Introduction
उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) 50 1-3 वर्ष की आयु से अधिक व्यक्तियों में अंधापन के प्रमुख कारणों में से एक है। एएमडी दो रूपों में वर्गीकृत किया जा सकता है: एट्रोफिक ("सूखी") एएमडी और neovascular ("गीले") एएमडी। पूर्व के बाद रिसाव, नकसीर, और फाइब्रोसिस के कारण बाहरी रेटिना परतों में रंजित से असामान्य वाहिकाओं के आक्रमण के द्वारा होती है, जबकि रेटिना वर्णक उपकला (RPE), रंजितपटलकोशिका, और फोटोरिसेप्टर की भौगोलिक शोष के द्वारा होती है, और अंततः है अंधापन 1,2 के लिए अग्रणी। दो रूपों में से, neovascular एएमडी दृष्टि हानि 1 के बहुमत के लिए खातों। इसकी एट्रोफिक समकक्ष वर्तमान में कोई चिकित्सा उपचार 3 साबित हो गया है, जबकि सौभाग्य से, इस फार्म, कई प्रभावी औषधीय प्रबंधन विकल्प है। Neovascular रूप में आसानी से एक पशु मॉडल में फिर से एकदम किया गया है, क्योंकि इसके अलावा, यह एक बुनियादी के लिए और अधिक व्यापक रूप से सुलभ कर दिया गया हैउपन्यास के उपचारों 4 विकसित करने के लिए अंतर्निहित रोग तंत्र की खोज के प्रबंध निदेशक अनुसंधान।
प्रयोगात्मक choroidal neovascularization (CNV) के पहले पशु मॉडल रयान एट अल द्वारा विकसित किया गया था। गैर मानव प्राइमेट 5 में। Neovascular एएमडी में देखा है कि इसी एन्जियोजिनेसिस में जिसके परिणामस्वरूप एक स्थानीय सूजन प्रतिक्रिया के कारण होता है जो लेजर फोटोकोगुलेशन के माध्यम से तोड़कर की झिल्ली का यह मॉडल प्रेरित टूटना,। angiogenesis के बाद लेजर प्रेरण की histopathological प्रगति मॉडल की वैधता 6 की पुष्टि की है, जो neovascular एएमडी, नकल करने के लिए पाया गया था। गैर मानव प्राइमेट मनुष्य के लिए सबसे समान शरीर रचना प्रस्तुत करते हैं, लेकिन दुर्भाग्य से, आसानी से आनुवंशिक छेड़छाड़ नहीं की जा सकती, बनाए रखने के लिए महंगे हैं, और रोग प्रगति 7 की एक धीमी गति से समय पाठ्यक्रम है। इसके विपरित्त कृंतक मॉडल में बहुत अधिक लागत प्रभावी बनाए रखने के लिए, आनुवंशिक रूप से रिश्तेदार आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती हैं, और cou के तेजी से एक ज्यादा हैरोग प्रगति की RSE (प्रयोगों महीने की तुलना में सप्ताह के समय के पैमाने पर आयोजित किया जा सकता है)। यह सूरजमुखी मनुष्य जानवरों में कल्पना करने के लिए बहुत मुश्किल है के रूप में इन प्रयोगों केवल पिगमेंटड कृन्तकों में आयोजित किया जाना चाहिए।
पहले देर से 90 के 10 में Campochiaro समूह द्वारा विकसित माउस लेजर प्रेरित CNV मॉडल है, हाल के अध्ययनों से 11-16 के बहुमत में प्रमुख पशु मॉडल हो हो गया है। कारण CNV के जटिल और अभी भी स्पष्ट नहीं रोगजनन, लेजर मॉडल भविष्य में मानव उपयोग के लिए नए उपचार के तौर-तरीकों का मूल्यांकन करने के लिए एंजियोजिनेसिस ड्राइविंग आणविक तंत्र के अध्ययन से लेकर गीला एएमडी अनुसंधान के सभी पहलुओं में लागू किया गया है। उदाहरण के लिए, Sakurai एट अल। और एस्पीनोसा-Heidmann एट अल। ट्रांसजेनिक चूहों और औषधीय कमी उपचार 15, 16 का उपयोग CNV के विकास पर मैक्रोफेज के प्रभाव की जांच करने के लिए लेजर मॉडल का इस्तेमाल किया। ज्ञानी एट अल। और Hoerster एट अल। छवि के लिए इस्तेमाल ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) लेजर प्रेरित CNV की प्रगति विशेषताएँ और अक्टूबर इमेजिंग 12,17 पर देखा निष्कर्षों के histopathologic निष्कर्षों की तुलना करने के प्रयास में CNV। अंत में, विरोधी वाहिकाजनक एजेंटों की intravitreal इंजेक्शन शामिल अध्ययन के लिए मानव परीक्षण के लिए पूर्वापेक्षा के रूप में इस्तेमाल किया और neovascular एएमडी आज 10,18,19 के प्रबंधन में इस्तेमाल किया विरोधी वीईजीएफ़ एजेंटों की पहली पीढ़ी के विकास में महत्वपूर्ण थे गया है।
प्रयोगात्मक CNV के लिए वैकल्पिक मॉडल CNV प्रेरित करने के लिए शल्य चिकित्सा पद्धतियों का उपयोग। यह प्रक्रिया समर्थक वाहिकाजनक पदार्थों इंजेक्शन शामिल (वीईजीएफ़ overexpressing जैसे पुनः संयोजक वायरल वैक्टर, RPE कोशिकाओं और / या polystyrene मोतियों की subretinal इंजेक्शन) एंजियोजिनेसिस 8,20 के कारण के लक्ष्य के साथ, neovascular एएमडी में देखा वृद्धि हुई वीईजीएफ़ अभिव्यक्ति की नकल करने के लिए। हालांकि, इस पद्धति neovascularization की एक काफी कम भार पैदावार; इन अध्ययनों में पता चला है कि CNVC57 / BL6 चूहों 8,14 से ही तनाव में लेजर फोटोकोगुलेशन विधि में देखा ~ 70% सफलता दर की तुलना में इंजेक्शन के 31% में होता है। इन कारणों के लिए, और गैर मानव प्राइमेट बनाम कृंतकों का उपयोग करने का लाभ दिया, लेजर प्रेरित CNV के माउस मॉडल सबसे neovascular एएमडी अध्ययन प्रयोगों 8 के लिए CNV के मानक पशु मॉडल बन गया है।
माउस आँख के साथ काम करने के लिए एक miniscule, नाजुक ऊतक है। रेटिना कल्पना करने के लिए आंख की चालों मुश्किल है और महारत हासिल की है, जब तक बहुत अभ्यास की आवश्यकता है। इस काम के लिए यह प्रमुख और गैर प्रमुख हाथ से सीखा जाना चाहिए कि इस तथ्य से जटिल है। रेटिना कल्पना करने के लिए आवश्यक ठीक आंदोलनों सीखा गया है के बाद इसके अलावा, दोनों हाथ और लेजर ऑपरेटिंग पैर पेडल के बीच समन्वय महत्वपूर्ण हैं। इस पत्र में, हम लेजर प्रेरित CNV proc में शामिल शारीरिक जोड़तोड़ की सब सीखने की चुनौतियों गढ़ने की मांग कीऑपरेटरों को इस मॉडल के साथ तेजी से सफलता प्राप्त करने में मदद मिलेगी कि एक गाइड में edure।
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Protocol
सभी जानवरों को प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग 2013 संस्करण के लिए गाइड के अनुसार व्यवहार कर रहे हैं, विजन और नेत्र विज्ञान (ARVO) नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए वक्तव्य में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन, और संस्थागत पशु द्वारा अनुमोदित देखभाल और नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय के लिए उपयोग समिति।
नोट: निम्न प्रक्रिया एक ऑपरेटर के साथ पूरी तरह से किया जा सकता है; कार्यों के हिसाब से विभाजन के साथ हालांकि, इसे और अधिक कुशलता से दो ऑपरेटरों के साथ आयोजित किया जाता है।
1. लेजर और पूर्व लेजर स्टेशन तैयार
- यह आसानी से सुलभ हो सकता है, जहां लेजर और भट्ठा दीपक स्थिति। लेजर पर बारी करने के लिए निर्धारित मापदंडों पूर्व निर्धारित (जैसे 75 माइक्रोन स्थान आकार, 100 मेगावाट बिजली, 100 मिसे अवधि)।
चेतावनी: सुनिश्चित ऑपरेटर सभी पशु और लेजर सुरक्षा व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और प्रासंगिक लेजर सुरक्षा के संकेत प्रक्रिया कमरे के बाहर प्रदर्शित कर रहे हैं पहनता।- किसी भी प्रायोगिक पशुओं उपयोग करने से पहले, एक अंशांकन, गैर प्रायोगिक माउस का उपयोग आदर्श मानकों को लगता है। लेजर मापदंडों इस्तेमाल किया लेजर पर निर्भर करेगा। आदर्श मानकों को ठीक से ध्यान केंद्रित जब लगातार "बुलबुला" गठन का कारण बनता है कि सबसे कम लेजर शक्ति सेटिंग से परिभाषित कर रहे हैं। उचित "बुलबुला" गठन के साथ घाव के उदाहरण के लिए वीडियो देखें।
- संज्ञाहरण, गर्म पशु, ऊतक पोंछे, और सभी आई ड्रॉप (Tropicamide, tetracaine, और कृत्रिम आँसू) ऑपरेटर के लिए पहुंच के भीतर आसानी से कर रहे हैं ताकि पूर्व लेजर स्टेशन तैयार करें।
- उस जानवर को गर्म सुनिश्चित है संज्ञाहरण प्रेरित हाइपोथर्मिया से बचने के क्रम में पहला माउस में संवेदनाहारी इंजेक्शन लगाने से पहले तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) सही करने के लिए पहले से गरम।
- यह गर्मी बनाए रखने और लेजर प्रक्रिया शुरू होती है एक बार गर्म रह सकता है इसलिए गर्म पर माउस चरण रखें।
2. माउस संज्ञाहरण और पूर्व लेजर तैयारी
- सुई से पहलेसंज्ञाहरण हैैं, यह कोई विकृति या कार्निया स्पष्टता (जैसे मोतियाबिंद) कम हो जाना कि असामान्यताएं है सुनिश्चित करने के लिए macroscopically आंख का निरीक्षण किया।
- माउस वजन।
- रिकार्ड वजन, लिंग, और पशु आईडी नंबर।
- एक 20 ग्राम माउस के लिए 0.20 मिलीलीटर xylazine / ketamine कॉकटेल इंजेक्षन, वजन का उपयोग करना, संवेदनाहारी की उचित राशि की गणना, 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine या tribromoethanol 250 मिलीग्राम / किग्रा (जैसे 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine हाइड्रोक्लोराइड संस्था द्वारा दिए गए दिशा-निर्देशों के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा tribromoethanol की या 0.25 एमएल)। गणितीय त्रुटियों को कम करने के लिए 1 ग्राम की वेतन वृद्धि में वजन के प्रति पूर्व की गणना dosages के एक टेबल है।
- कूड़ा माउस और इंजेक्षन संवेदनाहारी intraperitoneally 2.4 चरण में गणना पर आधारित है।
- गर्म जानवर पर माउस रखें और माउस पूरी तरह से पैर की अंगुली चुटकी (लगभग 3-5 मिनट) के माध्यम से पेडल पलटा जाँच करके anesthetized है जब तक प्रतीक्षा करें।
- पोंछ एक ऊतक ऊपर रोल और aspirat को रोकने के लिए माउस के नाक क्षेत्र की रक्षातरल रोल बंद के आयन। रोल अपने पक्ष पर माउस और सामयिक संज्ञाहरण के लिए हर आंख में tetracaine हाइड्रोक्लोराइड की एक बूंद (लगभग 30 μl) जगह है। समाधान प्रभावी करने के लिए 2 मिनट रुको।
- Pupillary फैलाव के लिए सामयिक Tropicamide की एक बूंद के साथ दोहराएँ कदम 2.7। वैकल्पिक रूप से, फैलाव के लिए phenylephrine हाइड्रोक्लोराइड (2.5%) का उपयोग करें।
- समाधान प्रभावी करने के लिए 2 मिनट रुको; इस समय के दौरान गर्म पर जानवर रहते हैं।
- उचित समय बीत जाने के बाद, जल्दी से माउस के मंच पर माउस जगह है और भट्ठा दीपक की ठोड़ी बाकी पर मंच जगह है।
- सबसे कम प्रकाश चमक करने के लिए भट्ठा दीपक चालू करें और pupillary फैलाव की डिग्री की जांच। पुतली पर्याप्त रूप से (लगभग 2.5-3 मिमी) फैली हुई नहीं है, तो गर्म पशु करने के लिए माउस लौटने और प्रतीक्षा करें। वैकल्पिक रूप से, Tropicamide की एक बूंद प्रशासन। आंख पर्याप्त फैली हुई है एक बार, लेजर प्रक्रिया के लिए आगे बढ़ें।
3. लेजर प्रक्रिया
नोट: अन्य पी सुनिश्चित करेंersons कमरे में लेजर-संरक्षित भट्ठा दीपक आंख-टुकड़े से दूर जब सुरक्षात्मक काले चश्मे पहन
- यह आदर्श ऑप्टिक तंत्रिका के दृश्य (3.1.2 देखें) के लिए तैनात किया गया है ताकि, माउस के मंच पर माउस की नियुक्ति को समायोजित करें।
- यह क्षैतिज निहित है तो दूसरे में एक पक्ष में सिर और पूंछ के साथ, दीपक किरण भट्ठा सीधा करने के लिए अपनी धारक पर माउस पूरबी। आदर्श माउस प्लेसमेंट के कवर पर्ची लागू किया जाता है, एक बार बहुत आसान ऑप्टिक तंत्रिका दृश्य कर देगा।
- यह करीब लेजर ऑपरेटर के लिए सिर के साथ एक ~ 170 डिग्री के कोण पर है तो थोड़ा माउस की बारी है।
- यह स्थिर है और जहां ऑपरेटर के हाथ ठीक हेरफेर के लिए पर्याप्त जगह होगी, जहां एक की स्थिति में अभी भी दीपक भट्ठा, अभी तक के लिए संभव के रूप में है कि माउस के रूप में बंद है सुनिश्चित करें।
- माउस आदर्श स्थिति में है, के बाद एक 25 मिमी x 25 मिमी कांच coverslip पर कृत्रिम आंसू समाधान की एक बूंद जगह है।
- माउस के ऑप पर कृत्रिम आंसू समाधान की एक बूंद रखेंosite नेत्र - यह सुनिश्चित करेगा आंख हाइड्रेटेड और मदद देरी मोतियाबिंद गठन किया गया है।
- अंगूठे और उंगलियों के बीच सूचक coverslip के कोने पकड़; स्थिति तो यह है कि कांच दोनों उंगलियों के सुझावों के बीच निचोड़ा है।
- धीरे समर्थन और हाथ स्थिरीकरण के लिए पशु के शरीर के चारों ओर शेष तीन अंगुलियों लपेटो। स्थिति हाथ इतना है कि गिलास coverslip आसानी से माउस की आंखों पर रखा जा सकता है।
- कलाई हाथ कंपन को कम करने के क्रम में एक फर्म की सतह पर स्थिर है कि सुनिश्चित करें।
- स्थिर स्थिति प्राप्त है, एक बार ध्यान से माउस की आंख पर (अभी भी पालन कृत्रिम आंसू की बूंद के साथ) गिलास coverslip दबाएँ।
- Coverslip लेजर बीम बिखराव या प्रतिबिंब को रोकने के लिए लेजर बीम के लिए संभव के रूप में सीधा रूप में तैनात है सुनिश्चित करें। coverslip कॉर्निया समतल करने के लिए एक संपर्क लेंस के रूप में कार्य करता है।
- टॉगल UNT ध्यान केंद्रित भट्ठा दीपक के माध्यम से और मुक्त हाथ से देखोआईएल रेटिना देखे जा सकते हैं। रेटिना से कल्पना स्थान के आधार पर एक प्रकाश-पीला / लाल रंग होगा, अलग, लाल जहाजों दिखाई जाएगी।
- धीरे धीरे और सावधानी से ऑप्टिक तंत्रिका visualizing जब तक माउस सिर और / या coverslip हेरफेर। ऑप्टिक तंत्रिका यह से radiating कई जहाजों के साथ पीले रंग में हो जाएगा।
- ऑपरेटर ऑप्टिक तंत्रिका के दृश्य इस बात की पुष्टि हो जाने के बाद, बीम ध्यान केंद्रित लेजर मोड़ पर है।
- लेजर बीम पर निष्क्रिय कर दिया गया है, इच्छित स्थान के लिए (ऑप्टिक तंत्रिका से लगभग 1 डिस्क व्यास) बीम ध्यान केंद्रित लेजर छल।
- आँख बुध्न की RPE पर लेजर बीम ध्यान दें। उचित ध्यान तीव्र और स्पष्ट लेजर बीम होने से हासिल की है। किरण लक्ष्य भट्ठा दीपक ध्यान या फिर स्थिति गिलास coverslip टॉगल, अंडाकार या ध्यान से बाहर लग रहा है।
- लक्ष्य किरण RPE पर ध्यान केंद्रित किया है एक बार, लेजर के पैर ट्रिगर का उपयोग लेजर प्रशासन आरंभ करें।
- अंतःचाक्षुष को रोकने के लिए रेटिना जहाजों से बचने के लिए और यकीन है कि वहmorrhage।
- तुरंत लेजर प्रशासन के बाद एक बुलबुले की उपस्थिति के लिए देखें। लेजर शॉट की रूपरेखा स्पष्ट और किसी भी तरह से धुंधला नहीं होना चाहिए।
- लेजर शॉट बुलबुला गठन में परिणाम नहीं करता है, या प्रभाव के क्षेत्र (बनाम एक सफल प्रभाव से स्पष्ट है, तेजी से परिभाषित सीमा बीमार परिभाषित परिपत्र सीमा के साथ बदली उपस्थिति) धुंधला दिखता है, या नकसीर लेजर प्रशासन के बाद देखा जाता है, नहीं है भविष्य के विश्लेषण के लिए इन घावों में शामिल हैं।
- दोहराएँ सभी वांछित CNV पदों के लिए 3.10-3.12 (आमतौर पर 3, 6, 9, और ऑप्टिक तंत्रिका चारों ओर 12:00 पदों) कदम। लेजर inductions ऑप्टिक तंत्रिका से लगभग एक ही दूरी पर लागू कर रहे हैं, तो refocus आवश्यक नहीं होना चाहिए। बहरहाल, कारण, रेटिना में मौजूद हो सकता किरण को पुन: फोकस लगातार लेजर प्रशासन के बीच आवश्यक हो सकता है कि माउस आंख और छोटे बदलाव की मजबूत वक्रता के लिए।
- एक नोटबुक स्थान और ई के परिणाम में रिकार्डACH लेजर शॉट प्रशासन और परिणाम (सफल, धुंधला, नकसीर, आदि।) आंख के लिए प्रत्येक प्रशासित शॉट की। जब उपयोग में नहीं खड़ा करके मोड में लेजर जगह सुनिश्चित करें।
- अगर जरूरत स्थिरीकरण और एक नया coverslip के लिए सामने हाथ का उपयोग कर, माउस के अन्य आंख के लिए 3.1-3.14 दोहराएँ।
- सभी वांछित लेजर दृश्यों प्रशासित रहे हैं के बाद, लेजर बंद कर देते हैं और भट्ठा दीपक।
- संज्ञाहरण से वसूली के लिए वार्मर पर coverslip और जगह माउस त्यागें। Macroscopically किसी भी चोट के लिए आंख का निरीक्षण किया और हाइड्रेटेड नजर रखने और संभावित भविष्य के मोतियाबिंद के विकास को रोकने के लिए कृत्रिम आंसू समाधान की एक बूंद जगह है। माउस संज्ञाहरण से ठीक होने के बाद, पिंजरे में लौटने।
| Avertin | Avertin | Avertin | XYL / बाजार | XYL / बाजार | |
| माउस वजन (छ) | खुराक (मिलीग्राम / किग्रा) | संवेदनाहारी खुराक (एमएल) | खुराक (मिलीग्राम / किग्रा) | संवेदनाहारी खुराक (एमएल) | |
| 15 | 250 | 20 | 0.1875 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.15 |
| 16 | 250 | 20 | 0.2 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.16 |
| 17 | 250 | 20 | 0.2125 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.17 |
| 18 | 250 | 20 | 0.225 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.18 |
| 19 | 250 | 20 | 0.2375 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.19 |
| 20 | 250 | 20 | 0.25 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.2 |
| 21 | 250 | 20 | 0.2625 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.21 |
| 22 | 250 | 20 | 0.275 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.22 |
| 23 | 250 | 20 | 0.2875 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.23 |
| 24 | 250 | 20 | 0.3 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.24 |
| 25 | 250 | 20 | 0.3125 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.25 |
| 26 | 250 | 20 | 0.325 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.26 |
| 27 | 250 | 0.3375 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.27 | |
| 28 | 250 | 20 | 0.35 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.28 |
| 29 | 250 | 20 | 0.3625 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.29 |
| 30 | 250 | 20 | 0.375 | 100 मिलीग्राम / ketamine किलो; 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine | 0.3 |
तालिका 1: XyIKet खुराक चार्ट।
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Representative Results
CNV घावों की मात्रा CNV वाहिकाओं लेबल करने के लिए immunofluorescence धुंधला का उपयोग कर फ्लैट पर चढ़कर choroids के विश्लेषण के माध्यम से किया जा सकता है। ऊतक तैयारी के दो सबसे अधिक बार नियोजित तरीके तुरंत एक endothelial सेल मार्कर के साथ पशु बलि, या पोस्टमार्टम इम्युनो धुंधला से पहले छिड़काव के माध्यम से किया FITC-dextran लेबलिंग, कर रहे हैं। इन दोनों पद्धतियों के विस्तार 13,14,21 में पहले से वर्णित किया गया है; क्रमश: प्रत्येक की 1 और 2 शो उदाहरण आंकड़े। Confocal माइक्रोस्कोपी छवि अधिग्रहण, या तो क्षेत्र (2-आयाम) या मात्रा के बाद (3-आयाम) की गणना की जा सकती है और ImageJ सॉफ्टवेयर या Volocity साथ कल्पना। मात्रा का ठहराव के अलावा, अक्टूबर इमेजिंग विवो में CNV घाव कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परिणामी CNV के साथ रेटिना के एक क्रॉस अनुभागीय छवि का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है।
लेफ्टिनेंट = "चित्रा 1" src = "/ फ़ाइलें / ftp_upload / 53,502 / 53502fig1.jpg" />
चित्रा 1:। CNV छिड़काव धुंधला और क्षेत्र (2 डी) गणना उदाहरण (25X) (ए) FITC dextran CNV घाव भरकर रखा। Thresholding के माध्यम से (बी) ImageJ क्षेत्र मात्रा का ठहराव विधि। माउस तनाव:। C57BL / 6J यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: CNV Immunostaining और खंड (3 डी) गणना उदाहरण (25X) (ए) Isolectin जी एस IB4 दाग CNV घाव।। चेहरे दृश्य एन CNV घाव (बी) 3 डी पुनर्निर्माण। (सी) 3 डी पुनर्निर्माण पक्ष दृश्य (बी और सी के एक टाइल चौड़ाई = 35 माइक्रोन)। माउस तनाव: C57BL / 6J।g2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। अक्टूबर पार के अनुभागीय CNV विज़ुअलाइज़ेशन (ए) अक्टूबर CNV घाव के चेहरे को देखने एन। (बी) CNV साथ रेटिना के अक्टूबर पार के अनुभागीय बी-स्कैन पीले रंग में परिक्रमा की। माउस तनाव:। C57BL / 6J यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सफल लेजर शामिल होने के बाद लेजर वितरण और उसके एवज में CNV घाव विकास को प्रभावित कर सकता है कि कई कारक हैं। इन कारकों के लिए नियंत्रित और सबसे विश्वसनीय परिणाम के क्रम में मानकीकृत किया जाना चाहिए। इन कारकों में से सबसे उचित माउस चयन (जीनोटाइप, आयु, और सेक्स), संवेदनाहारी चयन, और लेजर सेटिंग कर रहे हैं।
इस्तेमाल विशिष्ट माउस मॉडल CNV विकास के पाठ्यक्रम पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जीनोटाइप C57BL 6 / माउस है। जानवरों प्राप्त कर रहे हैं, जिसमें से विक्रेता परिणामी CNV आकार को प्रभावित कर सकते हैं। गरीब एट अल। अन्य दो विक्रेताओं 4 की तुलना में काफी बड़ा CNV विकासशील Taconic से चूहों के साथ जैक्सन, चार्ल्स नदियों, और Taconic प्रयोगशालाओं से C57BL / 6 चूहों में अंतिम CNV घाव आकार में काफी अंतर, प्रदर्शन किया। इसलिए, एक कंपनी से खरीद और है कि एक ही विक्रेता से सभी चूहों का उपयोग बाहरी मतभेदों को कम करने में मदद मिलेगीCNV घाव आकार में। आयु और माउस के लिंग भी प्रयोग डिजाइन पर विचार जब एक महत्वपूर्ण कारक हो दिखाया गया है। मादा चूहों में एक ही उम्र के पुरुष चूहों की तुलना में अधिक CNV विकसित करने, और दोनों लिंगों के बड़े चूहों युवा चूहों 22,23 से अधिक CNV का विकास। प्रयोगात्मक मापदंडों पर निर्भर करता है, ऑपरेटरों के मन में इन कारकों रखना चाहिए। ऑपरेटरों यंत्रवत और नशीली दवाओं के विकास के उद्देश्यों को स्पष्ट करने के लिए लेजर-CNV प्रक्रिया का उपयोग कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, अलग अलग उम्र में दोनों लिंगों लिंगों और नहीं कर रहे हैं कि उन लोगों के लिए विशिष्ट हैं कि तंत्र को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
उचित संज्ञाहरण विशेष रूप से सीखने की प्रक्रिया के दौरान, इस प्रक्रिया के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। अधिकांश IACUC को मंजूरी दे दी परहेजों प्रक्रिया में महारत हासिल किया गया है, एक बार हर आंख को 4-5 लेजर शॉट देने के लिए पर्याप्त समय की तुलना में अधिक है, जो कम से कम 15-30 मिनट के लिए संज्ञाहरण प्रेरित कर सकते हैं। हालांकि, बहुत ज्यादा समय बीतता है, तो संज्ञाहरण प्रतिवर्ती लेंस अपारदर्शन, फिर से नेतृत्व करने के लिए कर सकते हैंप्रयोगात्मक CNV 24 के लिए ऑप्टिकली अभेद्य आंख ndering। संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया दो मुख्य प्रोटोकॉल एक xylazine / ketamine कॉकटेल या tribromoethanol (TBE) intraperitoneally वितरित कर रहे हैं। कुछ रिपोर्टों दोनों, मोतियाबिंद गठन के मामले में xylazine / ketamine को TBE के फायदे मंज़ूर हालांकि ऑपरेटर जल्दी 14 से काम नहीं करता है, तो अंत में एक बादल लेंस के विकास में परिणाम। मोतियाबिंद के विकास से पहले के समय का विस्तार करने के लिए एक तरह से कृत्रिम आँसू 25 के आवेदन के माध्यम से, विस्तृत प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, आंख के जलयोजन बनाए रखना है। इस विधि की परवाह किए बिना इस्तेमाल किया संवेदनाहारी पदार्थ की, मोतियाबिंद गठन में देरी की मदद और ऑपरेटर प्रक्रिया को पूरा करने के लिए अधिक समय देना चाहिए।
लेजर सेटिंग्स CNV के विश्वसनीय प्रेरण में एक प्रमुख कारक हो सकता है। औजार लेजर शक्ति और अवधि प्रायोगिक पशुओं पर प्रक्रिया के संचालन से पहले एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है। लेजर दृश्योंबुलबुला गठन बिना कारण है कि रक्तस्राव या ध्यान से बाहर हैं इस CNV विकास की प्रक्रिया बाधित, के रूप में गणना से बाहर रखा जाना चाहिए। कई जहाजों फैलाना रक्तस्राव के कारण उठी रहे हैं, तो पूरे आंख बाहर रखा जाना चाहिए। आदर्श रूप में, लगातार स्पष्ट सीमांकन के साथ बुलबुला गठन और एक घाव के कारण Bruch झिल्ली फट कि सबसे कम बिजली और लेजर की कम से कम अवधि 4 इस्तेमाल किया जाना चाहिए। विभिन्न शक्ति सेटिंग्स के साथ प्रयोग प्रोटोकॉल अत्यधिक ऊतकों को नुकसान और CNV गठन 4, 14,17 के बाद में कम ब्याज दर के लिए है कि वृद्धि की शक्ति और अवधि नेतृत्व का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, लेजर चोट का स्थान भी CNV विकास को प्रभावित कर सकते हैं। प्रभावों दूर 23 <1 डीडी या 2 या अधिक डीडी वितरित उन लोगों की तुलना में काफी बड़ा क्षेत्र CNV संस्करणों झुकेंगे ऑप्टिक डिस्क से लगभग 1 डिस्क व्यास (डीडी) को जन्म दिया। पोस्ट-लेजर विश्लेषण पर निर्भर करता है, घाव स्थान या महत्वपूर्ण नहीं हो सकता है। उदाहरण के लिए,एक अक्टूबर छवि सभी घावों के प्राप्त किया जा रहा है, ऑप्टिक तंत्रिका चारों ओर केंद्रीय स्थान महत्वपूर्ण है। घावों फ्लैट पर्वत के माध्यम से विश्लेषण किया जाए तो इसके विपरित्त, घाव स्थान के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है। अंत में, कि पिछले शॉट्स एक दूसरे के या किसी और दो घावों एक साथ "बढ़ने" हो सकता है के लिए भी बंद नहीं रखा जाता है सुनिश्चित करते हैं।
CNV परख प्रयोगात्मक neovascular एएमडी अध्ययन करने के लिए एक मजबूत विधि है। लेजर प्रेरण से उत्पन्न एंजियोजिनेसिस मानव एएमडी रोगियों में मनाया angiogenesis के लिए स्थान और समग्र रूप में समान है। हालांकि, यह अभी तक एक आदर्श मॉडल से है। मानव आँख के विपरीत, चूहों एक परिभाषित मैक्युला की जरूरत नहीं है, और लेजर प्रेरित CNV मॉडल में देखा गंभीर चोट से संबंधित एंजियोजिनेसिस मौलिक एएमडी 7,8,14 की आनुवंशिक रूप से प्रभावित किया है, जीर्ण विकृति से अलग है। माउस रेटिना पर्यावरण स्वस्थ है और उसके एवज में एंजियोजिनेसिस लेजर प्रभाव, बल्कि आनुवंशिक से / ई की वजह से आघात के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में होतामानव एएमडी के रूप में nvironmental कारकों और उम्र,। इसके विपरित्त एएमडी में मानव रेटिना पर्यावरण वीईजीएफ़ अभिव्यक्ति और CNV 3 कारण अन्य साइटोकिन्स में असामान्यताओं के दौरान जो जीर्ण सूजन के एक राज्य में है। जाहिर है, इन दोनों के वातावरण में neovascular विकास स्पष्ट रूप से अलग है।
अंत में, लेजर प्रेरित CNV प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए शुरू में मुश्किल है लेकिन गुरु के लिए अंततः पुरस्कृत है कि एक है। माउस और coverslip पकड़, साथ ही ऑप्टिक तंत्रिका कल्पना करने के लिए coverslip और माउस सिर में हेरफेर करने की जरूरत ठीक निपुणता वे ऑपरेटर के दोनों हाथों का उपयोग अच्छी तरह से प्रदर्शन करने की आवश्यकता है, खासकर के बाद से, धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता है कि अभ्यास कर रहे हैं। हालांकि, तकनीक सीखा है एक बार यह प्रयोगात्मक CNV को लागू करने के लिए एक कारगर तरीका हो सकता है और neovascular एएमडी अनुसंधान की सबसे पहलुओं को लागू किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532 nm (green) argon ophthalmic laser | IRIDEX | GLx | any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used |
| slit lamp | Carl Zeiss | 30SL-M | any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser |
| tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | used to make anesthetic |
| tert-amyl alcohol | Sigma | 152463-1L | used to make anesthetic |
| amber glass vials + septa | Wheaton | WH-223696 | tribromoethanol storage |
| tissue wipes | VWR | 82003-820 | miscellaneous |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | pupillary dilation |
| 0.5% Tetracaine hydrochloride | Alcon | 0065-0741-12 | topical anesthesia |
| artificial tears | Alcon | 58768-788-25 | hydration |
| heat therapy pump (for animal warming) | Kent Scientific | HTP-1500 | used to maintain animal body temp |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510EA | maintains animal body temperature |
| 30 G insulin needles | BD | 328418 | IP anesthesia injection |
| scale | American Weigh Scale | AWS-1KG-BLK | mouse weighing |
| cover slip (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | flatten cornea to visualize mouse retina |
| xylazine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| ketamine | obtained from institution | obtained from institution | anesthesia |
| Volocity | PerkinElmer | used for volumetric re-construction | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for image analysis |
References
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