Summary
慢性输注葡萄糖和脂肪乳大鼠的一种协议。该模型可用于研究营养过量对器官功能和生理参数的影响。
Abstract
长期暴露在过多的营养水平推测影响多个器官和组织的功能和许多与肥胖相关的并发症，代谢综合征，包括2型糖尿病的发展做出贡献。要研究的机制，葡萄糖和脂肪酸的含量超标会影响胰腺β-细胞分泌胰岛素，我们已经建立了一种慢性营养输液在大鼠模型。该程序由右颈静脉和左颈总动脉置管全身麻醉下，允许7天的恢复期;导管连接使用一个旋转的泵和配重系统，使动物在笼子里自由移动;和注入葡萄糖和/或脂肪乳剂（大豆油乳剂与肝素注入时产生约80的％unsaturated/20％的饱和脂肪酸的混合物），72小时。该模型提供了一些优势的水电站，包括精细调节的目标水平的葡萄糖和脂肪酸循环的可能性;合作注入药类化合物的选项，以及相对短的时间内，而不是饮食模型。它可以用来检查营养引起的功能障碍的机制，在各种器官和测试药物的有效性，在此上下文中。
Introduction
向2型糖尿病的发病机制，通过改变一些器官的功能，在维持葡萄糖体内平衡，包括有牵连，长期升高的血糖和血脂水平的循环中已被提出，但不限于，胰腺β-细胞（评论在1）中。糖毒性假说认为慢性高血糖引起高血糖摆在首位，从而形成恶性循环，在2型糖尿病患者血糖控制的恶化加剧了β细胞的缺陷。同样，glucolipotoxicity的假说认为，由于经常在2型糖尿病患者中观察到，伴随升高的血糖和血脂水平的β细胞的不利。
破译长期升高的营养物质的有害影响胰岛β-细胞功能的细胞和分子机制的理解是关键2型糖尿病的发病机制中的1毫微克。为此，大量的研究已审查机制在孤立的胰岛体外克隆，胰岛素分泌细胞线，慢性营养过剩体外 。然而，这些模型系统的整个有机体中得到的结果的翻译是复杂的，特别是因为用于在培养的细胞或胰岛细胞的脂肪酸的浓度很少2 在体内的β细胞中的周边相匹配的循环水平。另一方面，营养过量的β细胞功能衰竭的机制已被被检查的糖尿病的啮齿动物模型中，例如由朱克糖尿病大鼠脂肪3,4，沙土鼠Psammomys大眼金枪鱼 5和高脂肪的饮食美联储鼠标6。然而，这些模型中，其特征在于由内在代谢异常，并且不能容易地适合于操纵血糖和/或脂质水平中的更多的控制和慢性的设置。为了能够改变血中营养水平的时间表在其他正常动物的天，我们已经开发出一种慢性输液正常大鼠模型，使我们能够检查血脂和血糖的影响，单独或组合，生理参数和函数7,8。
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Protocol
概述：该过程包括右颈静脉和左颈总动脉置管在全身麻醉下，允许7天的恢复期;导管连接使用一个旋转的泵和配重系统，使动物在笼子里自由移动;输注葡萄糖和/或脂 肪乳剂（大豆油的乳液生成的混合物约80％unsaturated/20％的饱和脂肪酸时，注入肝素9）72小时。
1。右颈静脉和左颈总动脉Canulation
- 消毒手术器械。 canulation管也必须冷灭菌使用液体消毒剂（2.6％戊二醛）前的程序。油管浸入一个蒸压容器16-24小时。冲洗，并用无菌蒸馏水彻底冲洗戊二醛使用前删除所有痕迹。
- 称量大鼠，计算药物剂量：
卡洛芬5毫克/公斤：稀释1/10 =体重（克）所述0.001毫升SC（镇痛）
格隆0.01毫克/千克稀释1/10 = BW（七）所述0.0012毫升SC（抗胆碱） - 麻醉大鼠用异氟醚和氧气。
- 大鼠放置在其肚子上。剃须面积耳朵后面的肩膀基地。莱老鼠在它的后面。剃须区域脖子下的前爪。
- 准备外科手术部位与洗必泰，酒精，和碘。管理药物。
- 将大鼠的手术野。
- 使用无菌技术，canulate右颈静脉和左侧颈总动脉，用PE-50 5 U的肝素生理盐水1 ml注射器填充有连接到插管。 50 U的肝素盐水冲洗canulas恢复期间避免凝血。使用减弱23G的针头。关闭每套管用23G针。
- 手术后，削减约2.5毫米关闭底部门齿和大鼠在输液外套，以防止被吃掉canulas。
- 提供氧气（1升/分钟，10分钟），以协助疏散异氟醚。
- 将大鼠在加热笼，直到它完全清醒。
- 操作只大鼠使用每一个输液条件（ 见表1）。
2。手术后的护理（手术后的治疗和导管连接）
- 称量大鼠第1天，手术后第2天。
- 管理格隆（BW（克）×0.00048毫升）SC一次手术后第1天，第2天手术后两次。
- 如果有必要，可以给予额外的支持治疗：液体，加热垫，湿饮食，氧疗，止痛药，抗胆碱能药物。
- 手术后的第7天，大鼠重计算输液流速。
- 将每只大鼠输液系统使用的系绳和旋转安装在一个笼子里格栅的顶部（图1）。
- 5 U肝素盐水去除血块冲洗canulas。冲洗canulas，再一次与50 U的肝素盐水，以防止凝血。
- 允许大鼠系绳适应和旋转输液开始前至少24小时。
3。注入
- 绘制0.15毫升的血，从每只大鼠的颈动脉并测量血糖。冲洗颈canulas。使用50 U的肝素盐水在每只大鼠的canulas都以防止凝血。
- 血液样品转移到0.5 ml收集管中含有2％的EDTA。 10,000 rpm下离心2分钟，于-20℃下冻结等离子
- 填写两个60毫升的注射器各输液下面列出的条件。将注射器1靠前的位置在后卫位置上的泵泵和地方注射器2。
- 一起加入每对解决方案与y轴的连接器和CO-EX T22管经过消毒。将注射器在哈佛33双注射器泵。
- 更改笼底，并删除所有的食物从笼子格栅顶部。
- 称取150克的标准饲料和地点上笼格栅顶部。
- 将注射器旋转笼格栅。冲洗注射器，从线，以去除残留空气。
- 之前所连接大鼠输液系统使用体重计算输液流速。 Microsoft Excel文件转换成毫升/小时的葡萄糖输注率（GIR）的价格计算。
- 将泵设置为管理根据制造商的设定流速为60毫升注射器。输入的速度注射器1（前面注射器）和汇率注射器（注射器）。
- 启动泵。
4。监控
- 启动泵后，确认有没有从旋转或从canulas的泄漏和不扭曲，输液管。也验证了，有没有气泡管子。
- 经过3小时的输液，采取血液样本，监测血糖。重复后，6，24，48，和72小时的输液。作为预防措施，还监测血糖30，34，54和60小时后的输液。用一滴全血使用的是便携式的血糖监测仪，可以测量血糖。这限制了在输液过程中绘制的血液量，因此就避免了显着改变的血容量和/或血细胞比容。
- 注射器1的汇率在被修改，根据血糖值维持血糖在220-250毫克/分升。 72小时输液过程中不会改变，因为游离脂肪酸维持在1 mmol / L的汇率注射器2
- 输液条件是成对的，使收到的对照组动物的体积相当于为试验动物（ 表1）接收的体积。
- 经过24小时的输液，改变笼底和权衡留在笼子里烧烤食物。返回吃剩的部分TØ笼格栅。 48小时后重复上述步骤。
- 填充注射器每天需要在72小时输液。
- 在输液过程中，始终遵循的大鼠炎症或不适的任何迹象。管理适当的照顾，如果需要的话。
5。输液后安乐死
- 输液72小时后，麻醉大鼠静脉注射0.5毫升（182毫克/公斤的氯胺酮和11.6毫克/公斤甲苯噻嗪1:2稀释，0.9％氯化钠）氯胺酮/甲苯噻嗪的鸡尾酒。
- 脚趾捏反射是用来验证麻醉水平。额外的麻醉管理需要。
- 当大鼠麻醉，打开腹腔手术剪。将大鼠放血，通过绘制从主动脉或腔静脉的注射器中的10-15毫升的血液。
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Representative Results
出一系列42只大鼠接受手术，在手术后期间丢失5只和1只，占整体86％的成功率在输液过程中丢失。最终注入的37只大鼠的平均体重为608±5克术前588±6克，开始输注（平均±SE，N = 37，P <0.0001配对t检验）。 2输液组：生理盐水（SAL），葡萄糖+脂肪乳（GLU + IL）。 图2A和2B显示血糖和脂肪酸水平，分别获得以下具有代表性的结果，在72小时输液期间。按照设计，血糖水平维持在约220〜250毫克/分升，在整个输液，根据定期的测量和调整的，如在图3中示出的葡萄糖输注率（GIR）。鼠害通过增加内源性胰岛素本身有很强的能力，以弥补葡萄糖输液吸积。因此，GIR的血糖水平保持在一个相对稳定的状态的输液过程中，必须增加。然而，血液中的葡萄糖水平降低的倾向朝输液结束时，如在图2A中看到。由于动物注入热量的营养，他们自发地降低他们的食物摄取量（ 图4）。
| 输液条件 | 注射器1（前仓） | 注射器2（后卫的位置上） |
| 1 | 葡萄糖70％ | 盐水 |
| 2 | 盐水 | 盐水 |
| 3 | 葡萄糖70％ | 脂肪乳20％+肝素20U/ml |
| 4 | 盐水 | 脂肪乳20％+肝素20U/ml |
表1中。输液治疗方案。
图1。照片显示导管和系绳，旋转和平衡臂的大鼠输液系统装在笼子里烧烤。
图2。血浆中的葡萄糖水平（A）和游离脂肪酸（B）的生理盐水（SAL）或联合输注葡萄糖和脂肪乳剂（GLU + IL），6个月大的Wistar大鼠的输液过程中，数据是平均值±标准误差的3 -在各组中的4只动物。
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图3。在共输注葡萄糖和脂肪乳剂（GLU + IL），6个月大的Wistar大鼠的葡萄糖输注率的调整。数据是4只动物的平均值±标准差。
图4。 6月龄Wistar大鼠注入用生理盐水（SAL）或联合输注葡萄糖和脂肪乳剂的平均每日食物摄取量（GLU + IL）。数据是平均值±SEM 3-4各组动物。 ** P <0.01。
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Discussion
虽然所采用的以往的研究慢性输注葡萄糖（ 例如 10-15）或脂质（ 如 16,17）在啮齿动物中，据我们所知，这两种燃料的联合输注已被发现在小鼠18。这里介绍的慢性输液模型提供了多种优势，在大鼠多种生物学功能的影响进行研究营养过剩。首先，它并不涉及遗传性肥胖的啮齿动物，因为人类常见的肥胖是19多基因遗传，因此，结果是更可能是在一般人群中的营养过剩的影响有关。其次，这种模式提供了可能性，在不同的循环水平测试的影响，不同的营养素（尤其是糖或脂肪），通过改变其性质和输液流速。三，四的给药途径使化合物或药物的联合输注一起NUTRients 20。最后，相对短的时间内（72小时与周高脂饮食诱导模型）的实验成本和时间效益的临床前研究。
这种模式也有一些缺点和局限性。首先，任何手术模型需要高度训练有素和熟练的人员，在无菌手术。第二，所提到的代表结果节动物趋向，以补偿通过增加内源性胰岛素分泌，这就要求频繁地监测血糖水平，并调整GIR保持目标的血糖水平在整个输液的葡萄糖输注。第三，这个程序是不容易适用于小鼠，这将是需要的，以便在转基因动物的使用。根据我们的经验，在技术上具有挑战性的小鼠颈静脉，颈内动脉，在这些小动物，最简单的方法是放置菊导尿奇异导管输液和样品从外围容器。这一点，但是在输液过程中，相当大的限制的数量和频率的采样。
由于我们实验室关注的焦点，我们已经使用这个模型来研究在胰腺β-细胞7,8的glucolipotoxicity机制。但是，它可以被应用于营养过剩的影响进行研究，在任何组织和器官，例如，但不限于，21的心脏，骨骼肌，22，和肝脏23。
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Disclosures
文森特Poitout是共同创始人和研究合约Bêtagenex公司，合同研究组织，提供输液模型在这篇文章中提出，作为一个商业服务。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（R01DK58096到文森特Poitout）的支持。文森特Poitout持有加拿大研究主席在糖尿病和胰岛β细胞功能。贝德Zarrouki收到来自默克和礼来公司博士后奖学金。 Ghislaine FONTES是由加拿大糖尿病协会的博士后奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline 0.9% | BD | JB1324 | |
| Dextrose 70% | McKesson | ||
| Intralipid 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metricide (Glutaraldehyde 2.6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Heparin Sodium 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| Carprofen | Metacam | ||
| Glycopyrrolate | Sandoz | ||
| Isoflurane | Abbott | ||
| Chlohexidine 2% | |||
| Alcohol 70% | |||
| Iodine | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Connector 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Swivel 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-Connector 22G | Instech Solomon | ||
| Counterbalance and arm | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G blunted needles | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G canulation pins | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Tethers (12 inch) | Lomir | RT12D | |
| Infusion jackets | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Tether attachment piece | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| 1 ml syringe | BD | 309602 |
References
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