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Biology

FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

Published: November 16, 2013 doi: 10.3791/50844
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

Abstract

세균 세포 분열 동안, 필수적인 단백질 FtsZ는 소위 Z-고리를 형성하는 셀의 중앙에 모인다. FtsZ는 체외에서 GTP의 존재에 긴 필라멘트로 중합, 중합은 여러 액세서리 단백질에 의해 조절된다. FtsZ 중합 광범위하게 빛을 산란, 침강, GTP 가수 분해 분석 및 전자 현미경 등의 기본적인 방법을 사용하여 체외에서 연구되고있다. 버퍼 조건의 영향을 모두 FtsZ의 중합 특성 및 규제 단백질과 상호 작용하는 FtsZ의 능력. 여기, 우리는 FtsZ 중합 연구를위한 프로토콜을 설명하고 모델 단백질로 대장균과 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) FtsZ를 사용 조건 및 컨트롤을 확인합니다. 저속 침강 분석법 FtsZ 중합체 동고 또는 관 모양 단백질 FtsZ의 상호 작용의 연구를 허용하는 도입된다. 개선 GTPase의 분석 프로토콜 테스트에게 허용하는에게 설명인산 검출 반응에서 발색 편차 폐지 표준화 인큐베이션 시간으로 96 - 웰 플레이트 셋업에서 여러 가지 조건을 사용하여 시간이 지남에 GTP 가수 분해. 광산란 연구 및 전자 현미경을위한 시료의 준비를 설명한다. 여러 버퍼가 FtsZ 중합 연구에 적합한 버퍼 pH와 염 농도를 설정하는 데 사용됩니다. 의 KCl의 높은 농도는 실험의 대부분을위한 최고입니다. 우리의 방법은 E.에서뿐만 FtsZ의 시험 관내 특성화를위한 시작점을 제공 대장균 및 B. 서브 틸리하지만 다른 박테리아에서. 이와 같이, 방법은 규제 단백질이나 FtsZ 중합에 영향을 미칠 수있는 약물의 항균 시험 FtsZ와의 상호 작용의 연구를 위해 사용될 수있다.

Introduction

필수 박테리아 단백질 FtsZ는 세균 세포 분열 기계의 유용한 특성화 된 단백질이다. FtsZ는 튜 불린의 원핵 생물의 상동과 GTP 의존적으로 체외에서 중합. FtsZ 세균 1,2에 그것의 보존 특성과 고유성으로 인해 새로운 항생제에 대한 매우 매력적인 대상입니다. 세포 분열의 시작 부분에서, FtsZ 다른 세포 분열 단백질의 조립을위한 발판 역할을 midcell에서 cytokinetic 고리를 형성한다. Z-링의 형성은 분할면의 정확한 현지화에 대한 매우 중요합니다. FtsZ의 조립 역학은 이러한 밍크, SepF, 사파, UgtP, 에스라 2 (세균의 종류에 따라) 등 여러 가지 액세서리 단백질에 의해 조절된다. FtsZ 중합 집중적으로 체외 똑바로 protofilaments, 곡선 protofilaments, 필라멘트의 시트, 필라멘트의 다발과 필라멘트의 튜브 등 다양한 구조에서 공부 한 데 있었다조립 버퍼, 뉴클레오티드 및 분석 3에 포함 된 추가적인 단백질에 의존 cribed. Caulobacter의 crescentus의 전자 cryotomography 실험은 Z-링이 넓은 4 동고하지 않고 비교적 짧은, 비 연속 단일 protofilaments에서 조립하는 것이 좋습니다 있지만, 생체 내에서 FtsZ의 protofilaments의 구조는 아직 완전히 이해되지 않습니다.

체외에서 FtsZ의 중합 특성 및 규제 단백질과 FtsZ의 상호 작용에 반응 버퍼의 조성에 민감합니다. 예를 들어, 우리는 최근 FtsZ C-말단에 SepF의 상호 작용 사이트를 설명하고 FtsZ 모텔 Δ16 C-말단 잘라 내기가 더 이상 SepF 5에 바인딩 것을 보여 주었다. SepF-FtsZ 모텔의 상호 작용에 관한 이전의 연구에서 비슷한 FtsZ 모텔 Δ16는 여전히 SepF가 FtsZ에 보조 사이트에 바인딩 것을 제안 SepF와 cosedimented 절단 등. SepF이 작동하지 않습니다와 pH를 6.5에서 관찰 cosedimentation가 FtsZ 모텔 Δ16 C-말단 잘라 내기와 SepF의 침전이 아닌 상호 작용에 의해 발생 될 가능성이 있음을 보여주는, 산도 6.5 7에 침전 지적했다. FtsZ의 중합에 pH와의 KCl 농도의 영향은 이미 검토되었다. E.의 중합체 pH가 6.5에서 대장균 FtsZ (FtsZ 값 Ec)는 더 길고 풍부한 중성 pH 8,9 형성보다 있습니다. Tadros 등. K는 + 바인딩이 FtsZ 적 능력 중합에 연결하고 FtsZ 활동 (10)에 대한 매우 중요합니다 지적 가의 양이온의 존재 FtsZ 값 Ec의 중합을 공부했습니다. pH는 더 critica입니다SepF의 앞의 예와 FtsZ 11 밍크의 억제 효과의 pH 의존성에 의해 같이 다른 단백질과 FtsZ의 상호 작용, 연구되고 난. pH와 염 농도가 모두 다른 단백질 FtsZ의 상호 작용에 영향을 미칠 수있다, 그것은 FtsZ 중합 연구를위한 적절한 조건 및 컨트롤을 선택하는 것이 중요합니다.

여기에서 우리는 빛의 산란, 전자 현미경, 침강 및 GTPase의 분석 실험에 의해 FtsZ 중합 GTPase의 활성을 연구하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 직각 광 산란 실시간 12 FtsZ 중합을 연구하는 표준 방법입니다. 우리는 침강 및 GTPase의 분석에 몇 가지 개선 사항을 소개했다. 우리는 빛의 산란 및 전자 현미경을 위해 샘플을 준비하는 방법에 대해 자세히 제시한다. FtsZ 중합을 연구 문헌에서 사용되는 몇 가지 버퍼를 테스트하고 우리는 각 실험에 가장 적합한 조건을 설명했다. 우리는 또한 있어야한다을 제어하는​​ 표시가장 좋은 데이터를 얻기 위해 도입했다.

이러한 방법은 FtsZ 중합, 활동하고 간단한 방법과 대부분의 실험실에서 사용할 장비를 사용하는 다른 단백질과의 상호 작용의 빠른 연구를 할 수 있습니다. FtsZ 중합을 연구하는 더 정교한 방법이 존재하지만 종종 형광 라벨 8,13,14 더 전문 장비에 대한 액세스, 및 / 또는 FtsZ의 수정이 필요합니다. 이 문서에서 설명하는 간단한 방법은 B.에서 FtsZ를 사용하여 도시된다 서브 틸리와 E. 콜리, 가장 일반적인 그램 + 및 그람 모델 생물. 프로토콜은 다른 FtsZ 단백질에 적용 할 수있다. 이 소설 FtsZs, 시간에 대한 약간의 변경, 버퍼 또는 배양 온도 예비 분석을 바탕으로 최적의 결과를해야 할 수도 있습니다. 여기에 설명 된 실험은 이러한 최적의 조건을 찾는 데 도움이됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTP Roche 10106399001 Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes Beckman Coulter 343776 Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315 Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap Beckman Coulter 357448 Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL Raytest Isotopenmessgeräte GmbH 15000001 Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000 Fujifilm Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer Spectronic Instruments Part 5
Fluorescence Cell Hellma Analytics 105-250-15-40 Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial Electron Microscopy Sciences G400-Cu Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV Philips Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate BIOplastics B70501 Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit BioAssay System POMG-25H Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer BioTek Part 7

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References

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Król, E., Scheffers, D. J. FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations. J. Vis. Exp. (81), e50844, doi:10.3791/50844 (2013).

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