Introduction
Bakterier har utvecklats för att bemöta många stressande förhållanden. Ett allmänt drag av anpassning till stress är en förändring i tillväxtdynamik 1,2. Tillväxtdynamiken kännetecknas främst av två parametrar: den exponentiella tillväxttakten och den eftersläpning tid, det vill säga den tid som behövs för att anpassa sig till nya förhållanden. Ett stort antal av hög genomströmning metoder fokuserar på mätningar av tillväxttakten, är den fördröjning ofta en förbisedd parameter, även om det är den avgörande parametern för karakterisering av anpassning till nya förhållanden. Kvantifiering av anpassning till förändrade förutsättningar har traditionellt utförts med hjälp av arbetskrävande manuella metoder 3,4. På senare tid har avancerade tekniker utvecklats för analys av enskilda celler 5,6. Det är dock fortfarande svårt att skilja normal tillväxt efter en försening i tillväxt (det vill säga en fördröjning) 2,3 från långsam tillväxt. Ett automatiserat förfarande konstruerades, ScanLag 7, tilldiskriminera mellan dessa två liknande fenotyper.
Ett slående exempel på hur viktigt det är att studera den fördröjning fördelningen avslöjas i antibiotikabehandling. Många antibiotika och andra påkänningar döda bara aktivt växande celler, och därför celler som "släpar" är skyddade 8. För att övervaka fördröjning kan man observera enskilda celler under ett mikroskop och övervaka tiden till första divisionen. En stor nackdel med denna metod är att den dynamiska tidsområde är begränsat; de celler som växer tidigt täcka ytan med en exponentiell hastighet, vilket effektivt minskar tillväxten av celler med längre fördröjning. Användning av flödeskammare kringgår något i 5, men ett begränsat antal celler kan spåras och kan inte observeras den fraktion av bakterier som kommer ut ur fördröjningsfasen efter att majoriteten av befolkningen har börjat växa. Trots dessa begränsningar har flera studier utvärderades påverkan av nivån av different betonar på fördröjning distribution via en enda cell mikroskopi 9-12. Ett annat sätt att övervaka fördröjning fördelning är genom grumlighetsmätningar 13,14. Många parallella kulturer, vardera startade från en enda cell, odlas i en optisk densitet läsare som mäter antalet bakterier i kultur över tiden. Denna metod är begränsad av noggrannheten hos den extrapolering och med antalet brunnar i en platta.
En automatiserad metod utvecklades, kallades ScanLag, som gör att fördröjningstider och tillväxt tidsfördelningar som ska bedömas, även för den lilla andel av bakterier i en befolkning som har mycket långa fördröjningstider. Metoden är baserad på detektering av kolonier på konventionella näringsagarplattor 15 (figur 1). För att automatisera upptäckt 16,17 en rad kommersiella skannrar 18 som är regisserad av i huset programvara för att regelbundet få bilder av plattorna, var konstruerad. Programvaran varutformat för att automatiskt analysera bilderna och extrahera kvantitativa parametrar 19,20, till exempel tidpunkten för uppkomsten av varje koloni och tillväxttiden för varje koloni, som definieras här som den tid att växa från 20 pixlar till 80 pixlar. Här presenterar vi den metod som i detalj, inklusive konfigurationen av systemet och användningen av automatiserad bildanalysmjukvara som har förbättrats med ett bättre användargränssnitt.
Denna metod kan anpassas för att mäta andra egenskaper hos kolonierna, såsom morfologi och färg. Mätning av dessa typer av parametrar gör det möjligt för systemets användning i flerdimensionella Phenomics. Eftersom metoden detekterar kolonier från enstaka celler, kan systemet avslöja nya fenotyper som inte kan mätas genom mätningar befolkningsnivå. Tekniken gör det möjligt att upptäcka och hämtning av sällsynta varianter, och underlättar screening för önskade egenskaper.
Protocol
1. Bygg Setup
- Välj en flatbäddsskanner med optisk upplösning: 4,800 dpi; Hårdvara upplösning: 4,800 x 9,600 dpi; färgdjup: 48 bitar, som kan arbeta vid de aktuella temperatur och luftfuktighet.
- Petriskålar har betydande volym, till skillnad från papper som vanligtvis används på kommersiella skannrar. Kolonierna ligga ovanpå ägarn skiktet, cirka 5 mm över skannerytan. OBS: För de flesta skannrar kolonierna kommer att vara i fokus.
- Vissa skanner företag inte tillåter anslutning av fler än en instans av skanner av samma typ till samma dator. Se till att fler än en skanner kan fästas och identifieras unikt.
- Förbered de tillbehör som anges nedan:
- Förbered bitar av steril svart filt tyg för att täcka plattorna (Figur 1 steg 2).
- För att hålla de petriskålar på plats, förbereda vita plåthållare (Material och metoder) som passar de skannrar och som har 6 holes storleken på rätterna (Figur 1 steg 3).
- Om det behövs för tillväxt av mikroorganismen, sätta scanners i en temperaturkontrollerad miljö. Anslut skannrar till datorn.
- Tillval: Anslut relä till datorn och gå förbi på / av-knapp på skannern för att övervinna temperaturgradient.
OBS: Reläenheten är för extremt temperaturkänsliga mikroorganismer. Den stänger av scannern så att elektroniken inte värma ytan ojämnt. Genom att bara använda en del av skannerytan kan uppnå liknande resultat.
2. Installera Scanning chef
- Kopiera alla "Scanning Managers 'programfiler till en angiven katalog från http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html.
- Konfigurera ScanningManager.exe.config fil enligt scanners namnen så som de visas i Datorhantering-> Enhetshanteraren-> Imaging Devices (
- För felsökning av "Scanning Manager 'program finns i filen.
- För ytterligare dokumentation på "Scanning Manager 'program finns Documentation.html.
3. Utför ett experiment
- Förbered petriskålar (Figur 1):
- Späd kulturen till cirka 2000 CFU / ml. Plate 0,1 ml odlings likformigt på plåtytan.
- För att få bra kontrast mellan kolonierna och skålen och för att absorbera fukt, täcka plattan med en bit steril svart filt tyg. Placera locket på plattan.
- Placera plattorna i hållarna på scanners.
- Starta Skanning chef (Figur 3): Välj de deltagande skannrar från listan över anslutna skannrar. Välj antal bilder som ska tas (Repetitioner), tidsintervallet mellan efterföljande bilder (Time gap), och tidsfördröjningen innan tHan experimenterar (starta efter).
4. Analys av bilder
OBS: En översikt av beräkningsmetoder finns för att analysera bilderna i MATLAB med hjälp av "ScanLag", som är fritt tillgänglig för icke-kommersiellt bruk på http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Ytterligare funktioner som är tillgängliga är detaljerade i programvaruhandboken, och ett exempel kod kompletteras.
- Sortera bilderna från varje scanner i separata mappar.
- Med hjälp av Matlabs kommandofönster, kör följande procedurer. De parametrar som krävs för att köra dessa förfaranden definieras i programmanualen.
- Kör PreparePictures att utföra förbehandling: I förbehandling, är bilderna från en skanner i linje. Varje petriskål beskärs från varje bildsekvens. Den tidpunkt vid vilken varje bild uppsamlades hämtas från tidsstämpel.
- Kör TLAllPlates att utföra upptäckt och spårning I each petriskål för sig, är kolonier upptäckas och tilldelas ett identifieringsnummer.
- Analys av den extraherade data: Storlekarna på varje detekterade kolonin mäts som en funktion av tiden. För att extrahera utseendet fördelningen av kolonierna använda följande funktioner i Matlabs kommandofönster (mer information finns i programvaruhandboken):
- Kör ScanLagApp att visa en analys av en viss petriskål tillsammans med grafen av kolonierna storlek som funktion av tiden (figur 4).
- Använd reglaget för att ändra den aktuella tiden av plattan. Tidpunkten kommer också att visas med en matchande vertikal linje på kolonier området grafen.
- Klicka på en koloni för att se tillhörande kurva, och vice versa, klicka på en kurva för att hitta dess associerade koloni. Efter identifiering av kolonin, kan fenotypen hämtas vid plockning koloni från den identifierade petriskål.
- Filter fel i den automatiska analysen av choosjunger en koloni och klicka på knappen utesluta. När du klickar utesluta antalet kolonin blir gul.
- Efter att ha gått igenom resultaten av analysen av varje platta, summera resultaten:
- Kör AddHistograms att skapa ett histogram för utseende gånger.
- Kör plotDeathCurve att skapa en överlevnadskurva representation av fördelningen.
- Kör GetAppearanceTimes att få utseendet tiden för alla kolonier i experimentet.
- Kör ScanLagApp att visa en analys av en viss petriskål tillsammans med grafen av kolonierna storlek som funktion av tiden (figur 4).
Representative Results
Som ett exempel på fördröjning utvinning fördelning, Figur 5 visar förmåga ScanLag att identifiera och spåra varje koloni med särskilda kännetecken på en tallrik med tiden, som skulle ske i en screeninganalys.
När kulturen av mikroorganismen är heterogen, kan de olika delpopulationer avslöjar sig under analysen. Till exempel figur 6 visar utseendet kvantifiering och således avslöjar bimodal fördröjningstid fördelning i en mutant stam av E. coli.
Tillväxthastigheten hos cellerna påverkar utseendet tid av kolonin. När kolonier växer i samma takt, kan den sena utseende hänföras till fördröjning (Figur 7).
För att validera att metoden mäter verkligen fördröjning av enskilda celler, vi jämfört ScanLag resultat med de som erhållits med hjälp av encelliga mikroskopi; denna validering är described i detalj i en tidigare publikation 7. Denna metod möjliggör övervakning av många fler celler än vad som kan utvärderas med mikroskopi. Fördelning erhållits med hjälp av mikroskopi och fått hjälp av ScanLag överlappar till stor del. Den ScanLag fördelningen är något bredare; teoretiska analyser förutspå bredda att vara i storleksordningen av standardavvikelsen för divisionen tid. Om tillväxttiden är olika för varje stam, skall ursprunget för förseningen i utseende undersökas ytterligare med hjälp av andra metoder.
Inverkan av tidig-framträdande kolonier på utseendet på senare kolonier undersöktes. Kontrollförsök 7 bekräftade att senare utseende inte påverkades så länge som det totala antalet kolonier per platta inte översteg 200 (Figur 8). Ett annat kontrollförsök bekräftade att placeringen av koloni på plattan inte påverkar dess utseende tid 7.
Analysen av den pftalater är kalibrerad för specifika trösklar som kan behöva ändras beroende på näringsämnen i tillväxtmedium eller vilken typ av mikroorganism. Ändå är den analys ganska robust för ett stort spektrum av tröskelvärden såsom visas i figur 9.
Figur 1. Ett schema över de steg som behövs för att skapa ett koloniutseende fördelning.
Figur 2. Skärmdump på Enhetshanteraren visar namnen på de bifogade skannrar och i konfigurationsfilen. Klicka här för att se en störreversion av denna figur.
Figur 3. En skärmbild av Scanning Manager.
Figur 4. En skärmbild av ScanLagApp. En bild av plattan är på den vänstra rutan och tillväxtkurvorna för varje koloni är på den högra rutan, som beskrivs i manualen. De spikar i några av kolonierna området kurvorna uppstår när två eller flera kolonier samman. Vid sammanslagning av kolonier händer, är området av dessa kolonier betraktas som det gemensamma området.
Figur 5. Ett representativt resultat av en analys av en platta. (A) En bild av utsignalen från tillämpning detektion vid slutet av experimentet. Varje koloni område identifieras, färgat och tilldelas ett unikt ID-nummer. Pilarna pekar på de representativa kolonier uppmätta i B. Kolonin detekteras baserat på intensitetströskel (För E. coli-kolonier på LB-agar eller M9-agar denna tröskel är 0,03. För andra medier eller bakterier, detta tröskelvärde kan ställas in i funktions ProcessPictures ). Endast föremål ovanför 10 pixlar räknas (denna tröskel kan ändras i funktions MatchColonies). Upptäckt av en koloni börjar vid ca 10 5 bakterier. (B) Plots av området i pixlar kontra tiden för fyra representativa kolonier i denna platta. Den "utseende" som är varje koloni är när kolonin detekteras. Den "tillväxt" som är varje koloni definieras här som den tid att växa tillbakam 20 pixlar till 80 pixlar (dessa gränser kan justeras med hjälp av funktionen getAppearanceGrowthByVec). Programmet utesluter kolonierna som slagits samman innan den övre gränsen. Identifiering av en viss koloni enligt dess egenskaper är enkel tack vare den identifieringsnummer och färgen tilldelas varje koloni. Till exempel kolonier # 1, 56, 77 och 124 är markerade i båda graferna.
Figur 6. Utseende kvantifiering kan avslöja bimodal fördröjning fördelning. Jämförelse av ScanLag analys histogram för utseende tider för två olika stammar. Blå linje: vildtypsstammen exponentiellt växande (Totalt: 1320 kolonier); röda linjen-hög uthållighet mutant berikad med eftersläpande bakterier (Totalt: 1,529 kolonier). (A) Normaliserade utseende histogrammen. Toppensav uppkomsten av exponentiellt växande celler är den typiska tid att växa till en detekterbar koloni. Infällt: samma histogram av mutantstammen efter subtraktion tiden för toppen av den exponentiella kulturen för att få den verkliga fördröjning på log åtskilda lagerplatser som visar den bimodala fördröjningstid fördelning. (B) Överlevnads funktion av samma data som i (A) på en logaritmisk skala. Denna representation förhöjer sena uppkomsten svansen av den mutanta stammen.
Figur 7. Fördelning Utseende och tillväxt tidsfördelning. (A) och (B) visar tvådimensionella histogram av utseendet tid och tillväxttiden för de två olika förhållanden (Programmet utesluter kolonier som slogs samman innan den når övre gräns). (C) att jämföra histogrammenav de två stammarna visar skillnaden i utseende tid, medan tillväxttider (D) är likartade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Utseendet på tidiga kolonier inte interfererar med utseendet på senare kolonier. (A) fördröjning distribution av celler av vild typ pläterade ensam. (B) träsktidsfördelning av en kall känslig stam ensam, efter överföring till tillåtande temperatur. (C) fördröjning fördelning av båda stammarna pläterade tillsammans på samma villkor. Den svarta linjen representerar den förväntade fördelningen grundar sig på de uppgifter som erhålls vid mätning varje stam för sig. En bra aGREEMENT mellan förväntade och uppmätta fördelningar erhålles så länge som det totala antalet kolonier per platta är lägre än 200.
.. Figur 9 Tröskel upptäckt påverkar inte formen på koloniutseende fördelningen Kolonin utseende fördelning analyserades för samma datauppsättning med hjälp av två olika tröskel storlekar; (A) tröskelstorleken är 10 bildpunkter; (B) tröskelstorleken är 50 pixlar. Antal celler per histogram: ca. 1500. De olika tröskeldetektering endast medför en förskjutning av tiden upptäckt.
Figur 10. Temperaturmätning stabilitets acrOSS skannerns yta. (A) Bild av en platta med kolonier av Bacillus subtillis odlas på skannern utan Power Management. Ytan är varmare på botten och därför kolonierna växa snabbare. Den grad linje bredvid plattan är en schematisk representation av den värme-gradient. (B) Den temperaturstabilitet mättes med två termoelement som placerats över skannerns yta. Skannern värmer upp under varje svep, och över tiden. (C) Med Power Management, är temperaturen jämn och kolonierna växa i samma takt. (D) Samma som (B) med Power Management-modulen. Temperaturstabilitet på ± 0,2 ° C.
Figur 11. Skillnader i utseendet fördelningen kan bero på differences i volymerna av fast medium. Samma bakteriekulturen ströks ut på plattor med olika volymer av LB-agar, vilket resulterar i en annan höjd på agarytan. De olika höjderna ledde till olika opacitet av plattorna, och därför en annan detekterings tid. Den inter plattor skillnaden kontrollerades och skillnaden mellan olika höjdförhållanden. (A) Typiska skillnader mellan plattor av lika volymer av 30 ± 0,5 ml LB-agar. (B) Skillnad mellan olika höjdförhållanden: utseendet fördelningen mättes för plattor med volymer av 20 ± 0,5 ml (röd), 30 ± 0,5 ml (grön) och 40 ± 0,5 ml (blå). Varje tillstånd är medelvärdet av 6 olika plattor. Så länge som volymen av plattorna ligger inom ± 5 ml område, är opaciteten liknande och leder till liknande utseende tidsfördelning.
Discussion
Mikroskopiska metoder baserade på direkt observation betraktas ofta som den "gyllene standarden" för att studera encelliga beteende. ScanLag, vilket möjliggör mätning av fördelningen av fördröjningstider i bakteriepopulationer, tillhandahåller data i god överensstämmelse med fördelningen som erhålls från singel-cellanalys och uppnår mycket högre statistik.
Flera viktiga steg måste utföras för att denna metod ska fungera väl: först, inte äventyrar på skannerupplösning, som bör vara 4,800 x 9,600 för att få bra bilder. För det andra, vara medveten om att utan effekthanteringsmodulen (steg 1,6), kan temperaturgradient utvecklas på flatbädden ytan och påverka tillväxten. Ett annat viktigt steg är filtreringen av defekter såsom damm som kan ha blivit felaktigt räknas som kolonier av programvaran. Den inbyggda bakgrundssubtraktion av programvaran övervinner oftast dessa brister, men ibland "falska" kolonier måstemanuellt filtrerades.
De viktigaste åtgärder för felsökning kan ta itu med mellanplatta variation i installationen, på grund av flera orsaker: (a) Tillväxttakten av mikroorganismer påverkas av temperaturen. Olika temperatur-och fuktighetsförhållanden kan uppstå på grund av ojämn ventilation eller lokalisering av skålen i inkubatorn. (B) Elektroniken i skannern kan värma upp och orsaka en temperaturgradient över ytan av skannern. Figur 10 visar påverkan av en sådan rumslig värme lutning på Bacillus bakterier, tillsammans med mätningar av temperaturen på skannerytan före och efter att genomföra effekthanteringsmodulen (steg 1,6). Observera att denna modul inte kan vara nödvändigt för nyare skannrar, och om endast en del av skannerns yta användes kan strömhanterings vara onödig. (C) Plattor med olika opacitet agar näringsämnen kan leda till olika nivåer av upptäckt. Figur 11 visar the tolerans för olika volymer av näringsagar som resulterar i olika opacitet.
Experimentellt den ScanLag tekniken är enkel att utföra och kräver endast till tallrik mikroorganismer på standardpetriskålar, och att placera dem på skannerns yta. Den programvara som utvecklades kontrollerar hela proceduren. Bilden Förvärvet sker automatiskt, och bildanalys för koloni spårning är också automatiskt. Vidare kan systemet skalas upp för att mäta många olika förhållanden på samma gång. Slutligen har den metod på kommersiella kontorsskannrar, och därför är en låg kostnad.
Denna teknik kan utsträckas till studier av mikroorganismer, vilka skiljer sig från E. coli K-12, men flera överväganden måste göras. För det första har påverkan av tidiga före kolonier på de senare som skall bedömas, som beskrivs i detalj i en tidigare publikation 7. För E. Coli K-12, denmaximal täthet av CFU per platta är 200. Andra stammar med olika storlekar av kolonier, och andra möjliga överhörning mellan kolonier, kan kräva en annan densitet. För det andra är den analys av plattorna kalibrerad till specifika mjukvarubaserade tröskelvärden som kan behöva modifieras beroende på kontrasten mellan det fasta mediet och kolonierna. Mjukvaran kan även utvidgas att utvinna andra koloni egenskaper, bortom eftersläpning och tillväxt. Programvaran kod är öppen och kan ändras för att extrahera koloni form, ljusstyrka, jämnhet och färg.
Eftersom mätningarna görs på kolonier som kommer från enstaka celler, de data visar nya fenotyper som inte kan mätas genom mätningar befolkningsnivå. Betydelsen av den fördröjning fördelningen avslöjas i närvaro av antibiotika. Många antibiotika är kända för att vara effektiva endast mot växande celler; därför så länge som cellerna kvar i lagfas och växer inte, de är proffsskyddas från effekterna av dessa antibiotika 21. När antalet överlevande bakterier utvärderades vid tidsintervall under antibiotikabehandling 15,22,23, är en subpopulation av bakterier, som kallas persisters ofta uppenbarats. I vissa fall, immunitet mot antibiotika kommer från långvarig fördröjning. Med hjälp av denna inställning är denna eftersläpning avslöjas och ofta har en icke-trivial fördelningen 24 (Figur 6). Denna metod gör det också möjligt att återfinna sällsynta mutanter. Till exempel, efter plätering en muterad population, mutanter kan identifieras baserat på fenotyp och isoleras direkt, utan val. Installationen kan också övervaka cell-cell-interaktioner genom att mäta tillväxten av kolonier som en funktion av densiteten i närheten kolonier och att kvantifiera fenomen såsom quorum sensing eller spridning av svärmande bakterier. Multidimensional information som avslöjats av framtida experiment med den här metoden kommer att leda till en bättre karakterisering av mikrobiell populations och att framsteg inom medicinsk-och miljöforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Difco LB broth | BD | 240230 | |
| Petri dish 90 mm | Miniplast | 20090-01 | |
| Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4,800 dpi, Hardware Resolution: 4,800 x 9,600 dpi, color bit depth 48-bit. |
| Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
| Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
| ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
| Pieces of sterile black felt cloth | Custom made | Approximatly 100 x 100 mm | |
| White plate holders | Custom made | Surface size, with 6 x 99 mm diameter hole | |
| Delerin rings the size of the Petri dish | Custom made | Inner diameter: 72 mm Outer diameter: 86 mm Top outer diameter: 90 mm |
References
- Bochner, B. R.
- Monod, J.
- Penfold, W. J.
- Powell, E. O. Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture. J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).
- Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis. Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).
- Hertog, A., et al. Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies. PloS one. 5, (2010).
- Levin-Reisman, I., et al. Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes. Nature Methods. 7, (2010).
- Lewis, K.
- Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics. Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).
- Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).
- Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells. Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).
- Pin, C., Baranyi, J. Single-cell and population lag times as a function of cell age. Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).
- Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations. Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner. Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells. Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).
- Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).
- Ernebjerg, M., Kishony, R. Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking. Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).
- Rotem, E., et al. Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).
- Bigger, J. The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes. Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).
- Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiol. 13, 25 (2013).
- Moyed, H. S., Bertrand, K. P. Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis. Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).
- Balaban, N. Q. Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).
