Todo o Monte RNA Fluorescente In situ A hibridação de Drosophila Embriões

1. Preparação da sonda de ARN

Resumo: A seção seguinte descreve os passos necessários para fazer sondas digoxigenina (Dig)-rotulados de RNA suficiente para os peixes. O primeiro passo envolve a clonagem ou PCR amplificar uma sequência correspondente à região transcrita de um gene de interesse que irá ser utilizado para gerar uma sonda específica da sequência. Isto pode ser conseguido por clonagem do primeiro segmento de gene em um plasmídeo no qual o sítio de clonagem múltipla é flanqueado por elementos do promotor de bacteriófago (T7, T3 ou SP6), que pode então servir como um modelo para PCR, utilizando iniciadores que flanqueiam que incorporam as sequências de promotor , gerando um produto de PCR linear com as sequências promotoras diferentes, em cada extremidade (Figura 1A). Alternativamente, a fim de evitar o passo de clonagem, pode-se também realizar a amplificação por PCR a partir de DNA genómico ou de ADNc, utilizando oligonucleótidos que incluem T7, T3 ou SP6 nas suas sequências 5 'extremidades (por exemplo T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). Os produtos de PCR lineares são então utilizados como modelos para fazer sentido Dig-rotulado ou sondas de RNA anti-sentido, através do escoamento de transcrição in vitro com a polimerase apropriada (Figura 1B). Ao fazer sondas para genes específicos, recomendamos a preparação tanto sentido e as sondas de RNA anti-sentido utilizando polimerase distintas, que serão úteis para avaliar a especificidade FISH sinal (isto é, a menos que o gene de interesse é transcrito na orientação anti-sentido, o sentido de RNA sonda irá revelar o nível de sinal de fundo). Em todas as etapas a seguir, deve-se tomar muito cuidado para evitar a degradação potencial por ribonucleases contaminantes (ARNases) pela primeira limpeza de todas as áreas de banco e equipamentos com etanol 70% ou soluções de descontaminação comerciais RNase e usando RNase suprimentos (água, por exemplo, dicas, tubos de microcentrífuga).

Mamãeriais

• 1,5 ml tubos de microcentrífuga, (ABgene, Rochester, NY, EUA Cat. No 0900)
• Gel de extração de kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canadá;. Cat. 28706).
• RNAse água (Wisent, Cat Inc. º. 809-115-CL)
• Polimerases de ARN (T7, T3, ou SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences cat.. No. EP0101, EP0111, EP0131).
• RNAse-OUT inibidores de ribonucleases (40 U / ul), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. No. 10777-019).
• Digoxigenina (DIG) misturas de nucleotídeos (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, Quebec, Canadá. Gato. No.11209256910).

Equipamento

• Tampo micro centrífuga-
• Electroforese em gel aparelho

1. PCR amplificar gene específico da sequência de DNA genómico, cDNA, ou DNA de plasmídeo para gerar um produto de PCR linear flanqueado pelo bacteriófago T7, T3 ou sequências de promotor SP6. Seguir as recomendações do fabricante para as condições de PCR.
2. Verificar a qualidade ea size do produto de PCR por electroforese em gel de agarose. Especial e do produto de PCR purificar utilizando um kit de extracção de gel-padrão de acordo com a fabrica recomendações e eluir o produto em 50 ul de tampão.
3. Precipitar o produto de PCR por adição de 5 jul de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 150 ul de etanol a 100% arrefecido em gelo, e coloque os tubos a -70 ° C durante a noite. Centrifugar os tubos a 13.000 xg durante 10 min a 4 ° C e lava-se o sedimento com etanol a 70%. Girar novamente, remover todos os vestígios de etanol e secar o sedimento. Ressuspender em 25-50 ul de ARNase isento de água.
4. Transcrever Dig-sonda marcada com 200-500 ng produto de PCR purificado numa reacção de 20 uL da seguinte forma: 2 ul de tampão 10X de transcrição de T7 (Invitrogen), 1 ul (20 U / ul) de inibidor de RNAse, 2 ul de mistura de Dig-NTP e 2 ul de ARN-polimerase de T7 (20 U / ul). Trazer o volume final de 20 ul com água livre de RNAse. Incubar a reacção de transcrição a 37 ° C durante 3-4 horas.
5. Ajuste transcription mistura a 50 ul com água livre de RNAse e precipitar o Dig-rotulado sonda de ARN, tal como descrito no Passo 4. Ressuspender o pellet lavado RNA em 100 ul de RNAse-livre de água. Armazenar as amostras ressuspensas a -70 ° C.
6. Quantificar a sonda usando um espectrofotômetro NanoDrop. Para verificar a qualidade da sonda, executar uma amostra 1-2 ul em 1-2 manchado gel de agarose% com brometo de etídio.

2. Recolha e fixação de embriões de Drosophila

Resumo: Esta seção descreve as etapas para colheita e processamento encenado embrião de Drosophila. Dependendo do número de embriões necessários, as moscas podem ser mantidos em gaiolas de população de vários tamanhos. Os passos seguintes são para coleções realizada utilizando 900 centímetros ³ gaiolas cilíndricas usando 100 milímetros maçã placas de coleta de suco. Fixação adequada requer a remoção de duas camadas de protecção em torno do embrião: o cório exterior e o interior vitelinae membrana ^13. Uma vez colhido, os embriões são primeiro banhado com uma solução de lixívia a 50% para remover o cório, em seguida, são misturados com uma solução bifásica contendo heptano (permeabilizes a membrana vitelina), e PBS contendo formaldeído a 3,7%. A membrana vitelina é então quebrado e removido através da transferência dos embriões em uma mistura bifásica de heptano e metanol. Fixação embrião propriamente dito e a remoção da membrana vitelina é crítico para o sucesso do procedimento FISH jusante.

Materiais

• Sumo de maçã placas de agar (40% de sumo de maçã, de 4% de sacarose, 3,5% de ágar, 0,3% de metil-parabeno) com dime-sized pasta de levedura (levedura de padeiro misturado com água até uma consistência de manteiga)
• Paraformaldeído em pó (Ciências da microscopia eletrônica, Hatfield, PA, EUA,. Cat n ​​º 19.208)
• Heptano
• Metanol
• Solução Bleach 3%
• 20 ml de vidro de cintilação frascos (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá;. Cat No. 03-337-15).

Equipamento

• Gaiolas população
• Cestos de recolha (feito usando uma malha Nitex e a parte de cima de um corte de tubos de polipropileno de 50 ml, em que um furo tenha sido cortada na tampa).
• Pincel pequeno
• Vórtice de mesa

1. Pré-claras bem alimentados gaiolas população com uma maçã fresca placa suco / levedura durante 1 hora a 25 ° C.
2. Adicionar um novo prato de maçã suco / levedura para a gaiola para a colheita de embriões em fase inicial. Incubar a gaiola durante 4 hr a 25 ° C (note que os tempos de recolha pode ser ajustado dependendo das fases desejadas).
3. Prepara-se uma solução de formaldeído a 37% fresco, combinando 3,7 g de paraformaldeído em pó, 70 ul de KOH 2N e 7,3 ml de milliQ água num frasco de cintilação de vidro sob uma coifa química. Ferve-se a solução até que o paraformaldeído em pó esteja completamente dissolvido, e depois arrefecer até à temperatura ambiente e filtrar para frasco de cintilação de novo.
4. Prepare uma solução de fixação por bifásicacombinando 2,25 ml de 1X PBS com 250 ml de formaldeído a 37% num frasco de cintilação, em seguida, adicionando 7,5 ml de heptano.
5. Colher da placa de sumo de maçã da gaiola e recolher os embriões através da adição de um pouco de água da torneira temperatura ambiente e delicadamente escovar os embriões fora da placa com o pincel. Transferir os embriões ressuspensos em uma cesta e enxágüe com água morna da torneira.
6. Embriões Dechorionate para 90 seg banhando as cestas de coleta em solução de água sanitária, em seguida, enxaguar com água morna da torneira (até lixívia cheiro se foi).
7. Desmonte a cesta coleta, coletar embriões delicadamente usando um pincel e transferi-los para a solução de fixação bifásico. Os embriões vai acumular na interface entre a camada de heptano e PBS.
8. Selo de cintilação frascos e prenda a um misturador de vórtice. Agitar durante 20 minutos na configuração mais baixa.
9. Remover e descartar a maior parte das fases inferiores e superiores de PBS heptano, usando uma pipeta de Pasteur. Aspirara mistura de PBS / heptano / embriões restantes para a pipeta. Gota a gota, rejeitar a fase inferior PBS da pipeta, tendo o cuidado de não eliminar os embriões. Depositar os embriões para um tubo de 1,5 ml contendo uma solução bifásica de 500 ul de heptano (fase superior) e 500 uL de metanol (fase inferior).
10. Agite vigorosamente os tubos com a mão por 30-45 seg para quebrar as membranas vitelínicos. Uma vez rachado, os embriões vai afundar o metanol.
11. Descarte a fase superior de heptano e embriões uncracked na interfase heptano / metanol e adicionar 500 ul de metanol. Agitar durante 5 seg.
12. Lavar 3 vezes com metanol e armazenar os embriões a -20 ° C (neste ponto os embriões podem ser armazenados por semana / mês).

3. Pós-fixação Lava hibridação, Processamento e Pós-hibridação

Resumo: Esta seção detalha as etapas de processamento para permeabilização embrião antes da FISH, hibridação pré-hibridação com as sondas de RNA e de pós-hibridação lavagens. Para os passos iniciais permeabilização os embriões são tratados como um conjunto de um único tubo (passos 1-9 a seguir, a fim de 10-15 ul de embriões assentadas / amostra), mas eles são aliquotadas em poços individuais de uma placa de PCR de 96 poços antes de prosseguir com o passo de pré-hibridação (passo 10). Isso ajuda a garantir um tratamento de todos os embriões nas fases iniciais do experimento. Quando da criação de uma experiência FISH, é importante incluir controlos negativos para determinar o nível de sinal de fundo em experiências individuais. Por isso, recomendamos incluindo amostra de um "não-sonda e, como mencionado na seção 1, uma amostra hibridizada com o" sentido "RNA sonda, que normalmente dão um sinal comparável à condição de o" não-sonda.

Materiais:

• Metanol
• Salina tamponada com fosfato com 0,1% de Tween-20 (PBT)
• Proteinase-K 1 mg / ml de solução-mãe (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canadá. Catalog No. P2308)
• Glicina (20 mg / ml de solução stock)
• Solução de hibridação: 50% de formamida, 5X SSC, 0,1% de Tween-20, 100 g / ml de DNA de esperma de salmão, 100 Heparina ug / ml.
• 0,2 ml halfskirted placas de 96 poços de PCR, ABgene, Rochester, NY, EUA gato. Não 0900)

Equipamento

• Forno de hibridização, o bloco de aquecimento digital ou banho de água ajustável para 56 ° C, 80 ° C ou 100 ° C, ou de uma máquina de PCR.
• Pipetas multicanal (recomendado para simplificar as etapas de lavagem)
• Nutação misturador

1. Enxaguar os embriões em metanol, seguida de uma mistura de 1:1 de metanol: PBT, e depois duas vezes em PBT.
2. Fixar os embriões, durante 20 min em 1 ml de PBT contendo formaldeído 3,7% (preparada de fresco tal como descrito no passo 11) com agitação constante num Nutator.
3. Lavar os embriões por 3 vezes durante 2 minutos em PBT enquanto agitando.
4. Prepara-se uma solução de 3 | ig / ml de proteinase K (PK) diluído em PBT e adicionar500 ul de solução de amostra. Incubar as amostras durante 10 min à temperatura ambiente sem agitação. Misturar embriões cada 2 min por jacto com uma pipeta ou invertendo suavemente os tubos.
5. Transferir amostras de embriões em gelo durante 1 hr.
6. Mover as amostras à temperatura ambiente e remover a solução de PK. Lavar 2 vezes, durante 2 min com 1 ml de PBT + 2 mg / ml de glicina.
7. Fixar as amostras de 20 min em 1 ml de formaldeído PBT + 3,7%, com agitação. Enxaguar embriões 5 vezes em PBT.
8. Enxaguar os embriões com 1 ml de uma mistura 1:1 de solução de PBT e Hyb. Substituir com 0,5-1 ml de solução 100% Hyb (nesta etapa, os embriões podem ser armazenados durante vários dias / semanas a -20 ° C).
9. Embriões alíquotas em poços individuais de uma placa de 96 poços (objectivo para ~ ul 10-15 de embriões assentados / bem, ter o cuidado de usar dicas de grande abertura para evitar danificar os embriões).
10. Ferver 100 ul / amostra de solução de Hyb durante 5 minutos e depois arrefece-se em gelo durante 5 min. Esta solução é utilizada para a amostra de pré-hibridação (pré-Hyb).
11. Adicionam-se 100 ul / amostra de pré-Hyb solução e incubar durante pelo menos 2 horas a 56 ° C.
12. Para cada amostra, dilua ~ 100 ng de sonda em 100 ul de solução de Hyb. Aquece-se a 80 ° C durante 3 min, depois arrefece-se em gelo durante 5 min (sondas aquecidas pode ser mantida em gelo durante várias horas).
13. Remover a solução de pré-Hyb dos embriões e substituir com a solução de sonda de RNA.
14. Hibridizar a 56 ° C durante 12-16 hr.
15. Pré-aquecer as seguintes soluções de lavagem a 56 ° C: (A) 200 ul / amostra de solução de Hyb, (B) 100 ul / amostra de uma mistura de 3:1 de Hyb: PBT, (C) ul 100 / amostra de um 01:01 mistura de Hyb: PBT, (D) 100 ul / amostra de uma mistura de 1:3 de Hyb: PBT, (E) 400 ul / amostra de PBT.
16. Enxaguar as amostras com 100 uL de solução de lavagem A, em seguida, executar o passo de lavagem com 100 ul / amostra de AD soluções a 56 ° C durante 15 minutos cada. Em seguida, lava-se amostras de quatro vezes durante 5 min com 100 ul / amostra de solução E, a 56 ° C.
17. Amostras arrefecer à temperatura ambiente.

Visão geral: Esta secção descreve os anticorpos e reagentes de detecção utilizados para a detecção e a visualização da distribuição do sinal de hibridação de sonda de ARN a seguir. Estes passos estão descritos de forma esquemática na Figura 2. Aqui nós apresentamos apenas os reagentes de detecção normalizados que utilizamos para a amplificação do sinal robusto, mas existe uma variedade de reagentes disponíveis comercialmente, que podem ser utilizados como alternativas, especialmente quando realizar FISH dupla experiências de co-detectar RNAs diferentes simultaneamente para a proteína-RNA duplo coloração. Exemplos de resultados obtidos com este protocolo são mostrados no padrão de mosaico mRNA expressão / localização na Figura 3.

Materiais

• HRP conjugada com anticorpo monoclonal de ratinho anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. No. 200-032-156)
• A biotina conjugada com anticorpo monoclonal de ratinho anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. gato. Não. 200-062-156)
• Estreptavidina-HRP (Molecular Probes, Eugene OR, EUA, cat. No.S991)
• Cy3-tiramida conjugados (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, EUA, Gato. Não. SAT704A)
• DABCO solução de montagem: Num tubo de 50 ml, diluir 1,25 gramas de DABCO (1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano, Sigma D-2522) em 15 ml de 1X PBS, em seguida, adicionar 35 ml de glicerol e mistura até que esteja totalmente homogênea. Por pré-mistura com PBS, o pó é dissolvido DABCO muito rapidamente. Solução de loja de montagem à temperatura de -20 ° C.
• Lâminas de vidro, lamínulas

Equipamento

• Nutação misturador
• Pipetador multicanal
• Microscópio de fluorescência

1. Prepare PBTB solução, contendo PBT + 1% de leite seco não gordo (normalmente 50-100 ml é suficiente para todas incubação do reagente de detecção e as etapas de lavagem).
2. Bloquear as amostras durante 10 min à temperatura ambiente em 100 PBTB ul / amostra, enquanto agitando na Nutator.
<li> Remover solução de bloqueio a partir de embriões e as amostras a incubar durante 1,5-2 horas à temperatura ambiente com 100 ul / amostra monoclonal biotina da solução de anticorpo anti-DIG (diluído a 1/400 de estoque em PBTB) com agitação.
3. Lave as amostras 6 vezes durante 5 minutos cada uma com 100 PBTB ul / amostra, com agitação.
4. Incubar 1,5 h à temperatura ambiente com 75 ml / amostra de solução de estreptavidina-HRP (diluído a 1/100 de estoque em PBTB, 10 ug / ml de concentração final), com agitação.
5. Lave as amostras 6 vezes durante 5 minutos cada. PBTB 100 ul / amostra com agitação (para a contracoloração DNA, diluir DAPI a concentração 1X trabalhando em PBTB e usar esta solução no passo de lavagem primeiro)
6. Enxaguar embriões com PBT, em seguida, lavar duas vezes durante 5 min com PBS.
7. Incubar as amostras durante 2 horas à temperatura ambiente no Nutator com 50 ul / amostra de Cy3-tiramida solução (diluído a 1/50 em tampão de amplificação tiramida). A partir deste passo, certifique-se para manter as amostras em um recipiente blindado luz. </ Li>
8. Lave as amostras 6 vezes durante 5 minutos cada um com 100 ul de PBS / amostra em Nutator.
9. Remover PBS e adicionar 100-125 ul / amostra de solução de montagem contendo glicerol a 70% e 2,5% (DABCO). Armazenar as amostras a 4 ° C. Estas amostras podem ser armazenadas durante vários anos.
10. Utilizando uma ponta de grande calibre, ressuspender os embriões por pipetagem suave e transferir as amostras de 25 ul de embriões em uma lâmina de vidro, em seguida, colocar uma lamela sobre os embriões e vedação sobre a lâmina com unha polonês.
11. Analisar amostras de embriões, utilizando um microscópio de fluorescência.

Quando realizada com sucesso, este procedimento oferece um nível notavelmente melhorada de detalhe na análise espaço-temporal da expressão gênica e dinâmica de localização de mRNA durante a embriogênese Drosophila cedo. De fato, como ilustrado na Figura 3A para o nanico gene clássico par-regra (pista), pode-se usar este protocolo para observar eventos de expressão gênica por meio da detecção de focos transcrição nascente em grupos de núcleos expressando. Além disso, como mostrado no mosaico embrião na Figura 3B, o método permite a visualização das características de localização do mRNA em alta resolução.

Figura 1. Esboço de RNA procedimento de preparação da sonda. (A) Representação esquemática da nossa estratégia para a síntese de sondas Dig marcados RNA por transcrição in vitro usinga molde de ADN linear de ARN de bacteriófago flanqueado com elementos promotores da polimerase. (B) Imagem de padrão de 1% em gel de agarose mostrando exemplos de sondas de RNA transcrito in vitro para a histona H2A, execução e RNAs doc transposon. Nós normalmente realizar uma electroforese lado a lado de ambos o modelo de PCR e sonda de RNA. O RNA normalmente aparece como uma banda intensa discreta com uma mobilidade maior em comparação com o modelo

Figura 2. Representação esquemática dos passos de sonda de detecção do método de FISH. Após a hibridação da sonda de embriões transformados, as sondas marcadas com Dig são reconhecidas utilizando um anticorpo biotinilado α-Dig, que é então complexado com estreptavidina conjugada a HRP. A amplificação de sinal tiramida (TSA) é então realizada, resultando na transformação do reagente de tiramida em t forma de radical livrehrough a actividade da HRP. Transitoriamente reactivos tiramida radicais livres ligar covalentemente aos resíduos aromáticos de proteínas próximas, impedindo a sua difusão para longe do local da sonda. O substrato de tiramida é complexado com corantes fluorescentes, que podem ser detectados por microscopia de fluorescência.

Figura 3. Exemplos de resultados obtidos através deste procedimento FISH destacando a diversidade da expressão de mRNA e padrões de localização subcelular em embriões de Drosophila. (A) análise FISH do gene par-regra executado em fases distintas da embriogênese revela como a expressão inicial ampla na porção média do embrião em estágio embrionário 4 é refinado em um padrão de distribuição segmentada em fases posteriores. (B) representação do mosaico de resultados peixe mostrando diferentes variedades de localizatio mRNAn padrões em embriões de fase de 4-7. FISH foi realizada utilizando sondas marcadas com DIG-anti-sentido que foram hibridadas e detectados por incubações sequenciais com o anticorpo anti-Dig biotinilado, estreptavidina-HRP, e Cy3 tiramida. RNA = azul, DNA = vermelho. Barra de escala em (A) = 25 uM, enquanto que em (B) = 50 uM.

Não há conflitos de interesse declarados.