Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Reinigung von Maus-Hirngefäße

Published: November 10, 2015 doi: 10.3791/53208
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4, 1,2,3
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

Abstract

Im Gehirn, die meisten der Gefäßsystem besteht aus einem selektiven Schranke, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Austausch von Molekülen und Immunzellen zwischen dem Gehirn und dem Blut reguliert. Darüber hinaus erfordert die große neuronale metabolischen Bedarf einen Moment zu Moment Regulation des Blutflusses. Bemerkenswert ist, Anomalien dieser Regelungen sind ätiologische Markenzeichen der meisten Hirnerkrankungen; einschließlich Glioblastom, Schlaganfall, Ödeme, Epilepsie, degenerative Erkrankungen (Beispiel: Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit), Hirntumoren sowie entzündlichen Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Meningitis und Sepsis-induzierten Hirnfunktionsstörungen. So, das Verständnis der Signalwege Modulation der zerebrovaskulären Physiologie ist eine große Herausforderung. Viel Einblick in die zellulären und molekularen Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen, die den zerebrovaskulären System besteht aus einer Primärkultur oder Zellsortierung von frisch gewonnenen Hirngewebe gewonnen werden. Jedoch,Eigenschaften wie die Zellpolarität, Morphologie und inter Beziehungen nicht in solchen Zubereitungen gehalten. Das Protokoll, das wir beschreiben soll Hirngefäß-Fragmente zu reinigen, während die strukturelle Integrität. Wir zeigen, dass isolierte Gefäße bestehen aus Endothelzellen durch Tight Junctions, die durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben sind versiegelt. Perizyten bleiben glatten Muskelzellen sowie die perivaskuläre Astrozyten Endfüßen Membranen Endothelschicht befestigt. Schließlich beschreiben wir, wie Immunfärbung Experimente an gereinigt Hirngefäße durchzuführen.

Introduction

Die einwandfreie Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS) erfordert einen stark regulierten extrazellulären Umgebung, und seine metabolischen Anforderungen sind riesig im Vergleich zu anderen Organen 1. Das ZNS ist auch extrem empfindlich gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien, in der Regel unschädlich für periphere Organe, sondern sie neurotoxische. Um eine einwandfreie Funktion zu gewährleisten, bildet der größte Teil der CNS 'Gefäßsystem eine Endothelbarriere; die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Fluss der Moleküle und Ionen sowie die Passage von Immunzellen, die zwischen dem Blut und dem Gehirn steuert, wodurch die richtige Homöostase 2 beibehalten, sondern auch die Eingabe von therapeutischen Arzneimitteln einschränkende Weise behindern Behandlungen neurologische Störungen 3. Auf zellulärer Ebene ist die BBB hauptsächlich durch umfangreiche tight junctions zwischen Endothelzellen, polarisierte Expression von Efflux-Transporter und einem sehr niedrigen Transzytose Rate 4 aufrechterhalten. Eigenschaften und Funktionen der BBB sind meist von ne induzierteighboring Zellen 4. Insbesondere spielen Perizyten eine wichtige Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung des BBB 5,6. Als kontraktilen Zellen Perizyten, regulieren auch die Durchblutung 7 als die glatten Muskelzellen umgebenden großen Gefäßen zu tun. Schließlich Astrozyten, die großen gliale Zellen des Gehirns, zu senden große Prozesse Endfüßen herum gestattet meisten Gehirngefäß 8 und modulieren BBB Integrität und Immun quiescence 9, den Transfer von Stoffwechselprodukten der Neuronen 10 und induzieren die enge Kopplung von neuronaler Aktivität und Blutung 11,12.

Die Fähigkeit, die molekularen und zellulären Eigenschaften des zerebrovaskulären Systems zu studieren, ist entscheidend, um eine bessere Charakterisierung ihres Beitrags zur Gehirnphysiologie und Arzneimitteltherapie. Um diese Frage anzugehen, Strategien, um das Gehirn die zerebrovaskuläre System zu isolieren sind entwickelt worden, die für die Herstellung von intakten Gehirn Schiffes Fragmente zu ermöglichen. Hirngefäßes purification wurde anfänglich unter Verwendung von Rinder Gehirne 13 beschrieben und verbessert und an andere Spezies, insbesondere Nagetieren 14. In dieser letzten Untersuchung wurde die Verwendung von Filtern unterschiedlicher Größe eingebracht, um den Hirngefäßen in den Fraktionen in Gefäße unterschiedlicher Durchmesser angereichert trennen. Interessant ist, dass in solchen Zubereitungen, hielt Endothelzellen ihren metabolischen Eigenschaften 15, Transporter Funktionen 16 und 17 Polarisations. Hier beschreiben wir im Detail dieses Protokoll und weiter zu zeigen, dass isolierte Gefäße behalten die meisten ihrer in situ-Strukturen. Endothelzellen bleiben tight junctions verbunden und durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben. Perizyten und Zellen der glatten Muskulatur bleiben der Endothelschicht sowie perivaskuläre Astrozyten Membranen angebracht. Jedoch Astrozyten Mikroglia-Zellen, Neuronen und Oligodendrozyten eliminiert. Schließlich beschreiben wir ein Verfahren durchzuführen Immunfärbung auf isolierte Hirngefäße. Bis jetzt die meisten der molekularen und zellulären Untersuchungen zur zerebrovaskulären Systems haben auf gereinigt Hirngefäßzellen durch distanzierte geführt Zellsortierung unter Verwendung von zellspezifischen Reportermausstämmen oder Immunfärbung basierte Verfahren 18,19. Obwohl diese Techniken können zur Isolierung von fast reinem zerebrovaskulären Zellpopulationen, isolierte Zellen vollständig verlieren ihre in situ Morphologie und Wechselwirkungen, die wiederum stark ihre molekularen und zellulären Eigenschaften betrifft. Das hier beschriebene Protokoll, so dass für die Isolierung von Gesamt zerebrovaskulären Fragmente ohne Notwendigkeit von spezifischen Antikörpern oder transgene Maus Flecken, bietet eine gute Alternative, da die Gesamtstruktur der isolierten Hirngefäße konserviert somit Verminderung Auswirkungen auf ihre molekularen Eigenschaften. Isolated Schiffe könnten dann für die Untersuchung der Genaktivität, Proteinsynthese und Regulierung an der BBB verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 20,21 22,23 Dieses Protokoll ist kostengünstig, einfach durchzuführen und in jedem Labor schnell anpassungsfähig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lösungen und Materialien

  1. Bereiten Isolationsgefäß Lösungen: B1, fügen Sie 1,5 ml HEPES 1M zu 150 ml HBSS; B2, fügen 3,6 g Dextran zu 20 ml B1; B3, wird 1 g BSA in 100 ml B1.
  2. Ändern Sie den Filterhalter durch das Schneiden des Boden off der oberen Verschraubung Teil.
  3. Bereiten Immunfärbung Lösungen: Fixierungslösung, 4% Paraformaldehyd in PBS pH 7,4; Permeabilisierung / Blockierlösung, verdünnter Ziegenserum zu 5% und Triton X100 auf 0,25% in PBS pH-Wert 7,4.
    Anmerkung: Die Fixierung ist abhängig von der Art der primären Antikörper verwendet.

2. Dissection

Anmerkung: Sterile Bedingungen nicht erforderlich ist, es sei denn, Schiffe für Zellkulturzwecke verwendet.

  1. Bereiten ein 150 ml Becherglas mit 20 ml B1. Halten Sie auf dem Eis geben und mit Parafilm um die Luftverunreinigung zu vermeiden.
  2. Die Maus tief betäuben unter einer Haube mit einer kleinen Papiertuch in 1 ml reinem Isofluran, die int hinzugefügt wird eingeweichto den Käfig. Anästhesie wird durch eine fehlende Reaktion auf eine Zehe pinch verifiziert. Tötet die Maus durch Genickbruch.
    Hinweis: Diese Schritte werden in Übereinstimmung mit nationalen und institutionellen Regelungen durchgeführt.
  3. Optional: intrakardiale Perfusion mit 20 ml PBS 1x, die Blut-Gehalt 24 zu eliminieren.
  4. § die Haut mit einem Skalpell aus dem Hals auf die Nase und ziehen Sie sie. Entfernen Sie alle verunreinigenden Haare mit PBS 1x.
  5. Um den Schädel zu öffnen, erste Schereneinsatz nach vorn, um den Riechkolben, und öffnen Sie die Schere, um den Schädel in zwei Teile brechen.
  6. Das Gehirn mit einem Hirn Spachtel vorsichtig entfernen. Präparieren Sie die Plexus choroideus der Seitenventrikel, wie sie das Blutgefäß Vorbereitung 38 kontaminieren würde.
    HINWEIS: Optional: Die letzten Vorbereitungen werden parenchymalen und Hirnhäute Gefäße enthalten. Wenn nicht gewünscht wird, kann im Anschluss an die Meningen off von 38 beschriebene Verfahren abgezogen werden.
  7. Transfer das Gehirn in das Becherglas mit B1-Lösung auf Eis. Bis zu 8 Köpfe zusammen behandelt werden.

3. Gehirngewebe Homogenisierung

  1. Mit Hilfe von zwei Skalpelle, manuell und kräftig zu schlagen, das Gehirn in der B1-Lösung anschließend Erhalt kleine Stücke von etwa 2 mm.
  2. Homogenisieren, die Vorbereitung mit einem automatisierten Dounce Homogenisator, die Durchführung 20 Hübe bei 400 Umdrehungen pro Minute. Sicherzustellen, dass die Glasröhre wird in Eis und dass der obere Teil des douncer in Lösung ist, wenn und ab bewegt, um so die Bildung von Lufttaschen zu verhindern, gehalten. Wenn mehrere Proben hergestellt, waschen Sie die douncer mit ionisiertem Wasser zwischen jeder Homogenisierung.

4. Vessel Reinigung

  1. Übertragen des Homogenisats in einen 50-ml-Kunststoffrohr und gehen in die Zentrifugation bei 2.000 g für 10 min bei 4 ° C. Eine große weiße Schnittstelle (meist Myelin), werden am oberen Ende des Behälters Pellet (Rot bilden, wenn keine Perfusion erfolgte).
  2. Überstand verwerfen. Das Gefäß und das Pellet weiß Schnittstelle miteinander verbunden bleiben. In 20 ml eiskaltem B2-Lösung und manuell und kräftig schütteln Sie das Röhrchen 1 min.
  3. Verfahren zur zweiten Zentrifugation bei 4.400 g für 15 min bei 4 ° C. Das Myelin wird nun eine dichte weiße Schicht auf der Oberfläche des Überstandes.
  4. Vorsichtig abziehen der Myelinschicht von den Rohrwänden durch Halten des Rohres und langsam drehen, damit der Überstand, um an den Wänden bestehen. Verwerfen Myelin mit dem Überstand. Das Pellet, das die Gefäße bleibt an der Unterseite des Rohres angebracht ist.
  5. Tupfen Sie die Innenwand des Rohres mit einem saugfähigen Papier um eine 5 ml Plastikpipette eingewickelt und entfernen Sie alle Restflüssigkeiten und berühren nicht die Gefäß Pellet. Halten Sie das Röhrchen kopfüber auf ein saugfähiges Papier um Restflüssigkeiten zu entleeren.
  6. Hängen Sie das Pellet in 1 ml eiskaltem B3-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mit Low-Bindung Tipps, keeping die Röhrchen auf Eis, fügen Sie dann weitere 5 ml B3-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Schiffe sind so weit wie möglich verteilt und keine Aggregate bilden.

5. Filtration

  1. Bereiten Sie ein Becherglas auf Eis mit 30 ml eiskaltem B3-Lösung. Deckel mit Parafilm um die Luftverunreinigung zu vermeiden.
  2. Legen Sie eine 20 & mgr; m-Sieb-Filter auf einer modifizierten Filterhalter auf der Spitze eines becker Kolben und ins Gleichgewicht, indem 10 ml eiskaltem B3-Lösung.
  3. Gießen Sie das Gefäß Vorbereitung auf dem Filter und spülen Sie die Gefäße mit 40 ml eiskaltem B3-Lösung.
  4. Recover den Filter mit sauberer Pinzette und sofort eintauchen in das Becherglas mit dem B3-Lösung. Trennen Sie die Geräte vom Filter von ihr leichtes Schütteln.
  5. Gießen des Bechers Gehalt in einem 50 ml Kunststoffröhrchen und Zentrifugation bei 2.000 g für 5 min bei 4 ° C.
  6. Hinweis: Alternativ können die Hirngefäße "Suspension aus Schritt 4.6 auf eine 100 & mgr; m-Sieb-Filter gefiltert werden.In diesem Fall werden größere Gefäße vorzugsweise auf dem Filter zurückgehalten, während die Durchfluss enthält Mikrogefßen (hauptsächlich Kapillaren), die dann auf einem 20 & mgr; m-Mesh-Filter, wie oben filtriert werden.
  7. Das Pellet von Mikrogefäßen in 1 ml eiskaltem B3-Lösung und überträgt es durch Pipettieren es in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugation bei 2.000 g für 5 min bei 4 ° C.

6. Fixierung, Permeabilisierung und Blocking

  1. Transfer Gefäße durch Pipettieren in 0,2 ml PCR-Röhrchen mit PBS unter Verwendung einer 1,0 ml geringe Bindungsspitze. Darauf achten, nicht zu berühren die Gefäße, da sie nach außen Teil der Spitze halten. Führen Sie alle folgenden Schritte unter einem Binokular.
  2. Für jede der folgenden Mediums ändert, lassen Sie die Röhrchen auf Eis, bis die Schiffe haben den Boden erreicht, und Pipetten die meisten der Flüssigkeiten mit langen und etwas Gel-Loading-Pipettenspitzen.
  3. Entfernen Sie die meisten der PBS und fügen Sie 200 ul der Fixierlösung.Suspend die Gefäße durch leichtes Schütteln und Inkubation für 20 min bei RT.
  4. Pipettieren Sie die Fixierungslösung und ersetzen Sie es mit 200 ul 1x PBS (erste Wäsche), Inkubation für 5 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. Jedes Mal, wenn Sie sicher, dass Schiffe, korrekt auf den Boden der Röhrchen und Pipette aus 1x PBS versenkt, wodurch die Behälter nicht berührt.
  5. Nach dem letzten Wasch ersetzen 1x PBS durch die Permeabilisierung / Blockierlösung und Inkubation 1 h bei RT, Resuspendieren der Schiffe, die von sanft von Zeit zu Zeit schütteln.

7. Immunfärbung

  1. Ersetzen Sie die Permeabilisierung / Blocking-Lösung mit der Mischung aus primären Antikörpern (siehe Referenzen der in der Materialvorlage Tabelle verwendet und Verdünnungen Antikörper) in der Permeabilisierung / Blockierlösung verdünnt, und Inkubation bei 4 ° CO / N.
  2. Nach 3 Waschschritten in PBS bei RT inkubieren die Gefäße mit der Mischung aus Sekundärantikörper in PBS für 2 Stunden verdünntbei RT.
  3. Hinweis: Wir empfehlen dringend, Kernfärbung mit Hoechst (1: 2.000) oder DAPI (1: 2000), um die Schiffe vor möglichen verunreinigenden Haare oder Staub unter dem Mikroskop zu unterscheiden.
  4. Nach 3 Waschungen in PBS, Resuspendieren der Gefäße in 50 ul PBS.

8. Montage und Beobachtung

  1. Bereiten Sie eine Spitze mit einem silikonisierten Glaskapillare: schneiden Sie ein P200 Pipettenspitze mit einem Skalpell und stellen Sie die Kapillare im Inneren. Das ungefähre Volumen der Kapillare 40 ul.
  2. Übertragen Sie die Schiffe auf einem Glasobjektträger mit dem silikonisierten Glaskapillare und entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Stück saugfähigem Papier.
  3. Tragen Sie einen einzigen Tropfen Eindeckmedium auf die Schiffe, und halten Sie ein Deckglas bei 45 ° so dass der Tropfen, um entlang der Kante der Schlupf zu verbreiten. Lassen Sie aus dem Deckglas und lassen mittel- bis langsam ausbreiten. Lassen Sie es trocken O / N bei RT unter Lichtschutz. Schiffe unter einer fluoreszier beobachtenent konfokalen Mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier haben wir ein Protokoll, so dass für die mechanische Isolierung des Hirngefäße 14 zu beschreiben. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte dieser Technik. Die Architektur der Hirngefäße ist komplex und umfasst mehrere Zelltypen, dh, Endothelzellen von tight junctions verschlossen und von Perizyten, glatte Muskelzellen und Astrozyten Fußfortsätzen 9 umgeben. So nach der Isolierung der Gehirngefäße, war es unser Ziel, die Struktur des gereinigten Gefäße durch Immunfärbung wie in dem zweiten Teil der Protokoll beschrieben charakterisieren. Agrin, eine Komponente der endothelialen Basalmembran war, kontinuierlich und homogen auf der Endotheloberfläche (2A) markiert. Zona-Occludens-1 (ZO-1), eine der Komponenten der endothelialen tight junctions wurde ohne ersichtliche Diskontinuität immungefärbt, was darauf hindeutet, dass endotheliale tight junctions aufbewahrt wurden (2B). Die endotheliale Perizyten Abdeckung, Labeldurch NG2 ed erschien nahezu kontinuierlich, wie zuvor beschrieben 25 (Abbildung 2C). Schließlich offenbart Glattmuskelaktin Markierung das Vorhandensein eines dichten glatten Muskelzellschicht an den Oberflächen der großen gereinigten Gefäße (2D). Diese Ergebnisse zeigten, dass die in situ Gehirngefäßstruktur wurde in den isolierten Gefäß Fragmente erhalten.

Astrozyten sind gezeigt worden, um große Prozesse oder "Endfüßen 'an die Oberfläche der Behälter zu schicken, Ummantelung nahezu vollständig die zerebrovaskuläre System 8. Ihre engen Interaktion mit Schiffen und deren Rolle bei der Erhaltung und Regelung verschiedener Hirnfunktionen, sie als ein entscheidender Teil der neurovaskulären Einheit 9 bezeichnet. Wir weiter analysiert die Astrozyten Gefäß Abdeckung isoliert Hirngefäße. Immunmarkierung des astrocytic Intermediärfilament GFAP vorliegenden normalerweise im ganzen Astrozyten (3A), was nur teilweise vorhanden auf gereinigten Gefäßen, die einige Kurzfasern an der Endotheloberfläche (3B-C). Im Gegensatz dazu wurde Connexin 43, ein Gap-junction-Protein in perivaskulären Astroglia Membranen 26 hochangereicherte, stark an der Oberfläche des gereinigten großen Gefäßen (3D) und Kapillaren (3E) detektiert. Ebenso Immunmarkierung von Aquaporin-4 (AQP4), ein Mitglied des Wasserkanals Familie stark zum Ausdruck auf der Ebene der Astrozyten-Membranen mit Blick auf die Schiffe, 27, 26, umreißt die Wände isoliert Gefäße (3F-G). Obwohl Astrozyten waren nicht mit Schiffen zusammen gereinigt, blieb ihre perivaskulären Endfüßen Membranen während des mechanischen Verfahren der Hirngefäß Isolierung angebracht.

Schließlich untersuchten wir die mögliche Kontamination unserer Präparate durch andere neurale Zelltypen. Immunmarkierung von neuronalen Intermediärfilamente (NFM) (HornunG et al, 1999) zeigte die Anwesenheit von einigen auf dem Behälter befestigt übrigen Fasern, was eine mögliche Co-Reinigung von einigen neuronalen Anschlüsse (4A-B). Mikroglia durch Iba1 (4C-D) und Oligodendrozyten durch Olig2 (4E-F) gekennzeichnet sind nicht in isolierten Gefäßen detektiert. Somit Neuronen, Mikroglia und Oligodendrozyten waren mit der Hirngefäße gemeinsam gereinigt.

Zusammen zeigen diese Ergebnisse, daß das beschriebene Protokoll ermöglicht die Reinigung von strukturell konserviert Hirngefäß-Fragmente, auf die perivaskuläre astrocytic Membranen befestigt bleiben.

Abbildung 1
Abbildung 1. Zusammenfassung Schema des Gehirns Vessel Reinigungsprotokoll. Die wichtigsten Schritte werden vorgestellt. Diese Zeichnung zeigt die drei möglichen Gefäß Fraktionen, die erhalten werden können, in Abhängigkeit von der fi Filtern verwendet (20 oder 100 & mgr; m-mesh). S1: Mikrogefäßen und großen Gefäßen, S2: große Schiffe und S3:. Mikrogefäßen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Isolierte Vessels Bewahren Sie die meisten ihrer In-situ-Struktur. Die konfokale Bildprojektionen von immun isolierten Maus Hirngefäße. (A) Basallamina für Agrin (rot) immun. (B) Endothelzellen tight junctions immun für Zonula Occludens (ZO-1 ) (rot). (C) Perizyten immun für NG2 (rot). (D) Glatte Muskelzellen für Glattmuskelaktin (SMA) immun (rot). Kerne mit Hoechst (blau) gefärbt.pg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Astrocyte Endfüßen Membranen bleiben, um das gereinigte Gefäße angebracht ist. Die konfokale Bildprojektionen. (A) Bild einer Gehirnschnitt, der einen Rindengefäß für endotheliale PECAM (weiß) immungefärbt, Astrozyten GFAP (rot) und Connexin 43 (Cx43) (grün ). (B, C) ​​GFAP Immunmarkierung (grün) an der Oberfläche eines isolierten Kapillare durch Isolectin b4 (weiß markiert) (B) oder aus einem großen Gefäß für Glattmuskelaktin (SMA) (rot) (C) gekennzeichnet. (C) ist eine Re-Print mit der Genehmigung von 20 (D, E) Cx43 Immunmarkierung (grün) an der Oberfläche eines isolierten Kapillare durch Isolectin b4 (weiß) (D) bezeichnet oder aus einem großen Gefäß für Glattmuskelaktin (SMA) markiert (rot) (F, G) Aquaporin 4 (AQP4) Immunmarkierung (grün) an der Oberfläche eines isolierten Kapillare durch Isolectin b4 (weiß) (F) markiert oder aus einem großen Gefäß für Glattmuskelaktin (SMA) bezeichnet (rot) (G). Kerne mit Hoechst (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abb. 4:. Neuronen, Mikroglia und Oligodendrozyten nicht mit Hirngefäße Zusammenarbeit gereinigt konfokale Bildprojektionen (A, B) Neurofilament (NFM) Immunfärbung auf eine 20 um dicke Hippocampusschnitt (rot) (A) und gereinigtes Hirngefäße ( B). (C, B) Microglial Iba1 Immunfärbung auf einem 20 um dicken kortikalen Scheibe (red) (C) und gereinigte Hirngefäße (D). (E, F) Oligodendrocyte Olig2 Immunfärbung auf einem 20 um dicken kortikalen Scheibe (rot) (E) und gereinigte Hirngefäße (F). Die Zellkerne werden durch Hoechst gefärbt (white ), Endothel durch Isolectine b4 (Ib4) (grün). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die Blut-Hirn-Schranke regelt den Durchgang von physiologischen Substanzen in und aus dem ZNS und schützt sie vor im Blut vorhandenen möglicherweise schädlichen Substanzen. Es wird in verschiedenen ZNS-Erkrankungen beteiligt, darunter neurodegenerative Erkrankungen 2 und Hirntumoren 28. Der extrem niedrige Durchlässigkeit des BBB behindert auch den Durchgang von Therapeutika gezielt Nervenzellen und die Entwicklung von Methoden der Absicht, reversibel öffnen Sie die BBB ohne nachteilige Folgen für das Gehirn ist ein sehr aktives Forschungsfeld 3. Viele Anstrengungen wurden unternommen, um wertvolle Modelle und Techniken ermöglichen zelluläre, molekulare und pharmakologische Untersuchungen der BBB und insbesondere Protokolle für die Isolierung von Gefäßen aus dem Gehirn von Nagetieren zu entwickeln. Erste Versuche einfach gesammelten Mikrogefäßen aus mechanisch dissoziiert Hirngewebe mit variabler Porengroße Maschen zu verwerfen gefährdend Gehirn Parenchymzellen 13, 29, 30, 31. Dichtegradientenzentrifugation später erfolgte die Filtration der Gehirngefäße auf Nylonmaschen oder auf Glasperlen Spalten 32, 33, 15 verbunden. In diesen Verfahren, Glasperlen gegen Nylonmaschenfilter schien Verbesserung der Ausbeute und hoch im Vergleich Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, microvessel Reinheit, obwohl Hochgeschwindigkeitszentrifugation induziert auch Scherbeanspruchung, die die Genexpression 15, 32 wirkt. Ein zusätzlicher Schritt des enzymatischen Verdau wurde auch in einigen Protokollen nach dem Dissoziationsschritt 34 mit dem Ziel des Abnehmens anhaftenden Neuronen und Astrozyten microvessel Reinheit 35 erhöhen eingeführt. Allerdings könnte eine übermäßige Vorverdauung auch stören Mikrokapillare Integrität 36, 37. In jüngerer Zeit immuno-Laser Mikrodissektion (immuno-LCM) ist gezeigt worden, um das Abrufen von Schiffen oder von unterschiedlichen Zellpopulationen in vesse Freigabels, um Änderungen in BBB Genexpression zu untersuchen, obwohl die Menge an Material, das durch dieses Verfahren erhalten wird, ist sehr begrenzt 23.

Hier präsentieren wir ein Verfahren für eine mechanische Isolierung des Hirngefäße zunächst von Yousif et al 14 ausgearbeitet. Es bietet die Möglichkeit, reine Hirngefäße zu erhalten und sie nach ihren Durchmesser zu trennen. Dieses Protokoll gibt nicht vor, die Reinigung des gesamten Gehirns Gefäßraum zu ermöglichen, und wir hatten nicht seine Wirksamkeit mit den bisherigen veröffentlichten Protokollen zu vergleichen. Die Abwesenheit von Gradienten, bestimmte Spalten und Hochgeschwindigkeitszentrifugation Schritte macht jedoch das Gesamtverfahren sehr einfach und kostengünstig. Wichtig ist, empfehlen wir dringend, die Plexus zu entfernen, wie durch 38 vor der Homogenisierung des Gehirns beschrieben, wie wir es erlebt als eine mögliche Quelle der Verunreinigung. Weitere wichtige Empfehlungen sind: 1) die Verwendung von "low binding" Kunststoff material (insbesondere Pipettenspitzen), da Schiffe halten natürlich zu unbehandelten Kunststoffen. Das Weglassen dieser Stelle den Verlust der meisten Schiffe führen; 2) die sorgfältige Äquilibrierung von Nylonfiltern vor der Filtration (Schritt 5.2); 3) Die Resuspension der Pellets in so viel Puffer wie möglich vor der Filtration, um die Reinheit der Probe zu verstärken; 3) Falls erforderlich, Blutzellen und Proteine ​​in gereinigter Gefäßen ansammeln können durch intrakardiale Perfusion mit PBS vor der Gehirnsezierung gewaschen werden; 4) Die Ausbeute an Gefäße gereinigt könnte durch Wiederholen der Trennung von dem Myelin in Dextran zwei oder drei Mal (Schritt 4.2) 39,40 verbessert werden. Für die Immunfärbung, empfehlen wir: 1), um eine Kern Kennzeichnung, um Schiffe von verunreinigenden Haare und Staub, für die Antikörper haben große unspezifische Affinität unterscheiden durchzuführen; 2), um zu vermeiden, das Sammeln der Schiffe durch Zentrifugation vor jedem Mediumwechsel wie es bei der Bildung von einem unentwirrbaren Ball des Materials führen.

Die Reinigung des intakten Hirngefäße zu präsentieren große Vorteile, die molekularen Eigenschaften von BBB zu studieren. Obwohl spezifische oder angereicherten Endothelzellen und Perizyten Gene und Signalwege durch transkriptomischen und proteomische Untersuchungen an einzelnen Zelltypen 18,19 identifiziert wurde, ist es gut bekannt, dass die Dissoziation und Zellsortiertechniken führen zum Verlust der Zellpolarität und Morphologie sowie die Verbindung zwischen Zelltypen, die stark beeinflussen ihre molekulare Profile. Dabei halten die gesamte Gefäßraum intakt, wie hier beschrieben, mit der Ausnahme von Astrozyten, könnte einen großen Vorteil darstellen. Darüber hinaus, im Vergleich zu Zellsortierung, Aufreinigung der Gehirngefäße nicht die Verwendung von spezifischen transgenen Reportergen-Mausstämmen oder langwierige Immunofärbung basierten Verfahren. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Gehirngefäßen ist die Möglichkeit, die Reinigungsprotokoll auf andere Arten, wie bereits für murine14 gezeigten, Bovine13 sowie beim Menschen 41,42. Schließlich wäre eine weitere Ausgestaltung der vorliegenden Technik der in vitro-Kultur von Gehirngefäßen Fragmente sein. Co-Kultur von gereinigtem Gefäße mit primären Astrozyten Neuronen und Mikroglia-Zellen könnte dazu beitragen, die neurovaskuläre Einheit auf eine genaue Art und Weise, als komplexe 3-dimensionale vielzelligen Kultursystemen, wo Zellen zuerst isoliert und gereinigt, bevor sie wieder zusammengebaut 43. So Reinigung von intakten Hirngefäße wieder zusammensetzen könnte eine große Hilfe bei der Entwicklung von jeder Art von in vitro-Tests, um die BBB zu studieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Labex MemoLife und durch die ARSEP unterstützt (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en Plaques)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Tags

Neuroscience Ausgabe 105 zerebrovaskuläre System Blut-Hirn-Schranke Schiffsreinigung Endothelzellen Astrocyte Endfüßen Perizyten glatte Muskelzellen
Reinigung von Maus-Hirngefäße
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boulay, A. C., Saubaméa, B.,… More

Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter