Abstract
במוח, רוב מערכת כלי הדם מורכב ממחסום בררני, מחסום דם-המוח (BBB) המסדיר את חילופי מולקולות ותאי מערכת חיסון בין המוח והדם. יתר על כן, הדרישה המטבולית העצבית הענק דורשת רגולציה רגע לרגע של זרימת דם. יש לציין, חריגות של תקנות אלה הם סימני ההיכר של etiological ביותר פתולוגיות המוח; כולל גליובלסטומה, שבץ מוחי, בצקת, אפילפסיה, מחלות ניווניות (לשעבר: מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר), גידולים במוח, כמו גם מחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה, דלקת קרום מוח ותפקוד מוח הנגרם על-אלח דם. לפיכך, הבנת אירועי איתות ויסות הפיסיולוגיה כלי הדם במוח הוא אתגר גדול. תובנה הרבה לתוך המאפיינים התאיים ומולקולריים של סוגי התאים השונים המרכיבים את מערכת כלי הדם במוח יכולה להיות שנרכשו מהתרבות העיקרית או מיון תא מרקמת המוח טרי ניתק. למרות זאת,מאפיינים כגון קוטביות תא, מורפולוגיה ויחסים בין תאית אינם מתוחזקים בהכנות כאלה. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן נועד לטהר שברי כלי מוח, תוך שמירה על שלמות מבנית. אנו מראים כי כלי מבודדים מורכבים מתאי האנדותל החתומים על ידי צמתים הדוקים שמוקפים lamina בסיס מתמשך. Pericytes, תאי שריר חלק, כמו גם את קרומי endfeet astrocyte perivascular נשארים צמודים לשכבת האנדותל. לבסוף, אנו מתארים כיצד לבצע ניסויי immunostaining על כלי מוח מטוהרים.
Introduction
תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית (CNS) דורש סביבה תאית פיקוח הדוק, והדרישות מטבולים שלה הן עצומות בהשוואה לאיברים אחרים 1. מערכת העצבים המרכזית היא גם מאוד רגישה למגוון רחב של כימיקלים, בדרך כלל לא מזיק לאיברים היקפיים אבל לזה, רעיל למערכת עצבים. כדי להבטיח תפקוד נכון, רוב כלי הדם "של מערכת העצבים המרכזית מהווה מחסום אנדותל; את מחסום דם-המוח (BBB), אשר שולט על הזרימה של מולקולות ויונים, כמו גם המעבר של תאי מערכת חיסון בין הדם והמוח, ובכך שמירה על הומאוסטזיס נכון 2, אבל גם מגביל את הכניסה של תרופות טיפוליות, טיפולים ובכך פוגעים הפרעות נוירולוגיות של 3. ברמה התאית, BBB הוא בעיקר שנגרם צמתים הדוקים נרחבים בין תאי האנדותל, ביטוי מקוטב של מובילי זרימה וקצב transcytosis נמוך מאוד 4. מאפיינים ופונקציות של BBB בעיקר נגרמים על ידי neתאי ighboring 4. בפרט, pericytes לשחק תפקיד חשוב בגרימה ושמירה על BBB 5,6. להיות תאי התכווצות, pericytes גם לווסת את זרימת דם 7 כפי שעושה תאי שריר החלק סביב כלי גדול. לבסוף, האסטרוציטים, תאי גלייה העיקריים של המוח, לשלוח תהליכים גדולים בשם endfeet סביב ביותר של כלי הדם במוח ולווסת 8 שלמות BBB וקפאון חיסוני 9, העברת מטבוליטים לנוירונים 10, ולגרום לצימוד ההדוק בין פעילות העצבית ו זרימת דם 11,12.
היכולת ללמוד את המאפיינים המולקולריים ותאיים של מערכת כלי הדם במוח היא קריטית כדי לאפיין טובים יותר את תרומתה לפיזיולוגיה של המוח וphysiopathology. כדי להתמודד עם שאלה זו, אסטרטגיות לבודד את מערכת כלי הדם במוח של המוח פותחו, המאפשרים להכנה של שברי כלי המוח שלמים. עמ 'כלי המוחיurification תחילה תאר באמצעות מוח שור 13 ומשופרים ומותאם למינים אחרים, במכרסמים בפרט 14. במחקר האחרון, השימוש במסננים בגדלים שונים הוצג להפריד כלי מוח לשברים מועשרים בכלי בקטרים שונים. מעניין לציין, בהכנות כגון, תאי האנדותל שמרו את הנכסים שלהם מטבולי 15, פונקציונלי טרנספורטר 16 וקיטוב 17. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול זה ולהפגין עוד כי כלי מבודדים לשמר רובם במבנים באתר. תאי האנדותל להישאר מקושרים על ידי צמתים הדוקים ומוקפים lamina בסיס מתמשך. Pericytes ותאי שריר חלק נשארים צמודים לשכבת האנדותל, כמו גם קרומי astrocyte perivascular. עם זאת, האסטרוציטים, תאי microglial, תאי עצב וoligodendrocytes בוטלו. לבסוף, אנו מתארים הליך לביצוע immunostaining על כלי מוח מבודדים. עד עכשיו רוב המחקרים המולקולריים ותאיים הנוגעים למערכת כלי הדם במוח בוצעו על תאי מוח כלי מטוהרים ניתקו באמצעות זני תא ספציפיים עכבר כתב או נהלים מבוססי immunostaining 18,19 מיון תאים. למרות שטכניקות אלו מאפשרת הבידוד של אוכלוסיות תאי כלי דם במוח כמעט טהורות, תאים מבודדים לאבד לחלוטין באתר המורפולוגיה שלהם ואינטראקציות, אשר בתורו, במידה רבה משפיעה על התכונות מולקולריות ותאיות שלהם. הפרוטוקול מתואר כאן, המאפשר לבידוד של שברי כלי דם במוח כולו ללא צורך בנוגדנים ספציפיים או כתמי עכבר מהונדסים, מציע אלטרנטיבה טובה כמו המבנה הכללי של כלי מוח מבודדים נשמרת, כך, הפחתת השלכות על המאפיינים המולקולריים שלהם. כלי מבודדים עשויים לשמש ללימוד פעילות גן, סינתזת חלבון ורגולציה בBBB כלאחרונה תיארו 20,21 22,23 הפרוטוקול הנוכחי הוא זול, קל לביצוע ומהירות להתאמה לכל מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פתרונות וחומרים
- הכן את פתרונות כלי בידוד: B1, להוסיף 1.5 מיליליטר של HEPES 1M 150 מיליליטר של HBSS; B2, להוסיף 3.6 גרם של Dextran 20 מיליליטר של B1; B3, להוסיף 1 גרם של BSA לשל B1 100 מיליליטר.
- שנה את בעל מסנן על ידי חיתוך החלק התחתון מהחלק העליון הברגה.
- הכן את פתרונות immunostaining: פתרון קיבוע, Paraformaldehyde 4% ב- PBS pH 7.4; Permeabilization / פתרון חסימה, לדלל סרום עז 5% וטריטון X100 0.25% ב PBS pH 7.4.
הערה: הקיבוע תלוי בסוג של נוגדנים עיקריים בשימוש.
2. Dissection
הערה: תנאים סטריליים אינם נדרשים, אלא אם כלי משמשים למטרות תרבות תא.
- הכן כוס 150 מיליליטר עם 20 מיליליטר של B1. שמור על קרח ולכסות עם parafilm כדי למנוע זיהום אוויר.
- עמוק להרדים את העכבר מתחת למכסת מנוע עם מגבת נייר ספוגה בקטנה 1 מיליליטר של Isoflurane הטהורה שמתווסף into הכלוב. ההרדמה מאומתת על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן. להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
הערה: צעדים אלה נעשים בעמידה בתקנות לאומיות ומוסדיות. - אופציונאלי: בצע זלוף intracardiac עם 20 מיליליטר של PBS 1x לחסל את תוכן הדם 24.
- סעיף העור עם אזמל מהצוואר לאף ולמשוך אותו משם. הסר את כל שערות זיהום עם PBS 1x.
- כדי לפתוח את הגולגולת, הכנס ראשון מספריים anteriorly לנורת חוש הריח, ולפתוח את המספריים להתפקע הגולגולת בשני חלקים.
- מוציא בזהירות את המוח בעזרת מרית מוח. לנתח את מקלעת דמית העין מהחדרים לרוחב כפי שהם היו לזהם את הכנת כלי דם 38.
הערה: אופציונאלי: ההכנה הסופית תכיל כלי parenchymal וקרומי מוח. אם לא רצוי, ניתן התקלפו קרומי המוח בעקבות ההליך שתואר על ידי 38. - TRansfer המוח לתוך הכוס המכילה פתרון B1 על קרח. ניתן לטפל עד 8 מוחות יחד.
Homogenization רקמות 3. מוח
- באמצעות שני סכינים, באופן ידני ונמרץ לנצח את המוח בפתרון B1 לאחר מכן קבלת חתיכות קטנות של כ -2 מ"מ.
- Homogenize ההכנה עם homogenizer Dounce automatized, ביצוע 20 מקרי שבץ ב 400 סל"ד. ודא שצינור הזכוכית נשמר בקרח ושחלקו העליון של douncer הוא בפתרון כאשר נע מעלה ומטה, כדי למנוע ההיווצרות של כיסי אוויר. אם כמה דוגמאות מוכנות, לשטוף עם מים מיוננים douncer בין כל הומוגניזציה.
טיהור 4. כלי שייט
- מעבירים את homogenate לתוך צינור פלסטיק 50 מ"ל ולהמשיך לצנטריפוגה ב 2000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. ממשק גדול לבן (בעיקר המיאלין) יהווה בחלקו העליון של גלולה הכלי (אדום אם לא זלוף בוצע).
- בטל supernatant. גלולה הכלי והממשק הלבן יישארו מחובר יחד. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת B2 קר כקרח ולנער את הצינור באופן ידני ונמרץ דקות 1.
- המשך לצנטריפוגה השנייה ב4,400 גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. המיאלין כעת ליצור שכבה לבנה צפופה על פני השטח של supernatant.
- לנתק בזהירות את שכבת המיאלין מקירות הצינור על ידי מחזיק את הצינור ולאט לאט מסובב אותו כדי לאפשר את supernatant לעבור לאורך הקירות. בטל המיאלין עם supernatant. גלולה המכילה את כלי נשארה מחוברת בחלק התחתון של הצינור.
- למחוק את הקיר הפנימי של הצינור עם נייר סופג הכרוך סביב פיפטה פלסטיק 5 מ"ל ולהסיר את כל נוזלים שיורית, הימנע מלגעת בגלולת הכלי. שמור הפוך צינור על נייר סופג כדי לנקז את נוזלים שנותרו.
- להשעות את גלולה ב 1 מיליליטר של פתרון B3 קר כקרח על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טיפים, keepi נמוך מחייבng הצינור על קרח, ולאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר נוסף של פתרון B3. ודא שכלי מפוזרים ככל האפשר ולא יוצרים אגרגטים.
5. סינון
- הכן כוס בקרח עם 30 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח. לכסות עם parafilm כדי למנוע זיהום אוויר.
- מניחים 20 מיקרומטר מסנן-רשת על בעל מסנן שונה בחלק העליון של בקבוק בקר ולאזן על ידי יישום 10 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח.
- יוצקים את הכנת הכלי על המסנן ולשטוף כלים עם 40 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח.
- לשחזר את המסנן באמצעות מלקחיים נקיים ולטבול אותו באופן מיידי בכוס המכילה פתרון B3. לנתק את כלי מהמסנן ידי ניעור אותו בעדינות.
- יוצקים את תוכן הכוס בצינור פלסטיק 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ב -2,000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הערה: לחלופין, ההשעיה של כלי המוח מהשלב 4.6 ניתן לסנן על מסנן מיקרומטר-רשת 100.במקרה זה, כלי גדול יותר נשמרים באופן מועדף על המסנן בזמן הזרימה דרך מכיל microvessels (בעיקר נימים), אשר לאחר מכן מסוננות במסנן 20 מיקרומטר-רשת כאמור לעיל.
- Resuspend גלולה של microvessels ב 1 מיליליטר של פתרון B3 קר כקרח ולהעביר אותו על ידי pipetting אותו לתוך צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב -2,000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. קיבוע, permeabilization וחסימה
- העברת כלי על ידי pipetting לתוך 0.2 מיליליטר צינורות PCR המכילים PBS באמצעות קצה מחייב נמוך 1.0 מיליליטר. היזהר שלא לגעת בכולים כפי שהם עשויים לדבוק בחלק החיצוני של הקצה. לבצע את כל השלבים תחת מיקרוסקופ דו עיני הבאים.
- לכל אחד מהשינויים בינוניים הבאים, להשאיר את הצינורות על קרח עד כלי הגיעו לתחתית, ופיפטה את רוב הנוזלים באמצעות טיפים pipet ג'ל טעינה ארוכים ודבר.
- להסיר את רוב PBS ולהוסיף 200 μl של פתרון מקבע.להשעות את כלי על ידי טלטול בעדינות דגירה במשך 20 דקות ב RT.
- פיפטה את הפתרון מקבע ולהחליף אותו עם 200 μl של 1x PBS (השטיפה ראשונה), דגירה של 5 דקות ב RT וחזור על שלב זה 3 פעמים. בכל פעם, לוודא שכלי שכהלכה שקעו לתחתית הצינורות ופיפטה את 1x PBS, הבטחת כלי לא נגעו.
- לאחר השטיפה האחרונה, להחליף 1x PBS על ידי permeabilization / פתרון חסימת דגירה שעה 1 ב RT, resuspending כלי על ידי טלטול בעדינות מהעת לעת.
7. Immunostaining
- החלף את permeabilization פתרון החסימה / עם השילוב של נוגדנים עיקריים (ראה אזכור של הנוגדנים המשמשים כאן ודילולים בטבלת תבנית חומרים) בדילול מלא בpermeabilization / פתרון החסימה, ודגירה על 4 מעלות CO / N.
- לאחר 3 שוטף PBS ב RT, דגירה כלי עם השילוב של נוגדנים משני מדולל PBS לשעה 2ב RT.
- הערה: אנו ממליצים בחום ביצוע מכתים גרעיני עם Hoechst (1: 2,000) או DAPI (1: 2,000) כדי להבדיל כלי מזיהום אפשרי שערות או אבק מתחת למיקרוסקופ.
- לאחר 3 שוטף ב PBS, resuspend הכלים בμl 50 של PBS.
8. הרכבה ותצפית
- הכן קצה עם נימי זכוכית siliconized: לחתוך קצה פיפטה P200 באמצעות אזמל ולהתאים את הנימים בפנים. הנפח המשוער של הנימים הוא 40 μl.
- העבר את כלי לשקופית זכוכית באמצעות זכוכית נימי siliconized ולהסיר בזהירות את הנוזל עם פיסת נייר סופג.
- החל טיפה אחת של הרכבה בינונית על הספינות ולהחזיק coverslip ב-45 מעלות המאפשר הירידה להפיץ בשולי הפתק. בואו ללכת coverslip ולאפשר בינוניים להפיץ לאט. בוא O היבש / N ב RT עם ההגנה מפני אור. ניתן לצפות כלי תחת fluorescמיקרוסקופ confocal אף אוזן גרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר לבידוד המכני של כלי מוח 14. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של טכניקה זו. הארכיטקטורה של כלי מוח היא מורכבת וכוללת מספר סוגי תאים, כלומר, תאי האנדותל חתום על ידי צמתים הדוקים ומוקף pericytes, תאי שריר חלק, ותהליכי רגל astrocyte 9. לפיכך, לאחר הבידוד של כלי מוח, אנחנו מכוונים כדי לאפיין את המבנה של כלי מטוהרים על ידי immunostaining כפי שמתוארת בחלק השני של הפרוטוקול שלנו. Agrin, רכיב של lamina בסיס אנדותל תויג ברציפות והומוגנית על פני האנדותל (איור 2 א). Zona occludens-1 (הסתדרות ציונית-1), אחד מהמרכיבים של צמתים הדוקים אנדותל הייתה immunostained ללא המשכיות לכאורה, המצביעה על כך צמתים הדוקים אנדותל השתמרו (איור 2). כיסוי אנדותל pericyte, התוויתאד על ידי NG2, הופיע כמעט רציף כפי שתואר לעיל 25 (איור 2 ג). לבסוף, תיוג אקטין שריר חלק חשף את הנוכחות של שכבת תאי שריר חלק צפופה במשטחים של כלי הגדול מטוהר (איור 2 ד). תוצאות אלו מראות כי הכוללות במבנה כלי המוח באתרו נשמרים שבברי הכלי המבודדים.
האסטרוציטים הוכחו לשלוח תהליכים גדולים, או 'endfeet' אל פני השטח של כלי, לנדן כמעט לחלוטין את מערכת כלי הדם במוח 8. האינטראקציה שלהם הדוקה עם כלי דם ותפקידם בשמירה על כלי דם במוח והסדרת פונקציות שונות, המיועדים להם כחלק חיוני של יחידת העצבים וכלי הדם 9. בנוסף, אנו ניתחנו את הסיקור של כלי דם astrocyte של כלי מוח מבודדים. Immunolabelling של נימה ביניים astrocytic GFAP, הווה בדרך כלל בכל astrocyte (איור 3 א), waזה רק באופן חלקי קיימים בכולים מטוהרים מראים כמה סיבים קצרים על פני השטח האנדותל (איור 3-C). לעומת זאת, 43 Connexin, חלבון צומת פער מועשר בקרומי astroglial perivascular 26, זוהה מאוד על פני השטח של כלי מטוהרים גדולים (איור 3D) ונימים (איור 3E). באופן דומה, immunolabelling של aquaporin-4 (Aqp4), חבר של משפחת תעלת מים הביע מאוד ברמה של קרומי astrocyte מול כלי 27, 26, מתאר את דפנות כלי מבודדים (איור 3F-G). למרות האסטרוציטים לא שיתוף מטוהר עם כלי, קרומי endfeet perivascular נשארו קשורים במהלך ההליך המכני של בידוד כלי המוח.
לבסוף, בדקנו את הזיהום האפשרי של ההכנות שלנו על ידי סוגי תאים עצביים אחרים. Immunolabelling של חוטי ביניים עצביים (NFM) (Hornung et al, 1999) חשף את הנוכחות של כמה סיבים שנותרו מחוברים לכולים, המצביע על שיתוף טיהור אפשרית של כמה מסופים עצביים (איור 4 א-ב). מיקרוגלים, שכותרתו על ידי Iba1 (איור 4C-D) וoligodendrocytes, שכותרתו על ידי Olig2 (איור 4E-F) לא אותרו בכלי מבודדים. כך, תאי עצב, מיקרוגלים וoligodendrocytes לא שיתוף מטוהר עם כלי המוח.
יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שהפרוטוקול המתואר מאפשר הטיהור של שברים השתמרו מבני מוח כלי, שעליו קרומי astrocytic perivascular נשארים צמודים.
איור 1. תכנית סיכום של פרוטוקול טיהור כלי המוח. הצעדים העיקריים מוצגות. סקיצה זה מצביעה על שלושה שברי כלי אפשריים שניתן להשיג בהתאם לאינטרנט אלחוטי lters משמש (100 מיקרומטר-רשת או 20). S1: microvessels וכלי גדול, S2: כלי גדול וS3:. Microvessels אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ספינות מבודדות שמרו רובם במבנה אתרו. תחזיות תמונת Confocal של כלי מוח עכבר מבודד immunostained. Lamina סל immunolabelled לAgrin (אדום) (א). צמתים הדוקים תא האנדותל (B) immunolabelled לZonula Occludens (ZO-1 ) (אָדוֹם). Pericytes (C) immunolabelled לNG2 (אדום). (ד) תאי שריר חלק immunolabelled לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום). גרעיני מגואלות Hoechst (כחול).PG "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ממברנות Endfeet astrocyte נשארות צמודות לכלי השייט מזוקק. תחזיות תמונת Confocal. (א) תמונה של סעיף מוח מראה כלי קליפת המוח immunostained לאנדותל PECAM (לבן), GFAP astrocytic (אדום) וConnexin 43 (Cx43) (ירוק ). (ב, immunolabelling C) GFAP ((ב) או של כלי שיט גדולים שכותרתו לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום) (ג) ירוק) על פני השטח של נימים מבודדות שכותרתו על ידי B4 isolectin (לבן). (ג) הוא Re-הדפסה עם אישור 20 (D, E) immunolabelling Cx43 (ירוק) על פני השטח של נימים מבודדות שכותרתו על ידי B4 isolectin (לבן) (ד) או של כלי שיט גדולים שכותרתו לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום)
איור 4:.. נוירונים, Microglia וOligodendrocytes הם לא שיתוף מטוהר עם כלי מוח תחזיות תמונת Confocal (A, B) neurofilament (NFM) immunostaining על פרוסת 20 מיקרומטר בעובי בהיפוקמפוס (אדום) (א) וכלי מוח מטוהרים ( B). (Immunostaining microglial Iba1 על פרוסת קליפת המוח 20 מיקרומטר-עבה (r C, B)עורך) (ג) וכלי מוח מטוהרים (ד). (E, F) immunostaining oligodendrocyte Olig2 על פרוסת קליפת המוח 20 מיקרומטר בעובי (אדום) (E) וכלי מוח מטוהרים (F). גרעינים מגואלות בHoechst (לבן ), האנדותל ידי B4 Isolectine (Ib4) (ירוק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחסום דם-המוח מסדיר את המעבר של חומרים פיסיולוגיים ולצאת של מערכת העצבים המרכזית ומגן עליו מפני חומרים מזיקים הנמצאים בדם. הוא מעורב במספר פתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית, כוללים מחלות ניווניות 2 וגידולים במוח 28. החדירות נמוכות מאוד של BBB פוגעות גם המעבר של סוכנים טיפוליים מיקוד תאים עצביים והפיתוח של שיטות מתכוונות לפתוח BBB הפיך ללא השלכות מזיקות למוח הוא תחום מאוד פעיל של מחקר 3. מאמצים רבים נעשו כדי לפתח מודלים רבים-ערך וטכניקות המאפשרות חקירות סלולריות, מולקולריות ותרופתיות של BBB, ובפרט, פרוטוקולים לבידוד כלי מהמוח המכרסם. ניסיונות הראשונים פשוט אספו microvessels מרקמת המוח ניתקה מכאני באמצעות רשתות שינוי נקבובית בגודל משתנים להשליך לזהם תאי המוח parenchymal 13, 29, 30, 31. צנטריפוגה שיפוע צפיפות מאוחר יותר הציגה הקשורים לסינון של כלי מוח במשתלב ניילון או בחרוזי זכוכית עמודות 32, 33, 15. בהליכים אלה, חרוז זכוכית לעומת סינון רשת הניילון הופיע כדי לשפר את התשואות גבוהות ולעומת צנטריפוגה במהירות נמוכה, טוהר כלי-דם קטנים, למרות שצנטריפוגה במהירות גבוהה גורמת גם מאמץ גזירה המשפיע על ביטוי גנים 15, 32. צעד נוסף של עיכול אנזימטי גם הציג בכמה פרוטוקולים הבאים צעד הניתוק 34 במטרה לנתק את תאי עצב והאסטרוציטים חסיד להגדיל טוהר כלי-דם קטנים 35. עם זאת, לפני עיכול מוגזם יכול גם לשבש שלמות microcapillary 36, 37. לאחרונה, microdissection חיסוני הלייזר ללכוד (LCM חיסוני) הוכח כדי לאפשר שליפה של כלי או אפילו של אוכלוסיות תאים שונות בvesseLS, לבחון שינויים בביטוי גני BBB, למרות שכמות החומר שהושגה על ידי טכניקה זו היא מוגבלת מאוד 23.
כאן, אנו מציגים הליך בידוד מכאני של כלי מוח תחילה הרחיב על ידי אל Yousif et 14. הוא מציע את האפשרות להשיג כלי מוח טהורים, ולהפריד ביניהם לפי קוטרם. פרוטוקול זה אינו מתיימר לאפשר לטיהור של התא בכלי הדם במוח כולו, ולא להשוות את יעילותה בפרוטוקולים שפורסמו הקודמים. עם זאת, היעדר שיפוע, עמודות ספציפיות וצעדי צנטריפוגה במהירות גבוהה הופך את ההליך הכולל מאוד קל וזול. חשוב לציין, אנו ממליצים בחום להסיר את מקלעת דמית העין כפי שתואר על ידי 38 לפני הומוגניזציה של המוח, כפי שאנו חווים אותה כמקור אפשרי של זיהום. המלצות חשובות נוספות הן: 1) השימוש במאטר פלסטיק "מחייב הנמוך"ial (בטיפי פיפטה מסוימים) מאז כלי לדבוק באופן טבעי לפלסטיק שלא טופל. השמטת נקודה זו תגרום לאובדן של רוב כלי; 2) האיזון זהיר של מסנני ניילון לפני הסינון (שלב 5.2); 3) resuspension של גלולה בהרבה כחיץ ככל האפשר לפני הסינון כדי לשפר את טוהר של המדגם; 3) אם יש צורך, ניתן לכבס תאי דם וחלבונים שנלכדו בכלי מטוהרים על ידי זלוף intracardiac עם PBS לפני נתיחת המוח; 4) התשואה של כלי המטוהרים ניתן לשפר על ידי חזרה על ההפרדה מהמיאלין בdextran פעמים או שלוש (שלב 4.2) 39,40. עבור immunostaining, אנו ממליצים בחום: 1) כדי לבצע תיוג גרעיני כדי להבדיל כלי זיהום שערות ואבק שיש לי נוגדני זיקה שאינה ספציפית גדולה; 2) כדי למנוע איסוף כלי על ידי צנטריפוגה לפני כל שינוי בינוני כפי שהוא עשוי לגרום להיווצרות של כדור בלתי נפרד מחומר.
טיהור של כלי מוח שלמים להציג יתרונות גדולים ללמוד את המאפיינים המולקולריים של BBB. למרות שגני אנדותל וpericyte ספציפיים או מועשרים ומסלולים זוהו על ידי מחקרי transcriptomic וproteomic על סוגי תאים בודדים 18,19, זה ידוע היטב כי טכניקות ניתוק ומיון תא להוביל לאובדן של קוטביות תא ומורפולוגיה, כמו גם קישוריות בין סוגי תאים, שמאוד משפיעים על הפרופילים המולקולריים שלהם. בהקשר זה, שמירה על כלי דם התא כולו בשלמות כפי שתואר כאן, למעט האסטרוציטים, עשוי לייצג יתרון גדול. יתר על כן, בהשוואה למיון תא, טיהור של כלי המוח אינה דורשת השימוש בזני עכבר מהונדס כתב ספציפיים או נהלים מבוססי immunostaining ארוכים. יתרון נוסף לשימוש בכלי המוח הוא האפשרות של התאמת פרוטוקול הטיהור למינים אחרים כפי שכבר הראתה לmurine14, Bovine13 כמו גם בבני האדם 41,42. לבסוף, המשך פיתוח של הטכניקה הנוכחית יהיה התרבות במבחנה של שברי כלי המוח. שיתוף תרבות של כלי מטוהרים עם נוירונים האסטרוציטים ראשוניים ותאי microglial עשויה לעזור להרכיב מחדש את יחידת העצבים וכלי דם בצורה מדויקת יותר מאשר מערכות מורכבות 3 ממדים רב-תאיות תרבות שבה התאים הראשונים מבודדות ומטוהרות לפני שהורכב מחדש 43. כך טיהור של כלי מוח שלמים יכול להיות לעזר רב לפיתוח כל סוג של מבחני במבחנה ללמוד BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי MemoLife Labex ועל ידי ARSEP (Fondation לשפוך עוזר l'à la משוכלל ונדיר sur la sclérose en לוחות)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
| Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
| Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
| Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
| Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
| Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
| Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
| Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2,000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2,000 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2,000 |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Pardridge, W. M.
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Armulik, A., Genové, G., et al.
- Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
- Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Iadecola, C., Nedergaard, M.
- Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
- Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
- Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
- Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
- Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
- Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
- Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
- Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
- Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
- Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
- Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
- Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
- Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M.
- Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
- Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
- Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S.
- Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
- Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
- Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
- Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
- Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
- Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
- Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
- Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
- Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
- Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
- Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).
