Introduction
الضمور البقعي (AMD) المرتبطة بالعمر هو واحد من الأسباب الرئيسية للعمى في الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 50 1-3. AMD يمكن تصنيفها إلى نوعين: ضامر ("تجف") AMD وحديث التوعي ("الرطب") AMD. يتميز السابق بضمور الجغرافي للالظهارة الصبغية الشبكية (RPE)، المشيماء الشعيرية، وخلايا مستقبلة للضوء، في حين يتميز هذا الأخير من غزو السفن غير طبيعية من المشيمية في طبقات الشبكية الخارجي مما تسبب في تسرب، والنزف، والتليف، وفي نهاية المطاف مما يؤدي إلى العمى 1،2. من الشكلين، وحسابات التوعية المستحدثة AMD بالنسبة للغالبية من فقدان البصر 1. لحسن الحظ، هذا النموذج لديه خيارات عديدة للإدارة الدوائية الفعالة، في حين أن نظيرتها الضموري قد حاليا أي ثبت العلاجات الطبية 3. وعلاوة على ذلك، لأن النموذج التوعية المستحدثة تم بسهولة إعادة استسلمت في نموذج حيواني، فقد كان أكثر سهولة على نطاق واسع والأساسيةبحث MD استكشاف الآليات المرضية الكامنة من أجل تطوير علاجات رواية (4).
تم تطوير نموذج حيواني الأول من اتساع الأوعية الدموية المشيمية التجريبية (CNV) عن طريق ريان وآخرون. في الرئيسيات غير البشرية 5. هذه القطيعة نموذج الناجم عن غشاء بروك عبر الضوئي بالليزر، مما تسبب في الاستجابة الالتهابية المحلية مما أدى إلى تكوين الأوعية الدموية شبيهة بتلك التي شوهدت في التوعية المستحدثة AMD. تم العثور على تطور الأنسجة من الأوعية الدموية تحريض ما بعد الليزر لتقليد حديث التوعي AMD، التي أكدت صحة النموذج 6. الرئيسيات غير البشرية تقدم علم التشريح الأكثر مماثلة على البشر، ولكن للأسف، هي مكلفة للحفاظ على، لا يمكن بسهولة التلاعب بها وراثيا، ولها دوام بطء تطور المرض 7. على النقيض من نماذج القوارض هي أكثر من ذلك بكثير للحفاظ على فعالية من حيث التكلفة، ويمكن التلاعب بها وراثيا مع السهولة النسبية، ولها أسرع بكثير فصول التوجيه الجامعيRSE من تطور المرض (ويمكن إجراء التجارب على نطاق ووقت أسابيع مقابل شهرا). وينبغي إجراء هذه التجارب إلا في القوارض المصطبغة كما أنه من الصعب جدا تصور في الحيوانات البيضاء.
نموذج CNV يسببها الليزر الفأر، وضعت لأول مرة من قبل مجموعة Campochiaro في أواخر 90 10 و، نمت لتكون النموذج الحيواني السائد في معظم الدراسات الحديثة 11-16. بسبب المرضية المعقدة ويزال من غير الواضح من CNV، وقد تم تطبيق نموذج الليزر في جميع جوانب البحث AMD الرطب بدءا من دراسة الآليات الجزيئية القيادة الأوعية الدموية لتقييم طرق العلاج الجديدة للاستخدام البشري في المستقبل. على سبيل المثال، ساكوراي وآخرون. واسبينوزا-Heidmann وآخرون. استخدام نموذج الليزر لدراسة تأثير الضامة على تطوير CNV باستخدام الفئران المعدلة وراثيا والعلاجات الدوائية نضوب 15، 16. Giani وآخرون. وHoerster وآخرون. تستخدم البصرية تماسك التصوير المقطعي (أكتوبر) لصورة CNV في محاولة لتوصيف تطور CNV ومقارنة النتائج النسيجية لنتائج نشاهد في أكتوبر التصوير 12،17 الليزر التي يسببها. وأخيرا، وقد استخدمت الدراسات التي تنطوي على حقن intravitreal من العوامل المضادة للعائية كما شرطان أساسيان للمحاكمات الإنسان وكانت حيوية في تطوير الجيل الأول من مضادات VEGF المستخدمة في إدارة حديث التوعي AMD اليوم 10،18،19.
نماذج بديلة لالتجريبي CNV تستخدم الأساليب الجراحية للحث على CNV. ويشمل هذا الإجراء حقن المواد المؤيدة للعائية (مثل ناقلات فيروسية المؤتلف overexpressing VEGF، حقن تحت الشبكية من خلايا RPE و / أو الخرز البوليسترين) لتقليد زيادة التعبير VEGF ينظر في التوعية المستحدثة AMD، وذلك بهدف التسبب في الأوعية الدموية 8،20. ومع ذلك، وهذه الطريقة تعطي معدلات أقل بشكل كبير من اتساع الأوعية الدموية. وأظهرت هذه الدراسات أن CNV فييحدث C57 / BL6 الفئران في 31٪ من عمليات الحقن مقابل ~ نسبة النجاح 70٪ يرى في طريقة الضوئي ليزر في نفس سلالة من الفئران 8،14. لهذه الأسباب، ونظرا للمزايا استخدام القوارض مقابل الرئيسيات غير البشرية، أصبح نموذج الفأر التي يسببها الليزر CNV النموذج الحيواني القياسي لCNV لمعظم حديث التوعي تجارب الدراسة AMD 8.
العين الماوس هي ضئيلة، الأنسجة الحساسة للعمل مع. المناورة من العين لتصور شبكية العين صعبة وتتطلب قدرا كبيرا من التدريب حتى يتم تحقيق إتقان. ويزيد من تعقيد هذه المهمة من حقيقة أنه يجب أن يتعلمها مع اليد المسيطرة وغير المسيطرة. وعلاوة على ذلك، بعد أن تم تعلم حركات غرامة المطلوبة لتصور شبكية العين، والتنسيق بين كلتا اليدين ودواسة القدم تشغيل الليزر مهمة. في هذه الورقة، سعينا لاستخلاص تحديات تعلم كل من التلاعب المادية تشارك في الليزر التي يسببها CNV بروكedure إلى دليل من شأنه أن يساعد مشغلي تحقيق النجاح السريع مع هذا النموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 2013 الطبعة، ورابطة للبحوث في الرؤية والعيون (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، والتي وافق عليها الحيوان المؤسسي الرعاية واستخدام اللجنة لجامعة نورث وسترن.
ملاحظة: يمكن أن يتم الإجراء التالي تماما مع مشغل واحد. ومع ذلك، يجري ذلك بشكل أكثر كفاءة مع اثنين من المشغلين مع مهام تقسيم وفقا لذلك.
1. إعداد محطة الليزر وقبل الليزر
- ضع الليزر والمصباح الشقي حيث يمكن الوصول إليها بسهولة. بدوره على الليزر وتعيين المعلمات محددة مسبقا (على سبيل المثال 75 ميكرون حجم البقعة، 100 ميجاوات، 100 ميللي ثانية مدتها).
تنبيه: تأكد مشغل ترتدي يتم عرض جميع معدات الوقاية الشخصية الحيوانية وسلامة الليزر والليزر السلامة ذات الصلة علامات خارج الغرفة الداخلي.- قبل استخدام أي حيوانات التجارب، والعثور على المعلمات مثالية باستخدام المعايرة، والماوس غير التجريبية. سيعتمد المعلمات الليزر على الليزر المستخدمة. يتم تعريف المعلمات مثالية من وضع أدنى طاقة الليزر التي تسبب باستمرار "فقاعة" تشكيل عندما ركزت بشكل صحيح. انظر الفيديو على سبيل المثال الآفة مع سليم "فقاعة" تشكيل.
- إعداد المحطة قبل الليزر بحيث التخدير والحيوان أكثر دفئا، وتقضي على الأنسجة، وجميع قطرات العين (تروبيكاميد، تتراكائين، والدموع الاصطناعية) هي في متناول اليد بسهولة إلى المشغل.
- تأكد من أن الحيوانات أكثر دفئا هو قبل تسخينها إلى درجة حرارة تصحيح (37 ° C) قبل حقن مخدر في الماوس الأول من أجل تجنب يسببها التخدير انخفاض حرارة الجسم.
- ضع الماوس على مرحلة أكثر دفئا لذلك يمكن الاحتفاظ بالحرارة وتبقى دافئة عندما يبدأ إجراء الليزر.
2. الماوس التخدير والتحضير المسبق ليزر
- قبل حقنالتخدير جي، وفحص العين ظاهريا للتأكد من أنه لا يوجد لديه تشوهات أو شذوذ أن يقلل من وضوح القرنية (مثل إعتام عدسة العين).
- وزن الماوس.
- سجل الوزن والجنس ورقم الحيوانية.
- باستخدام الوزن، وحساب كمية مناسبة من مخدر لاستخدامها على أساس المبادئ التوجيهية التي قدمها مؤسسة (على سبيل المثال 100 ملغ / كغ من هيدروكلوريد الكيتامين، 10 ملغ / كغ زيلازين أو ثلاثي بروم إيثانول 250 ملغ / كغ؛ ل20 ز الماوس حقن 0.20 مل زيلازين / الكيتامين كوكتيل OR 0.25 مل من ثلاثي بروم إيثانول). لدينا جدول جرعات محسوبة مسبقا في الوزن في الزيادات من 1 غرام من أجل الحد من الأخطاء الحسابية.
- القفا الماوس وحقن مخدر تستند البريتونى على حسابات في الخطوة 2.4.
- ضع الماوس على الحيوانات أكثر دفئا والانتظار حتى يتم تخدير الماوس بشكل كامل عن طريق التحقق من المنعكس دواسة عن طريق قرصة اصبع القدم (حوالي 3-5 دقائق).
- نشمر عن أنسجة مسح وحماية منطقة الماوس، الأنف لمنع aspiratأيون السائل لفة قبالة. الماوس لفة على جانبها ووضع قطرة (حوالي 30 ميكرولتر) من تتراكائين هيدروكلوريد في كل عين للتخدير الموضعي. الانتظار 2 دقيقة عن حل نافذة المفعول.
- كرر الخطوة 2.7 مع قطرة واحدة من تروبيكاميد موضعي لالحدقة تمدد. بدلا من ذلك، استخدم هيدروكلوريد فينيليفرين (2.5٪) للتمدد.
- الانتظار 2 دقيقة عن حلول نافذة المفعول. إبقاء الحيوانات على أكثر دفئا خلال هذا الوقت.
- بعد انقضاء الوقت المناسب، ضع بسرعة الماوس على المسرح الماوس ووضع المرحلة على بقية الذقن من المصباح الشقي.
- تشغيل المصباح الشقي إلى أدنى سطوع الضوء وتحقق درجة من الحدقة تمدد. إذا لم يتم المتوسعة التلميذ بشكل كاف (حوالي 2.5-3 مم)، والعودة الماوس للحيوان أكثر دفئا والانتظار. بدلا من ذلك، تدير آخر قطرة من تروبيكاميد. مرة واحدة العين المتوسعة بما فيه الكفاية، والمضي قدما لإجراء الليزر.
3. إجراء الليزر
ملاحظة: تأكد ع الآخرersons في غرفة ارتداء نظارات واقية عندما تكون بعيدا عن محمية الليزر المصباح الشقي العين قطعة
- ضبط وضع الماوس على مرحلة الماوس، بحيث يتم وضع مثالي لرؤية العصب البصري (انظر 3.1.2).
- توجيه الماوس على صاحبها لذلك تقع أفقيا، عموديا على شق شعاع مصباح، مع رئيس في جانب واحد والذيل في الطرف الآخر. ووضع الماوس المثالي جعل البصري التصور الأعصاب أسهل بكثير بمجرد تطبيق زلة تغطية.
- تحويل قليلا الماوس لذلك هو في ~ 170 درجة زاوية مع رئيس أقرب إلى مشغل الليزر.
- تأكد من أن الفأر هو أقرب ما يكون إلى شق مصباح، ومع ذلك لا يزال في وضع يمكنها من حيث أنها مستقرة وأين سوف يد المشغل لديها مساحة كافية للتلاعب على ما يرام.
- بعد وضع الماوس بشكل مثالي، وضع قطرة واحدة من حل مصطنعة المسيل للدموع على 25 ملم × 25 ملم الزجاج ساترة.
- وضع قطرة واحدة من حل مصطنعة المسيل للدموع على مقابل الفأرالعين osite - ورطب هذا سيضمن العين وتشكيل مساعدة تأخير إعتام عدسة العين.
- عقد الزاوية ساترة بين الإبهام والأصابع مؤشر. موقف بحيث يتم ضغط الزجاج بين نصائح كل من الأصابع.
- بلطف التفاف ثلاثة أصابع المتبقية حول جسم الحيوان لدعم وتثبيت اليد. موقف اليد بحيث ساترة الزجاج يمكن وضعها بسهولة على العين الفأر.
- مما لا شك فيه أن المعصم يستقر على سطح ثابت من أجل الحد من ناحية الزلزال.
- مرة واحدة يتم الحصول على وضع مستقر، اضغط بعناية ساترة الزجاج (مع قطرة المسيل للدموع مصطنعة لا يزال الالتزام) على العين الفأر.
- تأكد من وضع ساترة كما عمودي ممكن لشعاع الليزر لمنع شعاع الليزر مبعثر أو التأمل. تعمل ساترة كما العدسات اللاصقة لشد القرنية.
- ننظر من خلال المصباح الشقي ومع يد التركيز تبديل الاتحاد الوطني للعماليمكن تصور الشبكية ايل. سوف الشبكية لديها ضوء أصفر / أحمر اللون اعتمادا على الموقع تصور، ومتميزة، والسفن الحمراء تكون مرئية.
- ببطء وبعناية التلاعب رئيس الماوس و / أو ساترة حتى تصور العصب البصري. والعصب البصري يكون أصفر اللون مع سفن متعددة يشع منه.
- مرة واحدة وقد أكد مشغل التصور من العصب البصري، بدوره على الليزر التركيز شعاع.
- مرة واحدة وقد تحولت شعاع الليزر على، والمناورة ليزر تركز شعاع إلى الموضع المطلوب (حوالي 1 قرص قطره من العصب البصري).
- تركيز شعاع الليزر على RPE من قاع العين. ويتحقق الخشوع عن طريق الحصول على أشد وأوضح شعاع الليزر. إذا تهدف شعاع يبدو بيضاوي أو خارج التركيز، تبديل التركيز المصباح الشقي أو إعادة الموقف من الزجاج ساترة.
- بمجرد تركز شعاع تهدف على RPE، والشروع في إدارة يزر باستخدام الزناد القدم الليزر.
- تأكد من تجنب الأوعية الشبكية لمنع بالعين انهmorrhage.
- مشاهدة لظهور فقاعة على الفور بعد تناوله ليزر. يجب أن تكون الخطوط العريضة للطلقة ليزر واضحة وليس ضبابي بأي شكل من الأشكال.
- إذا لم يكن نتيجة اطلاق النار ليزر في تشكيل فقاعة، أو مجال تأثير تبدو ضبابية (ظهور غائم مع غير واضحة الحدود الدائري مقابل واضح، حدود محددة تماما من تأثير ناجح)، أو إذا كان ينظر إلى نزيف بعد تناوله ليزر، لا وتشمل هذه الآفات لتحليل المستقبل.
- كرر الخطوات 3،10-3،12 لجميع المواقف المطلوبة CNV (عادة في 3 و 6 و 9 و 12 وظيفة الساعة حول العصب البصري). إذا تم تطبيق الحث الليزر على نفس المسافة تقريبا من العصب البصري، وينبغي ألا يكون من الضروري إعادة التركيز. ولكن نظرا لانحناء قوي للعين الماوس والاختلافات الصغيرة التي قد تكون موجودة في شبكية العين، إعادة تركيز شعاع قد يكون من الضروري بين الإدارات الليزر متتالية.
- سجل في دفتر الموقع ونتيجة لهإدارة منظمة العمل ضد الجوع طلقة ليزر ونتيجة (ناجحة، ضبابي، والنزف، الخ.) من كل طلقة تدار للعين. تأكد من وضع الليزر في وضع الاستعداد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
- كرر 3،1-3،14 عن الماوس، العين الأخرى، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام الجانب المعاكس لتحقيق الاستقرار وساترة جديدة.
- بعد تدار عن طلقات الليزر المطلوب، إيقاف الليزر وطولية مصباح.
- تجاهل ساترة ومكان الماوس على أكثر دفئا للتعافي من التخدير. ظاهريا فحص العين عن أي ضرر ووضع قطرة من محلول المسيل للدموع اصطناعية للحفاظ على العين رطبة وربما منع تطور الساد في المستقبل. عند انتعاش الماوس من التخدير، والعودة إلى القفص.
| AVERTIN | AVERTIN | AVERTIN | XYL / KET | XYL / KET | |
| الماوس الوزن (ز) | جرعة (ملغ / كغ) | التخدير جرعة (مل) | جرعة (ملغ / كغ) | التخدير جرعة (مل) | |
| 15 | 250 | 20 | 0.1875 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.15 |
| 16 | 250 | 20 | 0.2 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.16 |
| 17 | 250 | 20 | 0.2125 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.17 |
| 18 | 250 | 20 | 0،225 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.18 |
| 19 | 250 | 20 | 0.2375 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.19 |
| 20 | 250 | 20 | 0.25 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.2 |
| 21 | 250 | 20 | 0.2625 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.21 |
| 22 | 250 | 20 | 0.275 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.22 |
| 23 | 250 | 20 | 0.2875 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.23 |
| 24 | 250 | 20 | 0.3 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.24 |
| 25 | 250 | 20 | 0.3125 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.25 |
| 26 | 250 | 20 | 0،325 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.26 |
| 27 | 250 | 0.3375 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.27 | |
| 28 | 250 | 20 | 0.35 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.28 |
| 29 | 250 | 20 | 0.3625 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.29 |
| 30 | 250 | 20 | 0.375 | 100 ملغ / كغ الكيتامين. 10 ملغم / كغم من زيلازين | 0.3 |
الجدول 1: XyIKet الجرعة الرسم البياني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الكمي للآفات CNV لا يمكن أن يؤديها من خلال تحليل choroids مسطحة شنت باستخدام المناعي تلطيخ لتسمية السفن CNV. طريقتين يعملون في معظم الأحيان من إعداد الأنسجة هي العلامات FITC-ديكستران، يتم عن طريق نضح فورا قبل التضحية بالحيوانات، أو بعد الوفاة المناعية تلطيخ مع علامة الخلية البطانية. كل من هذه الأساليب قد تم وصفها سابقا بالتفصيل 13،14،21، أرقام 1 و 2 عرض أمثلة لكل منهما، على التوالي. بعد متحد البؤر اقتناء صورة مجهرية، إما المنطقة (2-الأبعاد) أو وحدة التخزين (3-الأبعاد) يمكن حساب وتصور مع برنامج يماغيج أو Volocity. بالإضافة إلى القياس الكمي، أكتوبر التصوير يمكن استخدامها لتصور الآفة CNV في الجسم الحي. ويرد مثال لصورة مقطعية للشبكية العين مع الناتجة CNV في الشكل (3).
LT = "الشكل 1" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 53502 / 53502fig1.jpg" />
الشكل 1: CNV الإرواء تلطيخ والمنطقة (2D) حساب مثال (25X) (A) FITC ديكستران perfused CNV الآفة. (B) منطقة يماغيج طريقة الكمي عبر العتبة. الماوس الانفعال: C57BL / 6J الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: CNV المناعية وحجم (3D) مثال حساب (25X) (A) Isolectin GS-IB4 الملون CNV الآفة. (B) إعادة الإعمار 3D من CNV الآفة أون عرض الوجه. (C) إعادة الإعمار 3D عرض الجانب (B و C عرض البلاط واحد = 35 ميكرون). الماوس الانفعال: C57BL / 6J.g2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): أكتوبر مستعرضة CNV التصور (A) أكتوبر أون رأي مواجهة CNV الآفة. (B) أكتوبر مستعرضة B-فحص شبكية العين مع CNV دائري باللون الأصفر. الماوس الانفعال: C57BL / 6J الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك عوامل متعددة يمكن أن تؤثر على تسليم الليزر والناتجة عن تطوير الآفة CNV بعد نجاح الليزر الاستقراء. يجب السيطرة على هذه العوامل لوموحدة من أجل الحصول على النتائج الأكثر موثوقية. والأكثر أهمية من هذه العوامل هي اختيار الماوس (النمط الجيني والعمر والجنس)، واختيار مخدر، وضبط الليزر.
يمكن للنموذج الفأر المحددة المستخدمة لها تأثير كبير على مسار التنمية CNV. التركيب الوراثي الأكثر استخداما هو الماوس C57BL / 6. البائع الذي يتم الحصول على الحيوانات يمكن أن تؤثر على حجم CNV الناتجة. الفقراء وآخرون. أظهرت اختلافات كبيرة في النهائي CNV حجم الآفة في C57BL / 6 الفئران من جاكسون، تشارلز ريفرز، والمختبرات [تكنيك]، مع الفئران من تاكونيك النامية أكبر بكثير CNV من الأخريين الباعة 4. ولذلك، فإن شراء من شركة واحدة واستخدام كل الفئران من أن البائع نفسه تساعد على تقليل الفروق الخارجيةفي CNV حجم الآفة. وقد تبين أيضا العمر والجنس من الماوس ليكون عاملا هاما في الاعتبار عند تصميم التجربة. إناث الفئران تطوير المزيد من CNV من الفئران الذكور من نفس الفئة العمرية، والفئران الأكبر سنا من كلا الجنسين تطوير المزيد من CNV من الفئران الشابة 22،23. اعتمادا على المعلمات التجريبية، يجب على المشغلين إبقاء هذه العوامل في الاعتبار. على سبيل المثال، إذا مشغلي يستخدمون إجراء الليزر CNV لتوضيح أغراض الميكانيكية وتطوير الأدوية، كلا الجنسين في مختلف الأعمار ينبغي أن تستخدم لتحديد آليات التي تخص الجنسين وتلك التي ليست كذلك.
التخدير الصحيح هو خطوة حاسمة لهذا الإجراء، وخصوصا خلال عملية التعلم. يمكن لمعظم الأنظمة المعتمدة IACUC لحث التخدير مدة 15-30 دقيقة على الأقل، وهو ما يزيد على ما يكفي من الوقت لتسليم 4-5 طلقات الليزر لكل عين بمجرد يتقن هذا الإجراء. ومع ذلك، إذا الكثير من الوقت المنقضي، يمكن التخدير يؤدي إلى عكس عتامة العدسة، وإعادةndering العين منيع بصريا لالتجريبي CNV 24. وبروتوكولين الرئيسية المستخدمة للحث على التخدير هي زيلازين / الكيتامين كوكتيل أو ثلاثي بروم إيثانول (TBE) تسليم البريتونى. على الرغم من أن بعض التقارير يفترض مزايا TBE إلى زيلازين / الكيتامين من حيث تشكيل إعتام عدسة العين، وكلاهما يؤدي في نهاية المطاف في تطوير عدسة غائم إذا كان المشغل لا يعمل بسرعة 14. طريقة واحدة لتمديد الوقت قبل تطور الساد هو للحفاظ على الماء من العين، كما هو مذكور في بروتوكول مفصلة، من خلال تطبيق الدموع الاصطناعية 25. هذا الأسلوب، بغض النظر عن مادة التخدير المستخدمة، يجب أن تساعد تأخير تشكيل إعتام عدسة العين وتعطي المشغل مزيد من الوقت لاستكمال الإجراءات.
ضبط الليزر يمكن أن يكون عاملا رئيسيا في الحث موثوق للCNV. معايرة قوة الليزر ومدتها هي خطوة أولية هامة قبل إجراء الإجراء على حيوانات التجارب. طلقات الليزرينبغي استبعاد أن سبب النزف أو خارج التركيز دون تشكيل فقاعة من الحساب، لأن هذا يعطل عملية التنمية CNV. إذا تمزق الأوعية متعددة مما تسبب في نزيف منتشر، ينبغي استبعاد العين بأكملها. من الناحية المثالية، يجب استخدام أقل قوة وأقصر مدة الليزر التي تتمزق باستمرار غشاء بروك مما تسبب في تكوين فقاعة وآفة مع تحديد واضح 4. وقد أثبتت تجارب بروتوكولات مع إعدادات الطاقة المختلفة التي زادت قوة ومدة تؤدي إلى تلف الأنسجة المفرط وانخفاض معدلات في وقت لاحق من تشكيل CNV 4، 14،17. وعلاوة على ذلك، يمكن للموقع إصابة الليزر تؤثر أيضا على تطوير CNV. الآثار تسليم ما يقرب من 1 قرص قطره (DD) من القرص الضوئية أسفرت عن مساحة أكبر بشكل ملحوظ كميات CNV من تلك التي القيت <1 DD أو 2 أو أكثر من DDS بعيدا 23. اعتمادا على تحليل ما بعد الليزر، موقع الآفة قد تكون أو لا تكون حاسمة. على سبيل المثال،إذا كانت الصورة أكتوبر هي التي يمكن الحصول عليها من جميع الآفات، بموقع مركزي حول العصب البصري هو أمر حيوي. على النقيض من ذلك، إذا الآفات هي لتحليلها عبر شقة جبل، موقع الآفة ليس حاسما كما. وأخيرا، ضمان عدم وضعها أن الطلقات الأخيرة قريبة جدا من بعضها البعض وإلا قد اثنين من الآفات "تنمو" معا.
مقايسة CNV هو وسيلة قوية لدراسة تجريبيا حديث التوعي AMD. في الأوعية الدموية الناجمة عن تحريض ليزر مماثل في الموقع والمظهر العام للتكوين الأوعية الدموية التي لوحظت في مرضى AMD البشري. ومع ذلك، فإنه لا يزال بعيدا عن نموذج مثالي. وخلافا للعين البشرية، الفئران لم يكن لديك البقعة المحددة، والأوعية الدموية المرتبطة بالإصابة الحاد ينظر في CNV نموذج الليزر التي يسببها يختلف جوهريا عن تتأثر وراثيا، علم الأمراض المزمنة من AMD 7،8،14. البيئة الشبكية الماوس هو صحي ويحدث في الأوعية الدموية الناتجة كرد فعل على الصدمة الناجمة عن تأثير الليزر بدلا من راثية / هالعوامل nvironmental والعمر، كما هو الحال في AMD البشري. على النقيض من والبيئة الشبكية الإنسان في AMD في حالة الالتهاب المزمن، وخلالها شذوذ في التعبير VEGF والسيتوكينات الأخرى سبب CNV 3. بوضوح، وتطوير التوعية المستحدثة في هذه البيئات اثنين تختلف بشكل ملحوظ.
في الختام، بروتوكول CNV الليزر التي يسببها واحد هو أن من الصعب في البداية لأداء ولكن مجزية في نهاية المطاف لسيده. البراعة غرامة اللازمة لعقد الماوس وساترة، وكذلك التلاعب في ساترة والفأر رئيس لتصور العصب البصري هي التمارين التي تتطلب الصبر والممارسة، لا سيما وأنها تحتاج إلى أداء جيدا باستخدام اليدين من المشغل. ومع ذلك، مرة واحدة وعلم وتقنية يمكن أن يكون وسيلة فعالة لتنفيذ تجريبي CNV ويمكن تطبيقها على معظم جوانب البحوث AMD التوعية المستحدثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% Tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 G insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L.
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Poor, S. H., et al. Reliability of the Mouse Model of Choroidal Neovascularization Induced by Laser Photocoagulation. IOVS. 55, 6525-6534 (2014).
- Ryan, S. J. The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc. 77, 707-745 (1979).
- Miller, H., Miller, B., Ishibashi, T., Ryan, S. J. Pathogenesis of laser induced choroidal subretinal neovascularization. IOVS. 31, 899-908 (1990).
- Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molr Aspects Mede. 33, 487-509 (2012).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal Models of Choroidal and Retinal Neovascularization. Prog Retin Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Zeiss, C. J. REVIEW PAPER: Animals as Models of Age Related Macular Degeneration An Imperfect Measure of the Truth. Vet Pathol Online. 47, 396-413 (2010).
- Tobe, T., et al. Targeted Disruption of the FGF2 Gene Does Not Prevent Choroidal Neovascularization in a Murine Model. Am J Pathol. 153, 1641-1646 (1998).
- He, L., Marneros, A. G. Macrophages Are Essential for the Early Wound Healing Response and the Formation of a Fibrovascular Scar. Am J Pathol. 182, 2407-2417 (2013).
- Hoerster, R., et al. In vivo and ex vivo characterization of laser induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Jawad, S., et al. The Role of Macrophage Class A Scavenger Receptors in a Laser Induced Murine Choroidal Neovascularization Model. IOVS. 54, 5959-5970 (2013).
- Lambert, V., et al. Laser induced choroidal neovascularization model to study age related macular degeneration in mice. Nat Protocols. 8, 2197-2211 (2013).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage Depletion Inhibits Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3578-3585 (2003).
- Espinosa Heidmann, D. G., et al. Macrophage Depletion Diminishes Lesion Size and Severity in Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 44, 3586-3592 (2003).
- Giani, A., et al. In Vivo Evaluation of Laser Induced Choroidal Neovascularization Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. IOVS. 52, 3880-3887 (2011).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF Is Major Stimulator in Model of Choroidal Neovascularization. IOVS. 41, 3158-3164 (2000).
- Reich, S. J., et al. Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molr Vis. 9, 210-216 (2003).
- Baffi, J., Byrnes, G., Chan, C. C., Csaky, K. G. Choroidal Neovascularization in the Rat Induced by Adenovirus Mediated Expression of Vascular Endothelial Growth Factor. IOVS. 41, 3582-3589 (2000).
- Claybon, A., Bishop, A. J. R. Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium. JoVE. , 2563 (2011).
- Espinosa-Heidmann, D. G., et al. Age as an Independent Risk Factor for Severity of Experimental Choroidal Neovascularization. IOVS. 43, 1567-1573 (2002).
- Zhu, Y., et al. Improvement and Optimization of Standards for a Preclinical Animal Test Model of Laser Induced Choroidal Neovascularization. PLoS ONE. 9, e94743 (2014).
- Weinstock, M., Stewart, H. C. Occurrence in rodents of reversible drug induced opacities of the lens. British J Ophthalmol. 45, 408-414 (1961).
- Ridder III, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of Cataract Development in Anesthetized Mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
