Summary
Transzelluläre Protein-Interaktionen sind wichtige Determinanten der Pankreas-Beta-Zell-Funktion. Hier ist eine Methode der detaillierten angepasste aus einer Co-Kultur-Modell-Synaptogenese zur Untersuchung, wie bestimmte Transmembranproteine Insulinsekretion beeinflussen. HEK293 Zellen exprimieren Proteine von Interesse; Beta-Zellen brauchen nicht transfiziert oder anderweitig direkt gestört.
Abstract
Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen-Proteine zur Koordination der Funktion der benachbarten Zellen. Betazellen der Bauchspeicheldrüse zusammen innerhalb Pankreasinseln gruppierten und handeln in einer koordinierten Art und Weise, um Glukose-Homöostase aufrecht zu erhalten. Es wird zunehmend deutlich, dass Wechselwirkungen zwischen Transmembranproteine auf den Oberflächen der angrenzenden Beta-Zellen wichtige Determinanten der Beta-Zell-Funktion sind.
Aufklärung der Rolle der insbesondere transzellulären Wechselwirkungen durch Knockdown, Knockout oder Überexpression Studien in kultivierten Beta-Zellen oder in vivo erfordert direkte Störung der mRNA und Protein-Expression, möglicherweise beeinflussen beta-Zelle Gesundheit und / oder die Funktion in einer Weise, die Analysen über die Auswirkungen verwechseln könnte von spezifischen Wechselwirkungen. Diese Ansätze auch ändern Niveaus der intrazellulären Domänen der Zielproteine und kann Auswirkungen auf Wechselwirkungen zwischen Proteinen innerhalb der gleichen Zelle Membran zu verhindern, dass disunterschieden von den Auswirkungen der transzellulären Wechselwirkungen.
Hier wird ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von spezifischen transzellulären Wechselwirkungen auf die Insulin-sezernierenden Kapazität und Reaktionsfähigkeit der Beta-Zellen präsentiert wird. Dieses Verfahren ist für Beta-Zell-Linien, wie INS-1-Zellen, und distanzierte primären Beta-Zellen. Es basiert auf Kokultur Modelle von Neurobiologen, die, dass die Exposition von kultivierten Neuronen spezifische neuronale Proteine auf HEK293 (oder COS) Zellschichten identifizierten Proteine wichtig für den Antrieb Synapsenbildung Ausdruck gefunden entwickelt wurde. Angesichts der Parallelen zwischen der sekretorischen Maschinerie der neuronalen Synapsen und der Beta-Zellen, begründeten wir, dass beta-Zelle funktionelle Reifung durch ähnliche transzellulären Wechselwirkungen könnte angetrieben werden. Wir entwickelten ein System, in dem Beta-Zellen auf einer Schicht aus HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse kultiviert werden. In diesem Modell wird das Beta-Zell-Zytoplasma unberührt, während extrazellulären Protein-Protein interactions manipuliert werden. Obwohl wir hier in erster Linie auf Studien von Glukose-stimulierte Insulinsekretion zu konzentrieren, können andere Prozesse analysiert werden, z. B. Veränderungen in der Genexpression durch Immunoblot oder qPCR bestimmt.
Introduction
Wir beschreiben hier eine Methode, um Untersuchungen, wie die extrazellulären Domänen spezifischer Transmembranproteine beeinflussen Insulinsekretion zu erleichtern. Die Methode Sonden die Auswirkungen der Interaktionen des Proteins von Interesse mit Proteinen (oder möglicherweise andere Moleküle) auf der pankreatischen beta-Zelloberfläche. Das Verfahren ermöglicht Untersuchungen, wie Zelloberflächen-Proteine durch Beta-Zellen oder anderen benachbarten Zellen (zB endothelialen Zellen, Neuronen, Bauchspeicheldrüsen-alpha-Zellen) exprimiert beeinflussen Betazellfunktion durch transzellulären Wechselwirkungen (zB durch Wechselwirkung mit Interaktionspartner auf der Oberfläche des benachbarten Beta-Zellen).
Die zelluläre Plasmamembran enthält eine komplexe Anordnung von struktureller und funktioneller Proteine, die als Brücken an die extrazelluläre Umgebung. Durch Bildung von transzellulären Verbindungen oder durch Einleitung von Kunststoff-Signalwege können Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen-Proteine helfen, koordinieren dieFunktion von benachbarten Zellen. Betazellen des Pankreas sind zusammen in den Langerhans-Inseln gruppierten und handeln in einer koordinierten Art und Weise, um Glukose-Homöostase 1 aufrecht zu erhalten. Wie soeben bekannt wurde, zum Beispiel durch die Bedeutung der extrazellulären EphA-EphrinA und neuroligin-2-Wechselwirkungen in der Regulation des Glukose-stimulierte Insulinsekretion, wird es immer klarer, dass eine erhöhte Kenntnis der auftretenden Wechselwirkungen zwischen extrazellulären Proteine auf den Oberflächen von benachbarten Beta-Zellen wird von großer Bedeutung für die Gewinnung ein umfassendes Verständnis der Insulinsekretion der Beta-Zellen funktionelle Reifung und der Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase 1-3 sein. Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, Untersuchungen der Auswirkungen auf die Beta-Zell-Funktion transzellulären Wechselwirkungen mit spezifischen Transmembran oder anderweitig-Zell-Oberflächen-assoziierten Proteinen ermöglichen. Durch Co-Kultivierung Beta-Zellen mit HEK293 Zellen mit unterschiedlichen Ausdruck Konstrukten transfiziert, die Auswirkungen auf die beta-Zell-Funktion verschiedener Zelloberflächen-Proteine oder mutierten Varianten davon können effizient sondiert. Dies wird ohne transfektieren die Beta-Zellen selbst zu erreichen.
Aufklärung der Rolle der insbesondere transzellulären Wechselwirkungen durch Knockdown, Knockout oder Überexpression Studien in kultivierten Beta-Zellen oder in vivo erfordert direkte Störung der Beta-Zell-mRNA und Protein-Expression, möglicherweise beeinflussen Betazellen Gesundheit und / oder die Funktion in einer Weise, die Analysen verwechseln könnte die Auswirkungen der extrazellulären Wechselwirkungen. Diese nähert sich auch ändern Niveaus der intrazellulären Domänen der Zielproteine und ferner nicht erlauben Effekte aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die am oder in der gleichen Zelle unter den Auswirkungen von Wechselwirkungen transzellulären unterscheiden. Hier ist ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von spezifischen transzellulären Wechselwirkungen auf die Insulin-sezernierenden Kapazität und Reaktionsfähigkeit der Betazellen Artbezibed. Dieses Verfahren ist für insulinproduzierenden ß-Zelllinien, wie INS-1-Zellen 4 und dissoziierte primären Nagetier oder humanen beta-Zellen. Es basiert auf Kokultur Modelle von Neurobiologen, die, dass die Exposition von kultivierten Neuronen spezifische neuronale Proteine auf HEK293 (oder COS) Zellschichten exprimiert gefunden entwickelten Proteine identifizieren konnte, die Fahrt Synapsenbildung 5,6. Angesichts der Parallelen zwischen der sekretorischen Maschinerie der neuronalen Synapsen und der Beta-Zellen, begründeten wir, dass Beta-Zell-Funktion und funktionelle Reifung durch ähnliche transzellulären Wechselwirkungen 7-9 könnte angetrieben werden. Um diese Wechselwirkungen untersuchen, haben wir das hier beschriebene System in der Beta-Zellen auf einer Schicht aus HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse 10 sind co-kultiviert. Dieses System ermöglicht die Beta-Zell-Zytoplasma unangetastet bleiben, während extrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen manipuliert werden.
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Protocol
1. Transfektion von HEK293 Schicht
- Bereiten HEK293 Zellmedium durch Zugabe zu 500 ml Flaschen DMEM (mit 4,5 g / ml Glucose und Phenolrot und ohne Glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X Penicillin / Streptomycin-Lösung, 5 ml 100x L-Glutamin-Lösung und 500 ul Amphotericin B.
- Platte aus HEK293-Zellen in einer 24-Well-Platte unter Verwendung von 0,5 ml pro Vertiefung HEK293 Medien. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig auf die Unterseite der Platte verteilt.
- Wenn HEK293-Zellen 100% Konfluenz erreichen Transfektion mit 0,8 ug Plasmid kodiert für das Protein von Interesse (eingesetzt in einem Säugetier-Expressionsvektor) und 2 ul Lipofectamin 2000 gemäß der Lipofectamin-Protokoll. Wir haben entschieden, den pcDNA 3.3 Rückgrat für die Expression in Säugerzellen zu verwenden.
- Optional kann nach 6 h Inkubation Austausch die Transfektion Medien beschrieben in der Lipofectamine Protokoll mit normalen HEK293 Medien.
- Um die Expression des transfizierten Prote bewertenin, kann ein Teil der transfizierten Gewebekulturvertiefungen für Immunfluoreszenz Nachweis des exprimierten Proteins oder Western-Blot-Analyse von Protein-Expression unter Verwendung von Standard-Techniken verwendet werden.
2. Optional Fixation von HEK293-Zellen transfizierten Protein
HEK293 Zellen schonend fixiert werden, um Kokultur in Medien, die schädlich für lebende HEK293 Zellen (z. B. Schritt 3.9 unten) oder um die effiziente Vorbereitung im Vorfeld von Platten für mehrere Experimente auf einmal erlauben (siehe auch Diskussion) erleichtern könnten.
- Führen Pilotstudien um den zeitlichen Verlauf der Expression des Proteins in den HEK293-Zellen zu bestimmen.
- Nach Transfektion der HEK293 Zellschicht, saugen die Medien aus den Zellen bei der Post-Transfektion Zeitpunkt mit höchster Expression assoziiert. Wenn dies geschieht innerhalb der ersten 24 Stunden, nicht bis 24 Stunden nach der Transfektion anzusaugen.
- Waschen HEK293 Zellen vorsichtig mit D-PBS fügen Sie dann 500 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) und Inkubation bei RT für 30 min. (Zu 4% PFA-Lösung zu machen, mit 16% igen Lösung in 1X PBS beginnen und verdünnen 1:4 1X PBS.)
- Mit einer sterilen PBS, vorsichtig waschen die Zellen 3 mal in PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C.
- Waschen der Zellen 3 mal mit sterilem PBS, dann fügen PBS und lassen bei 4 ° C bis zur Verwendung (maximale Lagerzeit je nach Protein exprimiert. Wir speichern HEK293 Zellen transfiziert, um neuroligin Isoformen für bis zu 2 Wochen ausdrücken, ohne wesentliche Änderungen in beobachteten Effekte auf die Insulinsekretion).
3. Co-Kultivierung von INS-1 Beta-Zellen mit HEK293 Zellen
- Bereiten INS-1-Medien durch Zugabe von 500 ml RPMI 1640 (mit Glucose und Phenolrot und ohne Glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X Penicillin / Streptomycin, 5 ml 100X L-Glutamin-Lösung, 5 ml Natriumpyruvat, 500 ul Amphotericin B, 500 ul beta-Mercaptoethanol (dies ist fast identisch mit dem medium normalerweise für primäre Kultur Insel mit Ausnahme der Zugabe von beta-Mercaptoethanol) eingesetzt.
- Benutzen Sie die Cell-Stripperin (oder einem anderen nicht-enzymatischen Zelle Entferner), Ernte INS-1-Zellen bei etwa 70-80% Konfluenz aus dem Boden einer T75 Kulturflasche. Jeder Kolben wird grob genug Zellen für 48 Brunnen liefern.
- Nach Stillstand Zellen in der Zentrifuge für 3 min bei 1200 rpm in einer 50/50 Mischung aus INS-1 und HEK Medien resuspendieren. Für eine 70-80% konfluenten Flasche INS-1-Zellen, in etwa 25 ml Mischtechnik resuspendieren.
- Bei Verwendung von HEK293-Zellen, die in Paraformaldehyd wurden anstelle von lebenden HEK293 Zellen fixiert, resuspendieren INS-1-Zellen in 100% INS-1-Media anstatt Mischtechnik.
- Verwendung einer 10 ml Pipette zu entfernen, die Zellen aus dem Pellet, um eine homogene Zellsuspension zu machen.
- Saugen Sie die Medien auf den HEK293 Zellen zu entfernen.
- Mit einer Pipette p1000, sanft hinzufügen 500 ul von INS-1 Zell-Suspension auf die HEK Zellschicht an den Seiten of den Brunnen. Nach jeweils 6 Vertiefungen, verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die INS-1-Zellen wieder suspendieren, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Die allgemeine Regelung der Kokultur Set-up ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Inkubieren Sie die Zellen für 24-48 h, je nach dem experimentellen Protokoll.
- Wenn mehr als 48 Stunden Kokultur Zeitraum erforderlich ist, verwenden optionale Schritte in Abschnitt 2 die HEK293 Zellen zu fixieren.
- Bei der Verwendung von primären dissoziiert Nagetier oder menschlichen Inselchen [siehe zB vor Protokolle in JoVE 11-15], sicherzustellen, dass eine geeignete Medien wie RPMI mit 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml L-Glut, 0,5 ml Amphotericin-B wird anstelle von INS-1-Medien. Obwohl eine dissoziierte Inselzellen in einer Platte mit 24 Vertiefungen verwendet werden können, in der Praxis wegen der großen Anzahl von Inseln möglicherweise benötigt, ist es empfehlenswert, dass die Prüfung der Skalierung gegeben werden auf eine 48-Well-Platte (erfordern weniger Inselzellen pro Vertiefung). Auf einer 48-Well-Platte, fügen Sie etwa 100 Inseln im Wert von Dissoziationted Zellen pro Platte zu starten. Je nach Wirksamkeit der Dissoziation und das Verfahren verwendet wird, kann weniger Inseln erforderlich.
4. Glucose Insulinsekretion
- Vorinkubieren Zellen in 250 ul 2,5 mM Glukose in KRB (Krebs-Ringer Bicarbonat-Puffer) für mindestens 1 Stunde. Um vorinkubieren, entfernen Kokultur mittel-und unmittelbar mit KRB ersetzen. Dieser Austausch sollte man gut gemacht werden zu einem Zeitpunkt, um die Exposition der INS-1-Zellen zu Umweltinformationen Sauerstoff zu minimieren. Saugen Sie mit einer Hand, während Pipettieren der niedrig (2,5 mM) Glucose KRB mit den anderen.
- Austausch Vorinkubation KRB bis 250 ul von entweder 2,5 mM oder 20 mM Glukose in KRB-Puffer ein und zu einem Zeitpunkt.
- Wenn die für den spezifischen Experiment können zusätzliche secretagogues wie 100 uM IBMX zugegeben, um eine robustere stimulierte Insulinsekretion Reaktion zu erzeugen. Dissoziierte primären Beta-Inselzellen insbesondere sind schlecht auf erhöhte Glucosekonzentrationen Alone, so hier besonders Zugabe von IBMX oder andere Sekretagoga sollte 16,17 in Betracht gezogen werden.
- Nach 1 Stunde Inkubation übertragen Medien in Röhrchen zentrifugieren und Spin 1.500 xg für 5 min.
- Entfernen 200 ul des Überstandes und nutzen diese für die Analyse durch Insulin RIA oder ELISA.
- Um Zelllysat herzustellen, werden 100 ul RIPA Lysepuffer (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 oder Nonidet P-40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) mit Proteaseinhibitoren der Platte sofort nach dem Entfernen von Medien und Inkubation bei 4 ° C für 20 min.
- Spin down Lysat für 15 min bei 10.000 xg und entfernen 50 ul Überstand zur Analyse durch Insulin RIA oder ELISA.
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Representative Results
Mit dem hier beschriebenen Verfahren haben wir die Wirkung von verschiedenen Varianten des Proteins neuroligin auf die Insulinsekretion getestet. Dies ergänzt unsere veröffentlichte Arbeit untersucht die Wirkung von neuroligin-2 auf Beta-Zell-Funktion 10. Abbildung 2, zum Beispiel, stellt Ergebnisse von Cokultivierung INS-1 beta-Zellen mit HEK293-Zellen transfiziert, um einen Ausdruck zu erhalten neuroligin Isoform hier bezeichnet als NL- X. Dieses Experiment wurde entworfen, um die Hypothese, dass die NL-X greift in transzellulären Interaktionen, die Erhöhung der Insulinsekretion zu testen. In 2A ist ersichtlich, dass die Expression der NL-X erhöht und basale Insulinsekretion durch kokultivierten INS-1-Zellen werden. Der Ansatz der Transfektion HEK293 Zellen, so dass sie NL-X auszudrücken ermöglicht es uns zu wissen, dass es die extrazelluläre Domäne-die die Region auf der HEK293 Zelloberfläche präsentiert und ist somit in der Lage, in Kontakt mit kokultivierten INS-1-Zellen-das bringt gekommen ist über die observed Erhöhung der Sekretion. Der NL-X extrazellulären Domäne muss mit einem anderen Protein (oder vielleicht einige andere Molekül) auf der INS-1 Zelloberfläche zu bewirken, dass die INS-1-Zellen, mehr Insulin absondern interagieren. Falls gewünscht, kann Insulin sezerniert auch als Prozentsatz der zellulären Insulin-Gehalt, der nach der Lyse der Zellen gemessen werden kann ausgedrückt werden.
In 2B und 2C, Ergebnisse von anderen Arten von Analysen über die Kokultur-System dargestellt sind: speziell, Analysen der Wirkung von transzellulären Wechselwirkungen zwischen neuroligin Variante NL-Y auf zellulären Insulin-Gehalt und PDX-1 und Insulin mRNA. NL-Y erhöht die Insulin-Gehalt der kokultivierten INS-1-Zellen (Abbildung 2B). Weitere Tests notwendig wäre, um festzustellen, ob diese auf einen Anstieg in der Menge an Insulin pro Zelle oder durch erhöhte INS-1-Zellen-Proliferation. In 2C wurde RNA aus der Zelle gewonnenSchicht und mittels RT-qPCR. Da die HEK293 Zellen menschlichen Ursprungs sind Transkripte, die vorhanden sein könnten sowohl in HEK293 und INS-1-Zellen von Ratten-spezifische PCR-Primer (INS-1-Zellen sind von Ratte Herkunft) verwenden sichergestellt, dass nur mRNA von INS-1 Herkunft gemessen. Hier ist zu sehen, dass Kokultur mit NL-Y Insulin und PDX-1-mRNA-Niveaus (Normalisierung war 18S RNA) erhöht werden. Die Primer und die Methodik für diese RT-qPCR-Analyse verwendet wurden vorher 10, Online-Ergänzung beschrieben.
Abbildung 1. Cokultur Set-up. HEK293 (HEK-Zellen) werden in 24-Well-Gewebekulturplatten gegeben und dann transfiziert. Ein heller Bereich eines Bildes repräsentativ HEK293-Zelle wird auf der Oberseite dargestellt, rechts. Die HEK-Zellen transfiziert, um ein Epitop-markierten Transmembran-Protein exprimieren. Hier wird Immunfluoreszenzfärbung verwendet, um die transfizierten offenbarenZellen (grün). Als nächstes INS-1-Zellen zugegeben. Immunfluoreszenzfärbung für Insulin wurde durchgeführt, um die Visualisierung der kokultivierten INS-1-Zellen (rot) zu ermöglichen.
Abbildung 2. Ergebnisse von Co-Kultivierung INS-1 beta-Zellen mit HEK293-Zellen transfiziert, um die neuroligin Proteinvarianten NL-X-Y oder NL (aufgefüllt, schwarze Säulen). Steuerung HEK293-Zellen exprimieren erhalten wurden mit den gleichen Plasmid-Konstrukte, um nicht verändert transfiziert express Protein (weiße Säulen). A, Insulinsekretion durch kokultivierten INS-1-Zellen unter niedrigen (2,5 nM) und hoher (20 mM) Glucose Bedingungen und auch nach Stimulation durch hohe Glukose zusammen mit IBMX. B, INS-1-Zellen Insulin-Gehalt nach Kokultur mit HEK293-Zellen, die NL-Y. C, analysist von Insulin und PDX-1 Transkripte mittels RT-qPCR mit RNA aus INS-1-Zellen kokultivierten entweder mit HEK293 Zellen mit NL-Y oder mit Kontroll-transfizierten HEK293-Zellen transfiziert isoliert. (*, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001).
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Discussion
Die Kokultur hier beschriebene Verfahren bietet einen effektiven Weg, um die physiologische Bedeutung der spezifischen Beta-Zell-Oberfläche, Transmembranproteine bestimmen und speziell ihrer extrazellulären Domänen. Durch Kultivierung Betazellen oder Insulinomazellen (wie die INS-1-Zellen verwendet hier) in Kontakt mit HEK293 Zellen, die ein Protein von Interesse auf der Zelloberfläche kann Experimente entwickelt, um die Auswirkungen der extrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen stören, ohne direkt zu bestimmen die intrazellulären Milieu der Zellen. Da die Proteine von Interesse von HEK293-Zellen exprimiert werden, würde keine Auswirkungen auf β-Zellen-Funktion, die von der intrazellulären Domänen der transfizierten Proteine vermittelt werden könnte fehlen und daher nicht erschweren Analyse der Wirkungen von extrazellulärem Wechselwirkungen.
Auswirkungen auf die Insulinsekretion lassen sich durch Vergleich Sekretion von beta-Zellen mit HEK293 Zellen kokultiviert bestimmt werdenExpression eines Proteins von Interesse, um die Sekretion von Beta-Zellen in Kontakt mit Steuerung HEK293-Zellen co-kultiviert werden. Die Steuerung HEK293 Zellen können mock-transfizierten oder, alternativ, mit einer Variante der experimentellen mutierte Plasmid zu konstruieren, um eine nicht-funktionelle Variante von dem Protein von Interesse zu produzieren, transfiziert. In unseren Händen haben beide Arten von Kontrollen identische Ergebnisse ergaben. Da die HEK293 Zelloberfläche inhärent eine Vielzahl von Proteinen, der jede Art der Steuerung die Funktion der Beta-Zellen in Kontakt mit vielen unterschiedlichen Zelloberflächen-Molekülen, einschließlich dem Protein von Interesse, um die Funktion der Beta-Zellen in Kontakt zu vergleichen mit dem gleichen Satz von Zelloberflächen-Molekülen mit Ausnahme des Proteins von Interesse (oder mit einer mutierten Version des Proteins von Interesse).
INS-1-Zellen (oder andere Beta-Zellen) mit den HEK293 Schichten niedriger Dichte, so dass es wenig oder keine Berührung von INS-1-Zellen mit anderen INS-1 CEL hinzugefügtls. Dadurch können die Auswirkungen von transzellulären Wechselwirkungen zwischen dem Protein von Interesse auf der HEK293 Zelloberfläche und Proteinen auf der INS-1-Zellen-Oberfläche in Abwesenheit von potenziellen Hintergrundrauschen transzellulären Wechselwirkungen mit demselben Protein verursacht beachten ausgedrückt endogen im INS -1 Zelloberfläche.
Nach der Transfektion werden die HEK293-Zelle Schicht leicht fixiert werden. Diese Fixierung kann optional verwendet werden, um damit mehrere Kokultur Platten sofort für die nachfolgende Zugabe von Beta-Zellen zu einem späteren Zeitpunkt hergestellt werden. Befestigung der HEK293-Zellen wäre auch von Vorteil, wenn es Bedenken, dass HEK293 Stoffwechsel oder sekretorische Funktion irgendwie mit der Analyse der Beta-Zellfunktion stören würden. Schließlich kann die Fixier-Protokoll verwendet werden, um längere Kokultur Versuche zu erleichtern. Hier ist der Hauptvorteil der Verwendung fester HEK293-Zellen, die die optimale Kulturmedium für die Beta-Zellen nicht mit einer isolierten eingesetzt werdenMischtechnik (zB siehe Schritt 3.3) notwendig für die Aufrechterhaltung kokultivierten HEK293 und Beta-Zellen gleichzeitig. In längeren Kokultur Experimenten des gemischten Medien nutzen-das ist nicht optimal für entweder Zelltyp-beta kann die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen.
HEK293 Zellen werden hier, weil sie sehr gut für die Transfektion verwendet werden, sie mit hoher Effizienz unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Transfektionsreagenzien 18,19 transfiziert werden. HEK293 ist eine von zwei Zelltypen zusammen mit COS-Zellen -, die routinemäßig in ähnlichen neuronalen Kokultur Systeme 5 eingesetzt werden. Lipofectamin 2000 ist eine bewährte Transfektionsreagenz sehr häufig und HEK293-Zellen und routinemäßig erreicht Transfektionseffizienz (Prozent der Zellen transfiziert) von mehr als 95% in veröffentlichten Studien 18-20 verwendet. Andere Reagenzien erreichen ähnliche Effizienz der Transfektion 19,20. Mit unserem neuroligin-2-Plasmid-Konstrukt ist Transfektionseffizienz allgemein ~ 80%. Although konzentrieren wir uns hier auf Studien von Glukose-stimulierte Insulinsekretion, sind andere Arten der Analyse möglich, beispielsweise durch FACS, Immunhistochemie, Western Blot und / oder, wie in 2C, qPCR gesehen.
Obwohl es ein sehr nützliches Werkzeug bei der Unterstützung aufzudecken die Funktion insbesondere extrazellulären Protein-Wechselwirkungen, das hier beschriebene Verfahren ist nicht ohne Grenzen. Da die Beta-Zellen in direktem Kontakt mit der HEK293 Zellschicht werden müssen, sind Insulinom Zelllinien wie INS-1-Zellen speziell für dieses System Kokultur 4 gut geeignet. Übertragung der Ergebnisse zur primären Inselzellen erfordert die Dispersion von isolierten Inseln. Da die Insel Struktur selbst ist ein integraler Bestandteil der richtigen Signalisierung und Reaktion auf Glukose, wird die stimulierte Insulin-Reaktion in verteilten primären Beta-Zellen in Bezug auf intakte Inseln 1,3,17 abgestumpft. Darüber hinaus, weil die transiente Transfektion nicht in Uniform Ausdruck th führen e Protein über die HEK Rasen, bei der Durchführung von Imaging-basierte (immunhistochemische) Versuche, eine Methode, um die Proteinexpression zu normalisieren kann erforderlich sein, Ergebnisse zu interpretieren. Ein experimenteller Ansatz das die Vorteile dieser ungleichmäßigen Ausdruck, um die Wirkung des Proteins auf der transfizierten sekretorischen Maschinen der co-kultivierten INS-1-Zellen zu analysieren, ist in 3 in Suckow et al. 2012 10 dargestellt.
Es sollte auch angemerkt werden, dass das Ausmaß des Kontakts zwischen einem bestimmten beta Zelle und benachbarten Zellen, die das Protein von Interesse wahrscheinlich weniger in diesem System als in intakten Inseln in vivo, in denen Beta-Zellen von allen Seiten von Zellen könnte umgeben werden soll die das Protein exprimieren. Diese relativ reduziert Zell-zu-Zell-Kontakt könnte die Größenordnung von Veränderungen der Insulin-Sekretion unter, was beobachtet werden, wenn die relevanten Wechselwirkungen wurden transzellulären irgendwie aus einheimischen Inseln eliminiert.
e_content "> Verwendung einer klonalen Population von stabil transfizierten HEK293 Zellen anstatt transiente Transfektion würde in gleichmäßiger Ausdruck und möglicherweise vereinfachen Versuchsanordnung, würde aber wesentlich mehr up-front Zeit und Aufwand erfordern, um die stabil zu generieren exprimierenden Zellen. Zukünftige Studien werden prüfen, ob durch Transfektion zwei oder mehr Transmembranproteine in den HEK293 Zellschicht, mögliche synergistische Effekte beobachtet werden konnten.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss R01DK080971 und Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 37-2009-44 unterstützt. Wir schätzen auch Unterstützung von der UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC) übermittelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
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