提取与分析皮质醇从人与猴的毛

Summary

皮质醇（CORT）积聚在人类和非人类灵长类动物的生长的头发轴。我们描述了用于提取和分析头发CORT以高精度和灵敏度的方法。是特别适合用于评估慢性压力过周时期到几个月头发CORT的测量。

Abstract

应激激素皮质醇（CORT）正在慢慢融入人类，非人灵长类动物和其他哺乳动物的生长的头发轴。我们开发并验证了CORT的提取和分析，从猕猴毛发的方法，并随后与人类头发适合使用这种方法。相反，从血浆或唾液获得CORT“点样”，头发CORT提供了一个集成的测量下丘脑 - 垂体 - 肾上腺皮质（HPA）系统的活性，从而生理应激，激素过程中掺入的时期。因为人的头皮头发生长以1厘米/月的平均增长率，从头发段获得CORT水平长度数厘米有可能成为应激经历了数月的生物标志物。

在我们的方法中，每个头发样品首先洗涤两次，在异丙醇中，以从已经沉积的汗或皮脂发轴的外侧除去任何CORT。干燥后，将样品研磨成细粉末，打破了头发的蛋白质基质和增加表面积进行萃取。 CORT从毛发轴的内部被提取到甲醇中，将甲醇蒸发，将提取物重新溶解在测定缓冲液中。提取CORT，随着标准和质量控制，然后由一个敏感和特异的市售的酶免疫测定（EIA）试剂盒进行分析。从环评读数转化为每毫克粉末状毛重量皮克CORT。这种方法已经被用在我们的实验室进行分析头发皮质醇的人类，几种猕猴，狨猴，狗和北极熊。无论是从我们的实验室和其他研究小组已经有很多研究表明头发CORT的广泛适用性评估慢性应激暴露在自然以及实验室的设置。

Introduction

CORT血浆，唾液，或偶尔在尿液或粪便的测量已被用作生理应激自Selye的发现HPA轴中应力的作用¹的索引。虽然众多的论文已发表有关HPA活性，急性紧张的情况下，该领域已经阻碍了缺乏慢性生理应激的一种简单而可靠的指标。这个问题的产生是因为HPA的活动是受昼夜节律变化，可以通过环境干扰羞愧血浆和唾液两者屈服“点”的估计。尿和粪便样品，得到跨越若干小时到一整天在某些情况下，皮质醇和/或代谢物排泄的测量。收集使用任何这些矩阵可以提供CORT水平的粗略综合指数随时间的多个样品的，然而，没有这些方法提供了HPA活性和本学年的响应真正的长期指数干以慢性压力。

头发中测量CORT已经开始填补这一重要的需要在应力文学。几个实验室最初的研究表明CORT在人类毛发的存在，但是并没有调查是否毛发皮质醇水平改变应力²的函数。由于我们的实验室已经拥有多年在恒河猴HPA轴的各种社会和行为因素³的调控，我们开始着手建立和验证提取的恒河猴毛⁴和分析方法。基于的前提是血源性皮质醇缓慢和连续地加入到生长的头发，这种新的方法的目的是要使用的头发源性皮质醇水平的HPA活性的综合指数比周的期间，以月。

有几个方法上的挑战是在开发本议定书遇到的问题。首先，以往的研究表明，少量Øf循环CORT被排泄在汗和皮脂，因此可以涂在头发轴²的外侧。为了消除这种潜在的变乱，我们开发了在出现以除去外部CORT而对CORT的影响最小日益增长毛干中存在轻微的洗涤程序。因此，猴毛经受这个过程（ 即两个3分钟洗涤用异丙醇）丢失的总发CORT含量约为7-8％，而第三洗涤除去从样品⁴低于1％的类固醇。似乎是在人的头发更外部CORT，因为同样的过程从样品（K. Rosenberg和J.迈尔，未发表）的平均27％的总CORT含量除去。像猴毛，但是，额外的洗涤含有少得多CORT（约7％），比前两个洗。因此，无论从猴子和人发结果支持这一论点，大多数（如果不是全部）外部CORT，同时保持一个主要的压裂被删除内部毛基质内化CORT的。第二，我们的试验性研究还表明，磨削头发萃取前从样品显著增加CORT恢复，据推测是由破开的毛干的复杂的蛋白质基质，以及增加的表面积可用于溶剂渗透。两种不同的研磨方法被开发，每一个优点和缺点。方法1，使用球磨机，有生产最好的粉末的优点。然而，球磨机是一种相对昂贵的设备和产品，如果使用标准的研磨罐和球，它是能够磨削只有两个样本在时间的。小样本也难以利用球磨机用标准的研磨罐进行处理。方法2，其使用beadbeater，是不太有效的研磨能力。其结果是，平均CORT回收率低约10％，使用该方法相比，在球磨机（未发表数据）。另一方面，一个beadbeater是相当便宜比球磨机，16-24样品可以一次取决于模型被​​研磨，且该方法非常适合用于小样本。因为上面提到的差的恢复，最好是使用相同的磨削方法为一个特定的研究中的所有样本。

一旦头发样品已经被处理，它们是用甲醇和CORT提取的提取物是由一个敏感和特异的商用EIA试剂盒最初被设计来测量唾液皮质醇进行分析。提取和测定方法进行了部分通过展示，从猴毛样品提取物的连续稀释产生的环境影响评估的读数紧密平行正宗CORT标准获得的读数验证。然后，我们发现，头发CORT（除血浆和唾液皮质醇）是猴子的新住房小区^4,5的行政强制拆迁的主要生活应激敏感。该PRESEN吨纸提供了经常使用在我们的实验室来处理人类和猴子的头发样本，以及从这些样本提取和分析CORT的方法的详细说明。

Protocol

1。样品采集和存储

1. 人发
   1. 固定头发进行采样（最高铅笔宽度，直径），用橡皮带或夹子的整个长度。剪下头发紧贴头皮的可能（注意不要刻痕的皮肤），用干净的剪刀。注：标准取样面积是颅骨的后部顶点。
   2. 一些研究者已经报道在人的头发CORT水平的下降与从头皮^6，这可能是由于反复暴露于水和香波⁷被洗出的距离（虽然看Manenschijn 等人 ⁸和Thomson 等人在⁹为相反的结果没有下降段观察），其中为了尽量减少这种潜在的“冲洗效应”的影响，我们建议近端收集头发段的长度不超过3厘米（假设为1厘米/ ¹⁰个月的平均增长速度，更大的头皮3厘米段包包含了C口服补液疗法，已沉积在过去大约3个月）。要做到这一点，用一把尺子来衡量3厘米从第一刀，切再次产生3厘米的样品。注意：一旦头发被切成需要的长度，它不再是必要的，以保持链对齐，除非该研究涉及切割样品放入单独的长1厘米段，建立CORT沉积回顾展在日历的时间段之前的采样^6。
   3. 将头发样品在由铝箔制成，干净的纸信封，或用于样品洗涤的类型的15毫升螺旋盖聚丙烯离心管中的一个小袋。作为CORT是在毛发²极其稳定，样品可无限期地贮存于-20℃，如果需要，在环境温度下运送过夜。
   4. 毛发收集过程应实行志愿者和实践样本应着手全面研究之前进行权衡。注意：头发样本为SMALL为5-10毫克可以使用此处描述的方法进行分析，虽然理想的是收集样品> 10毫克，以减少获得EIA读数低于最低CORT标准的可能性。
2. 猴毛
   1. 从颈部的使用标准的动物剪颈背的头发剃光（100-250毫克）。刮胡子尽可能靠近皮肤​​越好，小心不要刻痕的皮肤，引起出血，因为相比那些在头发发现血液中皮质酮水平是非常高的。注：颈部被选为常规取样，因为它一般是毛发的良好来源，可以为头发再生之前，重采样很容易观察到。
   2. 将头发样品在由铝箔或15毫升螺旋盖聚丙烯离心管中的一个小袋。猴头发样品应当存放和运输上述用于人的头发样品的相同方式。
   3. 由于猴毛，不像人类头发，长到一定长度，然后STOPS生长^11，它通常是不可行的在这种情况下，使用从皮肤作为日历CORT沉积距离。然而，如果动物可以被采样一次以上（例如，在定期例行健康检查），理想的是执行初始剃须设置一个基准时间点，然后reshave同一区域后所需的时间段已经过去。 CORT所述第二样品中的剃须-reshave间隔，这允许样品的CORT含量HPA活性超过该区间⁵的精确归因于沉积。

2。样品洗涤和干燥

1. 洗涤
   1. 将每个头发样品放入15毫升螺旋盖聚丙烯离心管中。
   2. 加入5 ml的高效液相色谱（HPLC）级异丙醇每个试管接着重复反演利用旋转3分钟。
   3. 倒出异丙醇到废物容器中，以C不想失去任何样品。
   4. 重复步骤2.1.2和2.1.3一次。
2. 烘干
   1. 干燥的头发，至少2-3天，以确保完整的异丙醇挥发。

3。试样磨CORT提取 - 方法1的大样本

1. 试样磨
   1. 将高达250毫克的干发到10ml的不锈钢研磨以及一个12毫米的不锈钢研磨球罐子。
   2. 研磨样品进行6分钟，在25赫兹的使用球磨机的速度。
   3. 重达在分析天平上，将50mg的粉末状的头发，然后将其转移到一个干净2.0毫升聚丙烯微量离心管中进行后续CORT萃取。
2. CORT提取
   1. 加入1.0毫升HPLC级甲醇含有粉末样品的离心管。
   2. 盖上试管并在室温下与共同孵育样品18〜24小时nstant反转使用旋转器。
   3. 离心管中，14,000 rpm离心1分钟，在室温下沉淀的粉末状毛发。
   4. 转让0.6毫升上清液到一个干净的1.5 ml离心管，注意不要扰乱头发粉颗粒。

4。试样磨CORT萃取 - 方法2的小样本

1. 试样磨
   1. 将高达60毫克的头发到一个预先称重2毫升离心管中增强胎圈跳动。
   2. 再次称重小瓶以获得样品的重量。
   3. 加33.2毫米铬钢珠到每个小瓶中，然后研磨样品的至少2分钟的珠打浆机。如果目视检查发现，该样品被充分磨碎，然后0.5或1分钟执行额外的研磨。注：在地面头发没有转移是必要的，这种情况下，因为CORT提取是在同一小瓶中进行研磨。
   4. CORT提取
      1. 加入1.5毫升的HPLC级甲醇中含有的粉末样品的离心管中。
      2. 盖上管并使用旋转器在室温下以恒定反转孵育样品18〜24小时。
      3. 离心管中，10,000 rpm离心5分钟，在室温下沉淀的粉末状毛发。注意：铬钢珠在萃取和离心步骤，留在管子与毛发，占下离心速度相比，方法1。
      4. 将1.0毫升上清液到一个干净的1.5 ml离心管，注意不要扰乱头发粉颗粒。

   5。溶剂蒸发和重构示例

   1. 干下来使用一个真空蒸发器或氮气流中，如果在真空蒸发器是不可用的甲醇。如果在真空蒸发器中被使用时，甲醇蒸气可以借助于被捕获的冷阱或配备活性炭盒中的化学陷阱。
   2. 下列除去甲醇，重构该CORT提取物中的EIA测定缓冲液（测定稀释剂）的适当体积。如果相对高CORT值预期的，然后用0.4毫升或更高的缓冲液体积。如果相对低的值是预期的，则可以将音量降低到0.2毫升或更少，以增加灵敏度。注意：0.2毫升是足够的体积，以在发生至少两次运行示例的重复的等分试样的重新执行是必要的。
   3. 或者立即测定重构的样品或在-20℃下用于以后的分析冻结。注意：如果重组后的样品被冻结，以避免在由于样品体积的改变冻结期限升华重要的是会导致在最终的计算进行虚假CORT值。

   6。 CORT含量和数据转换

   1. 测定头发中提取的CORT使用高灵敏度酶免疫测定（EIA）试剂盒。注意：如果使用的是商业唾液皮质醇EIA试剂盒，按照试剂盒插入不同的是测试样品将是每一个重组的头发提取物的重复等分，而不是唾液样本作为指定制造商的建议。
   2. 准备一个质量控制（QC）毛发提取物在每测定法中使用。
      1. 收集了一些多余的毛发样本，并单独处理它们按照步​​骤4.1和4.2或泳池他们为大样本的处理步骤3.1和3.2。
      2. 蒸发溶剂，并重构该提取物在步骤5.1和5.2，然后汇集从几个单独或混合样品重构提取物。
      3. 分装汇集重构提取物（ 例如 0.10毫升）的一个适当的量成单独的微量离心管中，并冷冻供以后使用。
      4. 解冻并一式两份每个免疫分析微孔板运行一个QC等分试样，以提供参考资料，希望能帮rence CORT值检查每个运行的质量。
      5. 的变化（CV;定义为标准偏差由一组样本值的平均值的比率）的批内系数可以通过分析10-12 QC井在相同的运行来计算的，而一个批间CV可以计算用在一组运行的QC值。如果一个人的酶标仪软件算出的CV值表示每个毛发提取的复孔，然后用于确定批内CV的另一种方法是计算在整个板的那些个体的CV值的平均值。
      6. 如果任何样品提取得到比在EIA最高CORT标准一读越大，则提取的另一等分试样稀释用的测定缓冲液适当量和随后的EIA读数被校正为稀释因子。样品还定期重新分析，如果CV为复孔是> 10％。
      7. 因为CORT环境影响评估套件是设计用来测量CORT VA梅毒液体样品，如唾液或血浆中，酶标仪软件的输出必须转换成皮质醇的量，每单位重量的粉状头发。下面的公式转换微克/分升，以每毫克头发皮克CORT检测输出：
         （A / B）*（C / D）* E * 10,000 = F
         其中A =微克/分升的检测输出，B =体重头发进行提取（以mg），C =第一卷。甲醇（以毫升）加入到粉末状毛发，D =第一卷。 （以ml）从甲醇提取物回收，随后进行干燥下来，E =第一卷。 （以毫升）用于重建的干提取物分析缓冲液;和头发皮质醇浓度的皮克/毫克F =最终值。

Representative Results

图1显示了一组人的头发样本（成年男性和女性人类受试者）的代表打印输出使用方法2研磨和萃取处理。计算机软件被用来产生数据输出，并以适合的4参数S形曲线的皮质醇水平（ 图2）。从这个板孔之间的简历介乎0.01-5.73％与1.34％的平均批内CV。来自九个最近的人的头发化验用的QC值是4.41％，批间CV测定。在这个板块分析的37个​​样品产生了一系列从3.1-650皮克/毫克的头发CORT值（中位数为10.2皮克/毫克;平均值±标准差= 36.0±110皮克/毫克）。

方法1用在我们的实验室来处理来自非人类灵长类动物和其他大型动物毛发样本。成年恒河猴毛（主要来自女性）代表法产生了一系列CORT值从50.1-102皮克/毫克（中位数= 75.0;平均值±标准差= 75.8±14.0皮克/毫克）。平均批内CV为这个实验为2.08％，而来自九个最近的猴毛试验使用的QC值是4.63％，批间CV测定。

图1。软件输出一个代表人类头发皮质醇测定 。重复试验孔如下：S1-S6 - CORT标准范围从0.012微克/分升（S6），以3.0微克/分升（S1）; S7 - 0 CORT井; B1 - 非特异性结合（NSB）的孔中，缺乏抗CORT抗体（软件自动减去平均NSB光密度[OD]的值从所有其它的OD读数）; C1和C2 - 由制造商提供高和低CORT校准; T1 - QC;
T2-T38 - 测试样品。从C1到T38中，阵列的每个单元中的上限值是所测量的OD有价值 E从相应井，并在该对的左侧单元格中的较低值是在微克/分升的平均OD值计算出的CORT值。需要注意的是样品T9和T31产生的读数高于最高CORT标准。其结果是，两个样品后稀释4倍，在测定稀释剂和重新分析。修正后的再分析值用于稀释倍数。 点击这里查看大图。

图2。 OD值对log CORT浓度为同一人的头发测定法的标准曲线。在图A中所示的R-平方值是合适的曲线所计算的优度的标准。/ 50882/50882fig2highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

Discussion

上述的头发CORT手续简单执行，是相对便宜的，利用了现成的化学品，试剂和耗材，需要的设备，有一个例外，很可能是出现在一个典型的分析实验室。唯一的例外是一个研磨装置如球磨机或mini-beadbeater。我们注意到，一些研究小组讳言头发样品切成小碎片大约1毫米的长度为^12，但根据我们的观察，我们建议进行研磨，而不是如果在所有可能切碎。在文献中的方法的变化的另一个领域涉及是否毛发洗之前CORT萃取^13，如果是这样，使用哪种洗涤条件。如果不进行洗涤，再一个风险，该甲醇提取物将包含不仅慢慢在数周或生发月并入CORT而且出汗和/或皮脂源性皮质醇沉积最近的可能性在头发的表面上。研究北极熊样品支持两个CORT部分头发的存在：一个松散结合的可移动部分由完好的头发大概主要是指表面污染简短的异丙醇洗涤，更紧密结合的部分就是由大量的甲醇提取的访问粉状头发样品^14。同样的结论可以从CORT的反复异丙醇洗涤（见引言）从猴子和人的头发中提取的金额递减绘制。另一方面，如果进行水洗，则溶剂的选择和洗涤条件可对所得到的CORT值的显著影响。头发测试协会出版的准则来选择适当的溶剂中，以减少头发从发矩阵的洗涤过 ​​程¹⁵的内部肿胀和潜在的溶质洗脱。虽然这些建议是针对应用程序在头发验毒发达，他们重新东升类固醇的分析也是如此。

在头发测定CORT而非血浆或唾液，提供了许多优点^2。最重要的是，这种方法提供了集成的皮质醇水平在周时期的生物标志物，是由时收集的样本一天的时间或短暂的应激暴露前集合不受影响个月。毛发收集是非侵入性的，虽然有些动物物种如猕猴或熊的抽样可能需要的主题的麻醉出于安全原因。另一个优点是与其它的样品基体，这允许历史或者归档样品的分析，即使它们已经被存储在环境温度下相当长的时间周期相比，该CORT是在毛发极其稳定。最后，CORT水平切下头皮先后更远的距离人的头发部分有时被用来创建HPA活性随着时间的推移追溯日历。在这种情况下，它是特殊的LY重要的是要意识到前面提到的“冲刷”通过反复洗头产生的效果。尽管一些研究未能复制这种效果^8,9，值得一提的是，在这些研究中的样品没有之前的甲醇提取洗涤。这个重要的方法论差异可能有助于解释为什么头发皮质醇水平并没有随着远离头皮下降。

头发CORT方法的一些局限性也应提及。首先，这种方法无法检测HPA活性的昼夜节律变化（如在一些抑郁症患者看到的）或觉醒CORT响应。头发CORT水平也可能无法检测到的，在激素掺入期间发生的相对短暂的压力的影响。因此，这种方法应该被认为是互补的，以唾液和/或血浆CORT的测量，而不是作为一个替代这种测量。其次，而使用头发的皮质酮会可能是特定值的研究人员感兴趣的社会心理和环境的压力，要牢记升高HPA活动可以发生在各种条件，包括体育锻炼，代谢异常和感染性疾病是很重要的。第三，而数据从人类和猴子支承头发CORT被从血流²主要产生的假设存在，这种假设还没有得到证实。事实上，伊东和他的同事¹⁶都表现了功能HPA-like系统的显微人类毛囊保持在器官培养的存在。在何种程度上毛囊有助于在毛干中测得的CORT此时仍然不明。

在自作为HPA轴活动的新的生物标志物以来短短几年，头发CORT已被用于各种各样的跨越无数种应用程序。许多这些应用属于几大吨血红素目的是确定长期HPA的活动是如何与慢性压力，内分泌功能失调如库欣病或神经精神障碍，如创伤后应激障碍^2,17-19。其他研究使用头发皮质醇检查有关行为的气质，发育正常，发育因素，如在人类早期的童年经历或不同饲养条件下的猴子，野生动物生活的环境保​​育的影响，并回顾性调查HPA轴功能历史或存档样品。研究迄今对于头发皮质醇的物种包括人类，数种非人灵长类动物（猕猴，长尾黑颚猴和狒狒）的，狗，猫，牛，马，等数种熊。它很可能是使用毛发CORT的评估长期HPA活性，是否进行调查的生理反应，慢性应激或处理其他实验问题，将继续前PAND和被应用到更大范围的物种。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes	Max Scientific	10-9151
1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff reinforced microvials	BioSpec	330TX	Use with mini-beadbeater
3.2 mm chrome-steel beads	BioSpec	11079132c	Use with mini-beadbeater
10 ml stainless steel grinding jars	Retsch	02.462.0061	Use with mixer mill
12 mm stainless steel grinding balls	Retsch	05.368.0037	Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge	Fisher	DTK120R	Use with Savant chemical trap
Rotator for 15 ml centrifuge tubes	Fisher	S02135
Rotator for microcentrifuge tubes	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes	Fisher	13-100-675
MM 200 mixer mill	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap	Fisher	RVT400-115
Savant chemical trap	Fisher	SCT120	Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipettor
Analytical balance