN anti-sentido, oligonucleótidos) complementar à sequência de um mRNA ou de um não-codificantes de ARN alvo de interesse ^2. À medida que o processo requer a informação de sequência primária sozinho para gerar sondas específicas de sequência, pode ser universalmente aplicado a uma ampla gama de organismos e amostras de tecido ^3. De facto, uma série de estudos de grande escala ISH foram implementados para documentar a expressão do gene de ARN e dinâmica de localização em vários organismos modelo, o que levou àestabelecimento de recursos comunitários importantes ^4-11. Embora uma variedade de etiquetagem da sonda e estratégias de detecção têm sido desenvolvidos ao longo dos anos, o uso combinado de reagentes de detecção marcados por fluorescência e as etapas de amplificação enzimática de sinal oferecem melhorias significativas na sensibilidade e resolução do processo ^12. Aqui, nós descrevemos um método fluorescente optimizado em hibridização in situ (FISH) utilizando amplificação de sinal de tiramida (TSA) para visualizar a expressão de RNA e da dinâmica de localização em embriões de Drosophila faseados. O procedimento é realizado em formato de 96 poços da placa de PCR, o que facilita grandemente o processamento simultâneo de um grande número de amostras.

Protocolo

1. Preparação da sonda de ARN

Resumo: A seção seguinte descreve os passos necessários para fazer sondas digoxigenina (Dig)-rotulados de RNA suficiente para os peixes. O primeiro passo envolve a clonagem ou PCR amplificar uma sequência correspondente à região transcrita de um gene de interesse que irá ser utilizado para gerar uma sonda específica da sequência. Isto pode ser conseguido por clonagem do primeiro segmento de gene em um plasmídeo no qual o sítio de clonagem múltipla é flanqueado por elementos do promotor de bacteriófago (T7, T3 ou SP6), que pode então servir como um modelo para PCR, utilizando iniciadores que fla....