Summary
Transsellüler protein etkileşimleri pankreatik beta hücre fonksiyonu önemli belirleyicidir. Burada ayrıntılı bir yöntem uyarlanmış özel transmembran proteinler insülin salgılanmasını nasıl etkilediğini araştıran sinaptogenez-için bir kokültürü model. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri ilgili proteinlerin ifade eder; beta hücreleri transfekte edilmiş veya başka şekilde doğrudan tedirgin gerekmez.
Abstract
Hücre yüzey proteinleri arasındaki etkileşim, komşu hücrelerin fonksiyonu koordine yardımcı olur. Pankreas beta hücreleri pankreas adacık içinde bir araya kümelenmiş ve glikoz dengesini korumak için koordineli bir şekilde hareket edilir. Bu komşu beta hücrelerinin yüzeylerinde transmembran proteinler arasındaki etkileşimleri beta-hücre fonksiyonu önemli belirleyicileri olduğu giderek daha açık hale gelmektedir.
Kültür beta hücreleri veya in vivo olarak demonte, knockout ya da aşırı çalışmalarla özellikle transsellüler etkileşimlerinin rol izahı potansiyel etkileri analiz karıştırabileceklerinden edemeyeceği şekilde beta hücresi, sağlık ve / veya fonksiyonunu etkileyen, mRNA ve protein ekspresyonu, doğrudan pertürbasyon gerektiren spesifik etkileşimler. Bu yaklaşım, aynı zamanda hedef proteinlerin hücre içi etki düzeyleri değiştirebilir ve dis olmak için aynı hücre zarı içindeki proteinler arasındaki etkileşimlere bağlı etkileri önleyebilirtranssellüler etkileşimlerin etkileri bir biçimde ayrılır.
Burada beta hücrelerinin insülin salgılayan kapasitesi ve yanıt belirli transsellüler etkileşimlerin etkilerini belirlemek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, INS-1 hücreleri gibi beta-hücre hatları, ve ayrışmış primer beta hücreleri için de geçerlidir. Bu HEK293 (veya COS) sinaps oluşumu sürüş için önemli hücre tabakaları tespit proteinler üzerinde ifade belirli nöronal proteinlere kültürlü nöronların maruz kalma bulundu neurobiologists, tarafından geliştirilen kokültürü modelleri dayanmaktadır. Nöronal sinapsların ve beta hücrelerinin salgı makine arasındaki paralellikler göz önüne alındığında, beta-hücre olgunlaşması benzer transsellüler etkileşimleri ile tahrik olabilir gerekçeli. Biz beta hücreleri ilgi bir protein ifade eden HEK293 hücreleri bir tabaka üzerinde kültive edildiğinde, bir sistem geliştirilmiştir. Bu modelde, beta hücre sitoplazması dokunulmamış bir hücre dışı protein-protein ETKİLEŞİM ikenns manipüle. Öncelikle glikoz ile uyarılan insülin sekresyonunda çalışmalar burada odak rağmen, diğer işlemler analiz edilebilir, örneğin, gen ekspresyonunda değişmeler gibi immünolojik veya QPCR tarafından belirlenir.
Introduction
Burada belirli bir transmembran proteinin hücre dışı etki insülin salgılanması nasıl etkilediğini araştırmalar kolaylaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Pankreatik beta hücre yüzeyi üzerinde proteinler (veya muhtemelen diğer moleküller) ile söz konusu protein etkileşimleri gibi bir yöntem problar etkiler. Gibi bir yöntem beta hücreleri tarafından veya diğer komşu hücreler (örneğin, endotel hücreleri, nöronlar, pankreatik alfa hücreleri) ifade eden hücre yüzeyi proteinlerinin transsellüler etkileşimler (örneğin, komşu yüzeyinde etkileşim ortakları ile etkileşim yoluyla yoluyla beta hücresi fonksiyonunu etkileyebilir nasıl araştırmalar sağlar: beta hücreleri).
, Hücresel plazma membranında hücre dışı ortam arasında bir köprü olarak hizmet veren yapısal ve fonksiyonel proteinlerin kompleks bir dizi içerir. Transsellüler bağlantı oluşumu ile ya da plastik sinyal olaylarını başlatılarak, hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi koordine yardımcı olabilirKomşu hücrelerin fonksiyonu. Pankreas beta hücreleri pankreas adacık içinde bir araya kümelenmiş ve glikoz dengesini 1 korumak için koordineli bir şekilde hareket edilir. Hücre dışı epha-ephrinA ve glikoz ile uyarılan insülin salgılanmasının düzenlenmesinde neuroligin-2 etkileşimlerinin önemi, örneğin, ortaya çıkardı, bu daha da açık hale gelmektedir, bitişik yüzeyleri üzerinde proteinler arasında meydana gelen hücre dışı etkileşimler artan bilgi beta hücreleri insülin salgılanması, beta hücre fonksiyonel olgunlaşması ve 1-3 glikoz dengesinin bakım tam bir anlayış kazanmak için büyük önem taşıyacaktır. Burada açıklanan yöntemin amacı, belirli bir transmembran veya başka şekilde-hücre yüzeyi ile ilişkili proteinler içeren transsellüler etkileşimleri beta hücre fonksiyonu üzerindeki etkileri araştırmalar sağlamaktır. Farklı ifade yapıları ile transfekte HEK293 hücreleri, B üzerindeki etkileri ile birlikte-kültür beta hücreleri tarafındanFarklı hücre yüzey proteinleri ya da mutasyona uğramış varyantları eta hücre fonksiyonu bunların etkin bir şekilde araştırılabilir. Bu beta hücreleri transfekte etmek için kendilerini kalmadan gerçekleştirilir.
Kültür beta hücreleri veya in vivo olarak demonte, knockout ya da aşırı çalışmalarla özellikle transsellüler etkileşimlerinin rol izahı potansiyel analizi etkilemesi için değişik şekillerde beta hücre sağlık ve / veya fonksiyonunu etkileyen, beta hücresi mRNA ve protein ekspresyonu, doğrudan pertürbasyon gerektiren özel hücre dışı etkileşim etkileri. Bu, aynı zamanda, hedeflenen proteinlerin hücre içi etki düzeyleri değiştirmek ve daha fazla, transsellüler etkileşimlerin etkileri ayırt edilmesi ya da aynı hücrede protein arasındaki etkileşimlere bağlı etkileri izin vermez yaklaşır. Burada, beta-hücrelerinin insülin salgılayan kapasitesi ve yanıt belirli transsellüler etkileşimlerin etkilerini belirlemek için bir yöntem olup DescriIBED. Bu yöntem, INS-1 hücreleri, 4 gibi insülin salgılayan beta-hücre hatları, ve ayrışmış primer veya kemirgen, insan beta hücreleri için de geçerlidir. Bu HEK293 (veya COS) hücre katmanları ifade belirli nöronal proteinlere kültürlü nöronların maruz kalma bulundu neurobiologists, tarafından geliştirilen kokültürü modelleri dayandığını sürücü sinaps oluşumu 5,6 proteinleri tespit olabilir. Nöronal sinaps salgı makine arasında ve beta hücrelerinin paralellikler göz önüne alındığında, beta-hücre fonksiyonu ve fonksiyonel olgunlaşma benzer transsellüler etkileşimleri 7-9 ile tahrik olabilir gerekçeli. Bu etkileşimler prob amacıyla, beta hücreleri ilgi 10 bir protein ifade eden HEK293 hücreleri bir tabaka üzerinde kültüre edildiği tarifnamede açıklanan sistem geliştirilmiştir. Bu sistem, hücre-dışı protein-protein etkileşimleri manipüle edilir ise, beta hücre sitoplazması bakir kalmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HEK293 Katman Transfeksiyon
- 50 ml FBS, 5 ml 100X Penisilin / streptomisin solüsyonu, 5 ml 100x L-glutamin solüsyonu ve 500 ul amfoterisin: DMEM 500 ml'lik şişelerde (4.5 ug / ml glükoz, fenol kırmızısı ile ve glutamin olmadan) ekleyerek HEK293 hücre ortamı hazırlayın B.
- De başına HEK293 medya 0.5 ml kullanarak 24 plaka HEK293 hücreleri plaka. Hücrelerin plakanın alt üzerine yayılıyor emin olun.
- HEK293 hücreleri plazmid Lipofectamine protokolüne uygun olarak ilgi duyulan proteini (bir memeli ifade vektörünün içine) ve Lipofectamine 2000 2 ul kodlama 0.8 mikrogram ile% 100 birbirine karışmış, transfekte ulaşır. Biz memeli hücrelerinde ifade için tasarlanmış pcDNA 3.3 omurga kullanmak için seçtiniz.
- İsteğe bağlı olarak, 6 saat inkübasyon sonrasında değişimi transfeksiyon ortamı normal HEK293 ortam ile Lipofektamin protokolde tarif edildiği.
- Transfekte prote ifade değerlendirmekolarak, transfekte edilmiş doku kültürü gözenekli bir alt kümesini ifade edilen protein immunofloresans tespiti için ya da standart teknikler kullanılarak protein ekspresyonu, Western blot analizi için kullanılabilir.
2. HEK293 hücreleri isteğe bağlı fiksasyonu Transfekte protein ifade
Transfekte HEK293 hücreleri hafifçe HEK293 hücreleri (örneğin aşağıda adım 3.9) yaşayan veya (ayrıca Tartışma) tek seferde birçok deneyler için plakaların önceden etkin hazırlık sağlamak için zararlı olabilir medyada kokültürü kolaylaştırmak için sabitlenebilir.
- HEK293 hücrelerinde protein ifade zaman ders belirlemek için pilot çalışmalar yapmak.
- HEK293 hücre tabakası transfecting sonra, ifade en üst düzeyde ilişkili sonrası transfeksiyon zaman noktasında hücrelerden medya aspire. Bu ilk 24 saat içinde meydana gelirse, transfeksiyondan 24 saat sonra aspire kadar yoktur.
- HE YıkamaYavaşça D-PBS ile K293 hücreleri daha sonra 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. (% 4 PFA çözüm yapmak için, 1X PBS içinde% 16 solüsyonu ile başlar ve 1X PBS 1:4 sulandırmak.)
- Steril PBS kullanarak, yavaşça 4 ° C de PBS O / N hücreleri 3 kez yıkama ve inkübe
- Hücreler steril PBS ile 3 kez yıkayın, daha sonra PBS ekleyin ve 4 bırakın ° C kadar ihtiyaç duyulan (maksimum saklama süresi ifade protein bağlı olarak değişebilir. Biz gözlenen etkileri önemli değişiklikler olmadan 2 hafta için neuroligin izoformlar ifade etmek için transfekte HEK293 hücreleri saklamak insülin salınımı üzerinde).
3. HEK293 Hücreler ile INS-1 Beta Hücreleri Co-kültür
- (Glikoz ve fenol kırmızı ve glutamin olmadan) 500 ml RPMI 1640 ekleyerek INS-1 ortamı hazırlayın: 50 ml FBS, 5 ml 100X Penisilin / streptomisin, 5 ml 100X L-glutamin çözeltisi, 5 ml sodyum piruvat, 500 ul amfoterisin B, 500 ul beta-merkaptoetanol (bu medi neredeyse aynıdırum tipik olarak beta-mersaptoetanol ilavesi) hariç olmak üzere birinci adacık kültürü için kullanılmıştır.
- (Veya başka bir enzimatik olmayan hücre sökücü) Hücre-striptizci kullanarak, hasat INS-1 T75 kültürü şişesi altındaki kapalı confluency yaklaşık% 70-80 olarak hücreleri. Her şişe 48 kuyu için yaklaşık yeterli hücre sağlayacaktır.
- INS-1 ve HEK medya bir 50/50 karışımı içinde tekrar süspansiyon 1,200 rpm'de 3 dakika boyunca santrifüj hücre aşağı iplik sonra. INS-1 hücreleri, bir% 70-80 oranında konfluent şişeye, karma ortamın yaklaşık 25 ml süspansiyon haline getirin.
- Yerine canlı HEK293 hücreleri daha paraformaldehid giderildi HEK293 hücreleri kullanıyorsanız,% 100 yerine karışık teknik daha INS-1 medya INS-1 hücreleri tekrar süspansiyon.
- 10 ml'lik bir pipet kullanarak, homojen bir hücre süspansiyonu için pelet hücreleri çıkarmak.
- HEK293 hücreleri üzerinde ortamı çıkarmak için aspire.
- Bir P1000 pipet kullanarak, yavaşça o kenarları boyunca HEK hücre tabakası üzerine INS-1 hücre süspansiyonu 500 ul ekleyinf iyi. Her 6 kuyu sonra, homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için tekrar INS-1 hücreleri tekrar süspansiyon 10 ml'lik bir pipet kullanın. Kokültürü kurulum genel şeması Şekil 1 'de tasvir edilmiştir.
- Deneysel protokol bağlı olarak 24-48 saat boyunca inkübe hücreleri.
- Fazla 48 saat kokültürü süresi gerekiyorsa, HEK293 hücreleri düzeltmek için bölüm yukarıdaki 2 isteğe bağlı adımları kullanın.
- Birincil ayrışmış kemirgen ya da insan adacıklar kullanarak [örneğin vallahi 11-15 öncesinde protokolleri görmek] ise, 5 ml kalem / strep, 5 böyle RPMI gibi uygun bir ortam ml L-Glut, 0.5 ml amfoterisin-B yerine kullanılmasını sağlamak INS-1 medya. Bir çünkü potansiyel olarak gerekli adacıklar çok sayıda uygulamada, bir 24 plaka ayrışmış adacık hücreleri kullanabilirsiniz rağmen, göz bir 48 plaka (iyi başına daha az adacık hücre gerektiren) için ölçekleme aşağı verilmesi önerilir. Bir 48 plaka üzerinde, çözülme değerinde yaklaşık 100 adacık ekleyinbaşlatmak için plaka başına ted hücreleri. Ayrışma etkinliği ve kullanılan yönteme bağlı olarak, daha az sayıda adacık gerekebilir.
4. Glikoz insülin salgılanması Uyarılmış
- 1 saat arasında, en az KRB 2.5 mM glükoz (Krebs-Ringer bikarbonat tamponu), 250 ul hücre Preincubate. , Preincubate kokültürü orta kaldırmak ve hemen KRB ile değiştirmek için. Bu değişim ortamdaki oksijene INS-1 hücreleri etkisini en aza indirmek için, bir seferde bir tane de yapılmalıdır. Diğer düşük (2.5 mM) glukoz KRB pipetleme sırasında tek elle aspire.
- 2.5 mM veya bir zamanda iyi KRB tamponu biri 20 mM glükoz ya da 250 ul inkübasyon öncesi değişimi KRB.
- Belirli bir deney için uygun olduğu takdirde, örneğin 100 uM IBMX gibi ek salgı daha sağlam bir uyarılmış insülin salgılama tepkisi üretmek için ilave edilebilir. Özellikle ayrışmış birincil adacık beta hücreleri artmış glukoz konsantrasyonları Alon için kötü duyarlıE, yani IBMX veya diğer salgı burada özellikle ilave 16,17 dikkate alınmalıdır.
- Inkübasyondan 1 saat sonra, ortam tüpler mikrofuge'de ve 5 dakika boyunca 1500 x g'de dönmeye aktarın.
- Süpernatant 200 ul çıkarın ve insülin RIA veya ELISA ile analiz için kullanabilirsiniz.
- Hücre lisatı hazırlamak için, (% 1.0 IGEPALCA-630 veya Nonidet P-40,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS, 50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCI), proteaz inhibitörleri için RIPA hücre parçalama tamponu 100 ul hemen 4 de medya ve inkübe kaldırarak ° C 20 dakika sonra plaka.
- 10,000 x g 'de 15 dakika boyunca lizat Spin ve insülin RIA ve ELISA ile analiz için süpernatan 50 ul çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan yöntem kullanılarak, insülin salgılanması üzerindeki protein neuroligin farklı türevleri etkisini test ettik. Bu beta hücresi işlevi, 10 neuroligin-2 etkisini araştıran eden yayımlanmış çalışma tamamlar. Şekil 2, örneğin, burada adlandırılan bir neuroligin izoformu ifade etmek için transfekte HEK293 hücreleri ile birlikte coculturing INS-1 beta hücrelerinden elde edilen sonuçları göstermektedir NL- X Bu deney NL-X insülin salgısını artırdığı transsellüler etkileşimleri yürütmektedir hipotezini test etmek için tasarlanmıştır. Şekil 2A, bu NL-X ifadesi bazal artarak kokültür INS-1 hücreleri tarafından insülin salgılanmasını uyardığı görülmektedir. HEK293 hücreleri transfekte yaklaşımı böylece NL-X ifade bize bu hücre-dışı etki alanı kokültür INS-1 hücreleri bu getiren temas mümkün böylece HEK293 hücre yüzeyinde gösterilen bölge ve olduğunu bilmek sağlar obse hakkındasalgısında artış rved. NL-X hücre dışı alanı INS-1 hücreleri daha fazla insülin salgılaması için neden INS-1 hücre yüzeyi üzerinde bir başka protein (veya belki de başka bir molekül) ile etkileşime girmek gerekmektedir. Eğer arzu edilirse, salgılanan insülin de hücreler parçalanır sonra ölçülebilir hücresel insülin içeriği, bir yüzde olarak ifade edilebilir.
Şekiller 2B ve 2C, kokültürü sistemi kullanılarak analiz diğer türlerinden sonuçları tasvir edilmiştir: özellikle hücresel insülin içeriği ve PDX-1 ve insülin mRNA düzeyleri ile ilgili neuroligin varyant NL-Y içeren transsellüler etkileşimleri etkisinin analiz. NL-Y kokültür INS-1 hücreleri (Şekil 2B) arasında insülin içeriği artmıştır. Daha fazla test Bu bir hücre başına insülin miktarında artış ya da bağlı olarak artan INS-1 hücre çoğalması nedeniyle olup olmadığını belirlemek için gerekli olacaktır. Şekil 2C, RNA hücre hasat edilmiştirkatmanı ve RT-QPCR ile analiz edildi. HEK293 hücreleri HEK293 ve INS-1 hücreleri hem de mevcut olabilir transkript için, insan kaynaklı olduğu için, INS-1 kökenli sadece mRNA sağlar sıçan-spesifik PCR primerleri (INS-1 hücreleri sıçan kökenli) kullanımı ölçülür. Burada NL-Y kokültürü insülin ve PDX-1 mRNA seviyeleri (normalleştirme 18S RNA was) arttığı görülebilir. Bu RT-QPCR analizi için kullanılan primerler ve daha önce metodolojisi 10 ve online takviyesi tarif edilmiştir.
Şekil 1. Kokültürü set-up. HEK293 (HEK) hücreleri 24-iyi doku kültürü plakaları eklenir ve sonra transfekte. Temsilcisi HEK293 hücre tabakasının bir parlak bir alan görüntü sağ, üst gösterilir vardır. HEK hücreleri bir epitopa-etiketli transmembran proteini ifade etmek için transfekte edilir. Burada, immünofloresan boyama transfekte ortaya çıkarmak için kullanılırhücreleri (yeşil). Daha sonra, INS-1 hücreleri ilave edilir. İnsülin için immünofloresan boyama kokültür INS-1 hücreleri (kırmızı) görüntülenmesine izin uygulandı.
Şekil 2. Coculturing INS-1 neuroligin protein varyantları NL-X ya da NL-Y (doldurulan, siyah sütunlar). Kontrol HEK293 hücrelerinde ifade etmek için transfekte edilmiş HEK293 hücreleri ile birlikte beta hücrelerinden elde edilen sonuçlar olarak değil, böylece değiştirilmiş aynı plasmid konstruktları ile transfekte edildi proteinlerini ifade (beyaz sütunlar). (20 mM) ile düşük (2.5 nM) ve yüksek glikoz koşullar altında ve aynı zamanda IBMX ile birlikte yüksek glukoz ile uyarıldıktan sonra kokültür INS-1 hücreleri tarafından, insülin salgılanması. B, INS-1 hücresi insülin içeriği NL-Y eksprese eden HEK293 hücreleri ile kokültürü sonra. Cı analizi çalışanNL-Y ya da kontrol ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri ile transfekte ya da HEK293 hücrelerinde ile kokültür INS-1 hücreleri, izole edilen RNA kullanılarak, RT-qPCR insülin ve PDX-1 transkript seviyeleri olan. (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan kokültürü yöntemi özel beta-hücre yüzey, transmembran proteinlerin fizyolojik önemini belirlemek için etkili bir yol sağlar, ve özel olarak ekstrasellüler etki. Hücre yüzeyi üzerinde bir ilgi protein görüntüleme HEK293 hücreleri ile temas içinde kültürlenmesi beta hücreleri ya da insülinoma hücrelerine (örneğin, burada kullanılan INS-1 hücreleri gibi) ile, deney doğrudan zarar vermeden hücre dışı protein-protein etkileşimleri etkilerini belirlemek için dizayn edilebilir hücrelerin hücre içi ortamı. Ilgi duyulan proteinlerin HEK293 hücreleri tarafından ifade edildiği için, transfekte edilmiş proteinlerin hücre içi etki alanı tarafından aracılık edilebilir β-hücresi fonksiyonu üzerinde herhangi bir etkisi yok olacak ve bu nedenle hücre-dışı etkileşimler etkilerinin analizi karmaşık değildir.
Insülin salgılanması üzerindeki etkileri kolayca HEK293 hücreleri ile kültürlenmiş beta hücrelerinden salgılama karşılaştırılarak belirlenebilirKontrol HEK293 hücreleri ile temas halinde kültüre beta hücrelerinden salgılama için ilgi çekici bir proteini ifade. Kontrol HEK293 hücreleri Sahte transfekte edilmiş olabilir ya da alternatif olarak, ilgilenilen proteinin işlevsel olmayan bir türevi üretmek için mutasyona uğramış oluşturmak deney plazmid ile transfekte edilmiş bir türevi olabilir. Bizim ellerde, kontroller, her iki tür aynı sonuçları vermiştir. HEK293 hücre yüzeyi proteinlerinin doğal olarak büyük bir çeşitlilik içerdiği için, her iki tip kumanda ilgilenilen proteini dahil olmak üzere, pek çok farklı hücre yüzeyi molekülleri ile temas beta hücrelerin fonksiyonu temas beta hücrelerin fonksiyonu ile karşılaştırıldığında izin verir İlgi (veya ilgilenilen protein mutasyona uğramış bir versiyonu da dahil olmak üzere) bir protein haricinde hücre yüzeyi moleküllerinin aynı seti ile.
INS-1 hücreleri (ya da diğer beta hücreleri) diğer INS-1 hücrelerle INS-1 hücreleri arasında az ya da hiç bir temas olduğu kadar düşük yoğunlukta HEK293 tabakalar eklenirls. Bu, aynı protein içeren transsellüler etkileşimlerinin sebep olduğu potansiyel arka plan gürültü yokluğunda uyulması gereken INS-1 hücre yüzeyi üzerinde HEK293 hücre yüzeyi üzerinde ifade edilen ve proteinler ilgilenilen protein arasındaki transsellüler etkileşimlerin etkileri INS üzerinde endojen olarak ifade sağlar: -1 hücre yüzeyi.
Transfeksiyondan sonra, HEK293 hücre katmanı yumuşak sabit olabilir. Bu isteğe bağlı birden çok kokültürü tespit levhaları daha sonraki bir tarihte beta hücrelerinin eklenmesi için daha sonra bir kerede hazırlanacak izin vermek için kullanılabilir. HEK293 metabolizması veya salgı fonksiyonu bir şekilde beta hücre fonksiyonu analizi müdahale olacağını endişeleri olsaydı HEK293 hücreleri Tespit da avantajlı olacaktır. Son olarak, sabitleme protokol uzun kokültürü deneyler kolaylaştırmak için kullanılabilir. Burada, sabit HEK293 hücreleri kullanmanın başlıca avantajı beta hücreleri için uygun kültür ortamı yerine kullanarak daha kullanılabilir olmasıdırkarışık teknik (örneğin adım 3.3) aynı anda kokültür HEK293 ve beta hücreleri korumak için gerekli. Uzun süreli kokültürü deneylerde, her iki hücre tipi-can beta hücre canlılığı zarar için medya-ki iyi değil karışık kullanın.
Bu transfeksiyon için son derece müsait olduğu için HEK293 hücreleri burada kullanılmaktadır: farklı transfeksiyon reaktifleri 18,19 çeşitli kullanılarak yüksek verim ile transfekte edilebilir. Rutin olarak benzer nöronal sistemler 5 kokültürü çalışmaktadır - HEK293 türleri-birlikte COS hücreleri, iki hücre biridir. Lipofectamine 2000 derece sık yayınlanan çalışmalarında 18-20% 95'ten daha fazla HEK293 hücreleri ve rutin olarak elde transfeksiyon verimliliği (hücrelerin yüzde transfekte edilmiş) ile birlikte kullanılan bir kanıtlanmış transfeksiyon reaktiftir. Diğer reaktif transfeksiyon 19,20 benzer verimlilik elde edebilirsiniz. Bizim neuroligin-2 plazmid yapı ile, transfeksiyon verimliliği genel olarak ~% 80'dir. AltHough biz glikoz ile uyarılan insülin sekresyonunda çalışmalar burada odak, analiz diğer modlar FACS, immünohistokimya, batı lekeleme ve / veya, Şekil 2C, QPCR görülen, örneğin mümkündür.
Özellikle hücre dışı protein etkileşimleri işlevini ortaya çıkarmak yardımcı çok yararlı bir araç olmasına rağmen, yöntemi, sınırsız değildir Burada tarif. Beta hücreleri HEK293 hücre tabakası ile doğrudan temas içinde olması gerekir, bu yüzden, INS-1 hücreleri gibi insülinoması hücre hatları, özellikle bu kokültürü sistemi 4 için çok uygundur. Birincil adacık hücreleri için sonuçları çeviri izole adacık dispersiyon gerektirir. Adacık yapının kendisi uygun sinyalizasyon ve glikoza tepki ayrılmaz bir parçası olduğu için, uyarılmış insülin cevabı sağlam adacık 1,3,17 göre dağılmış birincil beta hücreleri içinde duraklamaktadır. Ayrıca, çünkü geçici transfeksiyon inci yeknesak ifadesi ile sonuçlanmaz görüntüleme tabanlı (immünohistokimyasal) deneyler HEK çim üzerinde e protein, protein ekspresyon düzeyleri için normalleştirmek için bir yöntem sonuçları yorumlamak gerekebilir. Kokültür INS-1 hücreleri sekretuvar makine, transfekte edilmiş proteinin etkisini analiz etmek için bu homojen olmayan ifade yararlanır deneysel yaklaşım Suckow ve ark. 2012, 10, Şekil 3'te gösterilmiştir.
Bu ilgi proteini ifade eden herhangi bir beta hücre ve komşu hücreler arasındaki temas ölçüde beta hücreleri hücreleri tarafından kuşatılmış olabilir ki, in vivo, bozulmamış adacıklarında daha bu sistemde daha az olması muhtemel olduğu da not edilmelidir proteini ifade. Ilgili transsellüler etkileşimler bir şekilde yerli adacıklar elendiği olsaydı bu göreceli olarak azalmış hücre-hücre teması insülin salgısının değişiklikler gözlenebilir ne altına büyüklüğünü azaltabilir.
e_content "yerine geçici transfeksiyon daha stabil-transfekte HEK293 hücrelerin klonal nüfus> Kullanım daha düzgün ifade neden ve muhtemelen deneysel set-up basitleştirmek, ama oluşturmak için istikrarlı bir şekilde sipariş önemli ölçüde daha dışa dönük zaman ve çaba gerektirecektir olur hücreleri ifade. yapılacak çalışmalar olacak HEK293 hücre tabakası, iki veya daha fazla transmembran protein transfecting tarafından, olası sinerjik etkileri gözlenebilir, belirlemek.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık hibe R01DK080971 ve Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı hibe 37-2009-44 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Biz UCSD Pediatrik Diyabet Araştırma Merkezi (PDRC) alınan destek de teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
