Summary
Bøjesenerne i hånden er almindeligt såret, hvilket fører til nedsat håndfunktion. Imidlertid er arvæv healing svar ikke godt karakteriseret. En musemodel af flexor senen healing demonstreres her. Denne model kan forbedre den overordnede forståelse af helingsprocessen og vurdere terapeutiske metoder til at forbedre heling.
Abstract
Tendon forbinder skeletmuskulatur og knogler, lette bevægelse af næsten hele kroppen. I hånden, bøjesenerne (FTS) muliggøre fleksion af fingrene og generelle håndfunktion. Skader på FTS er fælles, og tilfredsstillende helbredelse er ofte forringet på grund af overskydende arvæv og sammenvoksninger mellem senen og omgivende væv. Men lidt om de molekylære og cellulære komponenter i FT reparation. Med henblik herpå en murin model for FT reparation, der rekapitulerer mange aspekter af heling hos mennesker, herunder nedsat vifte af bevægelse og nedsat mekaniske egenskaber, er blevet udviklet og beskrevet tidligere. Her en grundig demonstration af denne kirurgiske procedure er forudsat, der involverer overskæring og efterfølgende reparation af flexor digitorum longus (FDL) sene i murine bagpote. Denne teknik kan bruges til at foretage afstamning analyse af forskellige celletyper, vurdere virkningerne af gen-gevinst eller tab af funktion, og at teste effekticacy af farmakologiske indgreb i den helbredende proces. Der er dog to primære begrænsninger forbundet med denne model: i) FDL senen i midterdelen af den murine bagpote, hvor overskæring og reparation forekommer, ikke er omgivet af en seneskeden. denne model er derfor ikke højde for den potentielle bidrag kappen til ardannelse processen. ii) For at beskytte integriteten af reparationsstedet, er FT frigivet i myotendinous junction, begrænse den mekaniske kræfter senen, sandsynligvis bidrage til øget ardannelse. Isolering af tilstrækkelige celler fra granulationsvævet af FT under helingsprocessen for flowcytometrisk analyse har vist sig udfordrende; cytologi centrifugering for at koncentrere disse celler er en alternativ metode, der anvendes, og giver mulighed for generering af cellepræparater, hvor immunfluorescerende mærkning kan udføres. Med denne metode bliver kvantificering af celler eller proteiner af interesse under FT healing muligt.
Introduction
Flexor sener i hånden arbejde i koncert med flexor muskler i underarmen og digitale hylstre for at muliggøre bøjning af cifrene og gribe funktion af hånden. Bøjesenerne løber langs palmar aspekt af hånden; denne relativt overfladiske placering resulterer ofte i skader på flexor sener under traumer til hånden. Sener helbrede gennem en arvæv reaktion snarere end regenerering af normalt væv senen 1. Mens dette arvæv giver kontinuitet til senen, er funktionen faldt dramatisk i forhold til sund sene. Tendon-arvæv kompositter er kendetegnet ved svækkede mekaniske egenskaber 1, gør de reparerede sener mere tilbøjelige til at briste. Desuden mangler arvæv organiseringen af det native senecollagen fiberstruktur, hvilket resulterer i en stigning i senen størrelse og bulk. I betragtning af de anatomiske begrænsninger af senen-skede enhed, selv en beskeden stigning i senen størrelse kan drastisk rødUCE den glidende funktion af senen, og derfor ciffer vifte af bevægelse og håndfunktion.
Forud for 1960'erne skader flexor sener, især dem i zone II af hånden, blev ikke rutinemæssigt repareres på grund af de alvorlige komplikationer i healing, der opstod med disse reparationer 2. Dette område af hånden blev benævnt »ingenmandsland« 3. Imidlertid har forbedringer i kirurgiske teknikker, sutur mønstre og fysisk terapi rehabilitering protokoller dramatisk forbedret resultater af flexor senen reparation 2. På trods af disse fremskridt, op til 40% af reparationer resulterer i tilstrækkelig vedhæftning dannelse at hindre håndfunktion 4. Derfor er en biologisk tilgang for at forbedre heling. Desværre, meget lidt er kendt om senen helingsprocessen ved cellulære og molekylære niveau. Således var målet at udvikle en murin model, der kunne bruges til at forbedre den grundlæggende understanding af de cellulære og molekylære bestanddele af flexor seneheling og ardannelse respons, som et middel til at identificere hidtil ukendte terapeutiske mål at forbedre heling.
Større dyremodeller har været medvirkende til at fremme forståelse af flexor senen helingsprocessen. Hunde og kaniner undersøgelser har vist både indre og ydre healing evne bøjesenerne 5,6, betydningen af tidlig kontrolleret passiv bevægelse i minimering adhæsionsdannelse forhold til immobilisering 7, samt virkningerne af forskellige sutur mønstre på helingsprocessen 8 9. Desuden har hundemodellen været nyttigt i at teste translationelle vævsmanipulering strategier til forbedring healing 10. Der er imidlertid flere væsentlige fordele ved at anvende en musemodel i forhold til en stor dyremodel, herunder de relative omkostninger, tilgængelighed af murine specifikke reagenser, og den lethed generere global knock-outs eller vævsspecifikke sletning / overekspression konstruktioner. Endvidere er de funktionelle ligheder mellem mennesker og mus med hensyn til bøjesenerne 11 antyder potentiel anvendelighed i udviklingen af en murin model.
Udvikling af en musemodel af flexor senen overskæring og reparation efterligner mange aspekter af klinisk helbredelse, herunder dannelsen af rigelige arvæv og forringede mekaniske egenskaber. Den her beskrevne model er ikke en sand sammenfatning af klinisk praksis på grund af overskæring af FDL på myotendinous krydset for at beskytte reparationsstedet. Endvidere hindrer model ikke højde for bidraget fra seneskede celler til den helbredende reaktion, da der ikke er seneskeden dækker midterdelen af senen hvor reparationen forekommer. Trods disse begrænsninger, denne model har den fordel genererende vifte af bevægelse-begrænsende adhæsioner, der endnu ikke er påvist i murine modeller at flere Closely tilnærme den kliniske scenarium. Denne model er blevet anvendt til at vurdere knock-out musemodeller 12,13, og at teste forskellige farmakologiske metoder til forbedring healing 14-17. Histologiske analyser af denne model, ved hjælp af immunhistokemi og in situ hybridisering, kan tilvejebringe vigtig indsigt i til lokalisering af vigtige gener og proteiner under heling. Imidlertid histologi giver kun et tværsnit rumlig analyse og tillader ikke kvantificering hele væv. Flowcytometri repræsenterer en mere kvantitativ tilgang, men kun et meget begrænset antal celler kan isoleres fra den helbredende senen væv i musemodellen, og dette tal reduceres yderligere under fiksering, permeabilisering, og vasketrin. Tage dette i at konto, flowcytometri bliver en umulig tilgang på grund af antallet af dyr, der ville være påkrævet. En alternativ metode er nødvendig for at bevare de fleste af denne småcellet population med henblikTil yderligere karakterisering af milieu healing. Den anvendte metode til at opnå dette, er vist her, involverer koncentration af de isolerede celler via cytologi centrifugering på et objektglas, efterfulgt af immuncytokemi. I den foreliggende undersøgelse edu (5-ethynyl-2'-deoxyuridin, et thymidin-analog) inkorporering og efterfølgende mærkning blev anvendt til at bestemme den relative proliferativ tilstand af celler ved den helbredende site. Denne metode kan anvendes til at teste effektiviteten af farmakologiske behandlinger på celleproliferation, gen knock-out eller overekspression, eller til at identificere og kvantificere forskellige cellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Universitetet Komité for Dyrs Forskning ved University of Rochester godkendt alle dyreforsøg. Ti-12 uger gamle C57BL / 6J mus blev anvendt.
1. Forberedelse af dyr for Flexor sene kirurgi (~ 15 min)
- Autoklave kirurgiske instrumenter til at sterilisere, bære sterile handsker overalt, og opretholde en steril drift felt.
- Anesthetize mus via intraperitoneal injektion (ip) med et volumen af ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) svarende til legemsvægt. Bekræft sedationsdybde via fravær af tå-pinch refleks.
- Administrere forebyggende analgesi (buprenorphin, 0,05-0,1 mg / kg) via subkutan injektion. Påfør oftalmisk salve for at forhindre øjnene tørrer ud.
- Forbered operationsstedet ved klipning pelsen på hele bagben. Sterilisere huden ved at skrubbe sekventielt med povidoniod, efterfulgt af 70% ethanol, og igen med povidon-iod.
- Find flexor digitorum longus (FDL) sene, set overfladisk i mediale side af læggen. Ved hjælp af en skalpel, lave en lille 0,5-1 cm snit i huden med mikro-saks til at eksponere senen.
- Brug pincet til at adskille FDL senen fra omgivende væv og spore det op til myotendinous krydset. Skær senen på dette kryds med fjeder saks til at frigive det, idet man undgår den bageste tibial arterie.
- Luk huden med 5-0 nylonsuturer.
Bemærk: Den FDL overskæring og reparation (trin 2.4) skal udføres ved hjælp af et stereomikroskop. - Lav en 3 mm snit over posterolateral aspekt af bagpoten hjælp foråret mikro-saks. trække forsigtigt omgivende bløde væv og muskler med pincet, og sørg for at minimere vævsskade, og identificere FDL senen.
- hæve forsigtigt FDL senen og helt transektere det ved hjælp af miCro-saks. Sutur enderne af FDL senen sammen i en modificeret Kessler mønster med 8-0 suturer, undgå tørring af senen ved jævnligt at befugte den med saltvand.
- Udskift blødt væv og muskler i senen, og luk derefter snittet med 5-0 nylon suturer.
- Anbring mus på et dias varmere sæt til 37 ° C, for at opretholde kroppens temperatur, indtil udvundet fra anæstesi.
- Overvåg mus postoperativt for tegn på værdiforringelse eller infektion, herunder øget vocalizing og pjusket pels. Sprøjt buprenorphin (50 pl / mus) som smertestillende hver 12 timer, indtil mus viser ikke længere tegn på smerte eller lidelse.
- Tillad mus til at helbrede i en periode på 10 dage efter kirurgi, før du fortsætter til næste trin.
Bemærk: Celler kan høstes på ethvert tidspunkt-punkt efter kirurgi. Her bliver 10 dage valgt til disse repræsentative eksperimenter givet den relativt høje cellularitet af vævet på dette tidspunkt.
3. Labeling Cykling Cells (~ 10 min)
- Forbered edu (5-ethynyl-2'-deoxyuridin) opløsning (10 mg / ml i sterilt phosphat saltvand [PBS] + 1% dimethylsulfoxid [DMSO] for at øge opløseligheden).
- Injicere mus med 100 pi edu (50 mg / kg) via ip injektion 24 timer inden aflivning.
4. Harvest Celler til Cytologi Centrifugering (2,5 t, ~ 30 min Hands-on Time)
- Forbered 3 mg / ml collagenase I i PBS.
- Aflive mus via carbondioxid-kvælning ved en strømningshastighed på højst 3 l / min, og udfør cervikal dislokation som en sekundær foranstaltning.
- Find den reparerede sene hjælp trin 2.4 ovenfor, og isolere senevævet ved at skære omkring 2 mm på hver side af skaden site med mikro-saks.
- Hakkekød væv med skalpel i en petriskål med 1 ml 3 mg / ml collagenase, efterfulgt af passage blandingen gennem en 18 G nål adskillige gange for at bryde op vævet. Saml blandingen i et 1,5 ml centrifugerør. Fordøje senen væv i 1 time ved 37 ° C under omrystning.
- Spin væv ned (300 xg i 5 min), aspirat collagenase, derefter resuspenderes celler / væv med 500 pi 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS ved pipettering op og ned adskillige gange.
- Filter cellesuspension gennem en 70 um celle si for at fjerne snavs og store stykker af senen, og der er afsat i et 37 ° C inkubator.
- Placer senen væv til et andet 1,5 ml centrifugerør, og opdatere med 1 ml collagenase opløsning, pipettering op og ned for at blande.
- Inkuber væv yderligere en time ved 37 ° C under omrystning.
- Spin ned fordøjet senen væv (300 xg i 5 min), derefter resuspenderes i 500 pi 3% BSA i PBS ved pipettering op og ned adskillige gange.
- Filtrer cellesuspensionen gennem en 70 um cellefilter, blander med suspension isoleret i 4.3.3, derefter tælle celler med en hæmocytometer.
- Vask cellerne en gang mere med 3% BSA i PBS, derefter resuspenderes til 3-6x 10 4/100 gl.
- Vedhæft en cytologi tragt til en positivt ladet dias og lås på slide luftfartsselskab. Sæt hele apparatet i en cytologi centrifuge og tilsæt 100 pi cellesuspension til tragten. Centrifugeres ved 300 xg i 5 min til dispergering af cellerne på objektglasset.
5. Immuncytokemi at Detect Edu (2 timer, ~ 45 min Hands-on Time)
Bemærk: skal udføres Alle inkubationstrin i mørke for at begrænse fotoblegning af fluoroforer.
- Cirkel celler med en hydrofob barriere pen for at minimere opløsning nødvendig til at følge trin, derefter straks fix med 150 pi 3% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Vask to gange i 5 minutter med 150 pi 3% BSA i PBS.
- Permeabilisere celler med 0,5% Triton-X 100 i PBS 20 minutter ved stuetemperatur.
- Gentag vask trin som i 5.1.1.
- Forbered edu reaktion cocktail ifølge kit instruktioner højst 30 minutter før brug.
- Tilsæt 150 pi cocktail til hver slide, inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur.
- Gentag vask trin som i 5.1.1.
- Inkuber med 150 pi nukleare kontrastfarve Hoechst33342 fortyndet 1: 2.000 i PBS 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask to gange i 5 minutter med 150 pi 1x PBS.
- Tilføj 1-2 dråber anti-fade montering medium til celler, derefter langsomt lavere dækglas for at forhindre bobler.
- Tillad montering medium til at helbrede natten over i mørke ved stuetemperatur.
- Brug klar neglelak for at forsegle dækglasset til dias.
- Billede glider på 40X forstørrelse ved hjælp af en fluorescerende mikroskop udstyret med excitation / emission filtre stand til at detektere DAPI (Hoeschst33342) og Texas Red (Alexa Fluor 594).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flexor digitorum longus (FDL) muskel, beliggende i læggen, virker til at bøje cifrene i muse bagpote via flexor senen (skitseret i blåt i figur 1A, og vist histologisk i figur 2A), der løber proksimalt fra den myotendinous krydset og ender i de distale phalanges. I denne model af flexor senen healing er FDL senen transekteret og repareret på midten af foden, proksimalt til forgreningen på cifrene i bagpoten (røde pile, figur 1A). For at forhindre brud på reparation, der udelukker eksperimentel analyse, er senen (og tilstødende muskel) skæres, eller frigivet, på myotendinous krydset (gul pil i figur 1B, frigivelse vist i figur 1C). Mens dette trin er ikke repræsentativ for den kliniske scenarium er det kritisk at beskytte reparation ved faldende belastning på skadestedet. Figur 2Der et histologisk eksempel på en bristet flexor senen reparation, sammenlignet med en vellykket reparation vist i figur 2C. I sidstnævnte, granulationsvæv viser de stærkt forøget cellularitet sammenlignet med den skadede sener (figur 2B), og denne cellepopulation kan derefter analyseres yderligere via cytologi centrifugering på et objektglas efterfulgt af immunocytokemi. Figur 3 skitserer den eksperimentelle procedure, der anvendes til at evaluere den proliferative tilstand af cellerne opsamlet fra healing sener 10 dage efter reparation via edu inkorporering i nyligt syntetiseret DNA. Edu mærkning viser derfor kun de celler, der aktivt prolifererede i 24 timer, der følger efter edu impuls i levende mus, som det ses i figur 4. Kan derefter bestemmes en kvantitativ vurdering af proliferation i granulationsvævet af den helbredende senen ved point-tælling af hele cellen forberedelse. På denne måde, et udgangspunkt på proliferation kan etableres ved hvert tidspunkt, og ændringer som følge af genetiske eller farmakologiske indgreb kan vurderes.
Figur 1 :. Murint Hind Paw Anatomi og Identifikation af Flexor digitorum Longus senen. Flexor digitorum longus (FDL) bøjer cifrene i musen bagpote og løber langs palmar aspekt af bagpote (FDL skitseret i blåt), hvor det forgrener ind cifrene (røde pile) (figur 1A). Proximalt, at FDL senen løber gennem tarsal tunnel (sort pil), i læggen, slutter ved myotendinous krydset (gul pil) (figur 1B). Frigivelsen af senen ved myotendinous krydset for at forhindre brud er vist i figur 1C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Repræsentative Histologiske Billeder af Un-skadet, Normal Healing og bristet Flexor Tendon Reparationer anatomi FDL senen i den murine bagpote er vist i figur 2A. Scale bar betegner 1 mm. I figur 2B-D, er senen forstørret ved 8X at sammenligne uskadt tendo væv (figur 2B) til et intakt og bristede reparation (figur 2C & 2D henholdsvis). Hele bagpote prøver blev fikseret i neutral bufret formalin, indlejret i paraffin, skåret i til 3 um snit og farvet med Alcian blå / Hematoxylin / Orange G som tidligere beskrevet 13. Native senen er skitseret i blåt, er sene / granulationsvæv komposit skitseret i grøn og sort pile angiver suturer. Scale søjler repræsenterer 200 um. Please klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksperimentel Procedure for at udføre Edu Klik-det Kemi på Cell Forberedelser På dag 10 post-kirurgi healing FDL sener blev dissekeret fra mus bagpoterne.. Senerne blev hakket derefter fordøjet i to timer i collagenase I til dissociere cellerne. Cellesuspensionen blev anstrengt at fjerne snavs, og ~ 6 x 10 4 celler blev spundet til et monolag på positivt ladede objektglas under anvendelse af en cytologi centrifuge. Cellerne blev cirkel med en hydrofob barriere pen og derefter fast straks med paraformaldehyd. Efter permeabilisering med Triton X-100, blev cellerne behandlet med en edu detektion cocktail, og en click-kemi-reaktion bundet Alexa Fluor 594 til inkorporeret edu. Hoechst 33342 blev anvendt som en nuklear farvning, og cellerne wer e analyseret på 10-40X med et fluorescerende mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Immuncytokemi Analyse af Cycling Edu-mærkede celler under Flexor Tendon Healing Healing FDL sener blev høstet fra bagpoterne af mus 10 dage efter kirurgi og fordøjet med collagenase at opnå en celle suspension. Centrifugering blev anvendt til at dispergere disse celler til et monolag på objektglas, efterfulgt af immunocytokemi af billedet edu inkorporering. Figur 4A og 4B er billeder taget på 10X og 40X henholdsvis af cellerne efter immuncytokemisk analyse. Nuklear plet Hoechst 33342 er blå, og celler, der har inkorporeret Edu er oversået med rødt. Scale søjler repræsenterer 50 um.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiske procedure for en murin model for fuldstændig overskæring og reparation af flexor digitorum longus senen præsenteres i denne undersøgelse. Desuden en ny anvendelse af koncentrere små cellepopulationer med cytologi centrifuge er påvist, der giver mulighed for kvantitativ immunocytokemisk analyse af den cellulære miljø under flexor senen healing. Denne model af flexor senen reparation demonstrerer en reproducerbar helbredende reaktion, som kan anvendes til at vurdere ændringer i helingsprocessen ved hjælp knockout modeller eller med farmakologisk intervention. Efter operationen, en inflammatorisk reaktion begynder inden 24 timer, i løbet af hvilke celler rekrutteres til skaden websted og en callus af fibrøst væv begynder at danne. En proliferativ fase følger på omkring dag fire, der involverer stærkt forøget cellularitet og rigelige aflejring af uorganiseret ekstracellulære matrix ved reparation site, hvilket fører til dannelse af adhæsion mellem 14-21 dage. Tissue remodeling continues gennem dag 35, på hvilket tidspunkt kontinuitet og organisering af flexor senen er genoprettet, og cellularitet reduceres 18.
I øjeblikket er der adskillige murine modeller af flexor senen reparation foruden ene fremlagt her. Tsubone et al., Har beskrevet en in vitro model af flexor seneheling 19. Mens denne model kan vurdere ændringer i genekspression over tid, kan det ikke højde for rekruttering af ydre celler eller ændringer i den inflammatoriske / cytokin miljø, der opstår in vivo. In vivo, har to modeller af delvis overskæring blevet udviklet ved hjælp af enten incisional eller excisional defekter 20,21. For nylig Wong et al., Karakteriseret en område II model af flexor sene skade i en murin model 22. Dette er en vigtig udvikling, da det giver mulighed for bidrag seneskede-afledte celler til helingsprocessen skal defineres. Men ingen kvantificerbare, ændringer i glidende funktion er blevet beskrevet under anvendelse af denne model. Hver model har sine egne fordele og begrænsninger, der skal overvejes, herunder teknisk lethed, klinisk relevans og anatomi. En væsentligste begrænsning af den her beskrevne model er, at den helbredende senen kan briste før evaluering, som gør dem ubrugelige til yderligere analyse. Høst tilstrækkelige celler er lavet umuligt under disse omstændigheder, og enhver histokemisk analyse ikke er levedygtig, som en bristet senen ikke følger standarden helingsprocessen beskrevet ovenfor. Frigørelse af FDL senen proximalt for at mindske belastningen på den helbredende sene er derfor et kritisk trin til forebyggelse, til trods for at det ikke er klinisk relevant. Gennemførelse operationen ensidigt også sænker hastigheden af brud. En anden begrænsning er den manglende evne til at spore bidrag peri-tendinous kappe celler, som seneskeden ikke omgiver segmentet af FDL sene, der er såret i denne model.
jove_content "> En vigtig funktion af denne flexor senen reparation model er, at den muliggør en evaluering af cellerne ved den helbredende site. Immunofluorescens / immunhistokemi (IHC) er en almindelig biologisk teknik, der kan anvendes til at karakterisere disse celler. Mens IHC er unikt egnet til bestemmelse af geografisk information, er det i høj grad en kvalitativ metode. Ændringer i væv eller celler sammensætning i hele dybden af vævet kan blive savnet, og kvantificering af befolkninger er vanskelig. Flowcytometri repræsenterer en ideel tilgang til at definere, kvantificere og potentielt isolere celle populationer under heling. imidlertid isolerings- og fordøjelse af healing senen væv fra denne model udbytter meget lave celletal for flowcytometrisk analyse (1-2 x 10 5 i gennemsnit fra hver mus), og fiksering / permeabilisering trin, til påvisning af intracellulære markører reducerer dette antal yderligere. Brug af cytologi centrifugering for at koncentrere de isolerede celler, efterfulgt af immunocytocheMistry, giver en måde at karakterisere disse små cellepopulationer. En væsentlig fordel ved denne teknik er, at der ikke er behov for at samle prøver sammen for at opnå nok celler; derfor hver mus repræsenterer en individuel prøve til analyse. En vigtig overvejelse i at generere disse cellepræparater opretholder konsistens i vævet høstet til analyse. Omkringliggende muskler og fascia kan klæbe til granulationsvæv og skal omhyggeligt dissekeret væk. Da denne fremgangsmåde involverer minimal forarbejdning af cellerne før fiksering på objektglas, bevarer et flertal af isolerede celler til yderligere analyse. På denne måde kan næsten hele befolkningen i celler, der udgør adhæsion vævet på reparationsstedet kvantitativt vurderet via immuncytokemi. I den foreliggende undersøgelse er edu inkorporering af prolifererende celler anvendt til at demonstrere anvendelsen af denne cytologi teknik, kan det imidlertid også anvendes til mere komplekse og dybtgående karakterisering of de heterogene cellepopulationer involveret i flexor senen healing. Fremtidige anvendelser af denne teknik kan føre til mere i dybden karakterisering af cellepopulationer involveret i seneheling, da det giver mulighed for bestemmelse co-lokalisering af cellulære markører i cellerne associeret med granulationsvæv i healing senen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af American Society for Kirurgi af Hand Pilot Award og NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (til AEL) og NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
