Summary
Flexor Sehnen in der Hand sind häufig verletzt, zu einer Beeinträchtigung der Funktion der Hand führt. Allerdings ist die Narbengewebeheilungsreaktion nicht gut charakterisiert. Ein Mausmodell der Beugesehnenheilung wird hier demonstriert. Dieses Modell kann allgemeine Verständnis des Heilungsprozesses zu verbessern und therapeutische Ansätze zu bewerten, um die Heilung zu verbessern.
Abstract
Tendon verbindet der Skelettmuskulatur und Knochen, Bewegung fast den gesamten Körper zu erleichtern. In der Hand ermöglichen Beugesehnen (FTS) Beugung der Finger und die allgemeine Funktion der Hand. Verletzungen FTS sind häufig, und eine zufriedenstellende Heilung wird oft durch übermäßige Narbengewebe und Verwachsungen zwischen der Sehne und des umgebenden Gewebes beeinträchtigt. Es ist jedoch wenig über die molekularen und zellulären Bestandteile des FT Reparatur bekannt. Zu diesem Zweck ist ein murines Modell FT Reparatur, die viele Aspekte der Heilung beim Menschen, einschließlich gestörter Bewegungsbereich und verringerte mechanische Eigenschaften rekapituliert, entwickelt und oben beschrieben wurde. Hier eine eingehende Demonstration dieses chirurgischen Verfahrens ist vorgesehen, an denen transection und anschließende Reparatur des Flexor digitorum longus (FDL) Sehne im Maus-Hinterpfote. Diese Technik kann verwendet werden, lineage Analyse verschiedener Zelltypen zu führen, um die Auswirkungen von Gen-Gewinn oder Verlust-of-Funktion zu bewerten und die Effi zu testensamkeit von pharmakologischen Interventionen in den Heilungsprozess. Allerdings gibt es zwei primäre Einschränkungen zu diesem Modell: i) die FDL-Sehne im mittleren Teil des murinen Hinterpfote, wo der Durchtrennung und Reparatur auftreten, wird nicht von einer Synovialscheide umgeben. Daher ist dieses Modell nicht berücksichtigt den möglichen Beitrag der Hülle zur Narbenbildung Prozess. ii) Um die Integrität der Reparaturstelle zu schützen, wird die FT am Muskel-Sehnen-Übergang freigegeben, um die mechanischen Kräfte der Sehne abnimmt, wahrscheinlich zu einer erhöhten Narbenbildung beitragen. Isolation von ausreichender Zellen aus dem Granulationsgewebe des FT während des Heilungsprozesses zur Analyse durchflusszytometrischen hat sich als schwierig; Zytologie Zentrifugation diese Zellen zu konzentrieren, ist eine alternative Methode verwendet wird, und ermöglicht es zur Erzeugung von Zellpräparationen, auf dem Immunofluoreszenz Kennzeichnung durchgeführt werden kann. Bei diesem Verfahren wird die Quantifizierung von Zellen oder Proteine von Interesse während FT Heilung möglich.
Introduction
Flexor Sehnen in der Hand arbeiten gemeinsam mit den Beugemuskeln des Unterarms und digitale Scheiden Beugung der Ziffern und Greiffunktion der Hand zu ermöglichen. Beugesehnen entlang der Palmarseite der Hand laufen; Diese relativ oberflächliche Lage führt oft zu Verletzungen an den Beugesehnen während eines Traumas auf der Hand. Sehnen heilen durch eine Reaktion von Narbengewebe statt Regeneration von normalen Sehnengewebe 1. Während diese Narbengewebe Kontinuität der Sehne bereitstellt, wird Funktion verringert sich dramatisch auf gesunde Sehne relativ. Tendon-Narbengewebe Komposite werden durch beeinträchtigte mechanische Eigenschaften 1, dadurch die reparierten Sehnen eher zu Bruch zu machen. Darüber hinaus mangelt es Narbengewebe, die Organisation der nativen Sehnenkollagen Faserstruktur, was zu einer Erhöhung der Sehne Größe und Masse. die anatomischen Einschränkungen der Sehnenscheide Einheit, selbst eine bescheidene Zunahme der Sehne Größe drastisch rot GegebenUCE die Gleitfunktion der Sehne und damit der Bewegung und Handfunktion einstelligen Bereich.
Vor der Verletzungen von 1960 an die Beugesehnen, insbesondere solche , in Zone II der Hand wurden nicht routinemäßig wegen der schweren Komplikationen bei der Heilung repariert , die 2 mit diesen Reparaturen entstanden sind . Dieser Bereich der Hand wurde als "Niemandsland" 3 bezeichnet. Allerdings Verbesserungen in der chirurgischen Techniken, Nahtmuster und physikalische Therapie Rehabilitation Protokolle haben sich dramatisch Ergebnisse der Beugesehne Reparaturen verbessert 2. Trotz dieser Fortschritte bis zu 40% der Reparaturen führen in ausreichender Adhäsionsbildung Handfunktion 4 zu behindern. Daher wird eine biologische Ansatz erforderlich Heilung zu verbessern. Leider ist nur sehr wenig auf zellulärer und molekularer Ebene über die Sehne Heilungsprozess bekannt. Somit war das Ziel, ein Mausmodell zu entwickeln, die verwendet werden könnten, die grundlegende understandin zu verbesserng der zellulären und molekularen Komponenten der flexor tendon Heilung und Narbenbildung Antwort als Mittel neue therapeutische Targets zu identifizieren, die Heilung zu verbessern.
Größere Tiermodelle haben dazu beigetragen, bei der Förderung Verständnis des Prozesses der Heilung Beugesehne. Hunde- und Kaninchen Studien haben sowohl die intrinsische als auch extrinsische Heilungsfähigkeit der Beugesehnen 5,6 gezeigt, die Bedeutung einer frühzeitigen passiven Bewegung gesteuert bei der Minimierung von Adhäsionen in Bezug auf die Immobilisierung 7, sowie die Auswirkungen unterschiedlicher Nahtmuster auf den Heilungsprozess 8 9. Darüber hinaus hat das canine Modellansätze in Prüfung translatorische gewebe Engineering nützlich gewesen 10 die Heilung zu verbessern. Allerdings gibt es mehrere wichtige Vorteile in einem murinen Modell relativ zu einem Großtiermodell verwenden, einschließlich der relativen Kosten, Verfügbarkeit von murinen spezifischen Reagenzien und die Leichtigkeit des Erzeugens globalen Knock-outs oder gewebespezifische Löschen / Überexpression Konstrukte. Darüber hinaus zeigen die funktionellen Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Mäusen in Bezug auf Beugesehnen 11 die potentiellen Nutzen eines Mausmodells zu entwickeln.
Entwicklung eines Mausmodell der Beugesehne durchtrennt und die Reparatur imitiert viele Aspekte der klinischen Heilung, einschließlich der Bildung von Narbengewebe reichlich vorhanden und die Beeinträchtigung der mechanischen Eigenschaften. Das hier beschriebene Modell ist keine echte Reprise der klinischen Praxis aufgrund Trennung der FDL am Muskel-Sehnen-Übergang, um die Reparaturstelle zu schützen. Darüber hinaus ist Konto dieses Modell nicht für den Beitrag der Synovialscheide Zellen zur Heilung Antwort, da es keine Synovialscheide ist der Mittelteil der Sehne bedeckt, wo die Reparatur erfolgt. Trotz dieser Einschränkungen hat dieses Modell den Vorteil der Erzeugung Bewegungsbereich beschränkende Verwachsungen, die noch in Mausmodellen, die mehr clos nachgewiesen werden muss,ely das klinische Szenario nähern. Dieses Modell wurde verwendet, Knock-out - Modelle Maus 12,13, zu bewerten und verschiedene pharmakologische Ansätze zu testen Heilung 14-17 zu verbessern. Die histologische Analysen dieses Modells, Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung können wichtige Einblicke in die Lokalisierung von Schlüsselgenen und Proteinen während der Heilung bieten. Jedoch stellt die Histologie nur eine Querschnitts räumliche Analyse und Quantifizierung nicht während des gesamten Gewebes ermöglichen. Flow ist Zytometrie eine quantitative Ansatz, aber nur eine sehr begrenzte Anzahl von Zellen aus der Heilungssehnengewebe im Mausmodell, isoliert werden, und diese Zahl wird weiter verringert während der Fixierung, Permeabilisierung und Waschschritte. Wenn man dies in Rechnung, um, Durchflusszytometrie eine undurchführbar Ansatz wird aufgrund der Anzahl der Tiere, die erforderlich wäre. Ein alternatives Verfahren ist notwendig, um die Mehrheit der kleinen Zellpopulation zu erhalten, umweiter zu den Heilungs milieu charakterisieren. Das verwendete Verfahren, dies zu erreichen, ist hier dargestellt, beinhaltet Konzentration der isolierten Zellen über Zentrifugation Zytologie auf einen Glasträger, gefolgt von Immunzytochemie. In der vorliegenden Studie EdU (5-Ethinyl-2'deoxyuridine, ein Thymidin-Analogon) Einbau und nachfolgende Markierung wurde verwendet, um die relativen proliferative Zustand der Zellen bei der Heilungsstelle zu bestimmen. Dieser Ansatz kann die Wirksamkeit von pharmakologischen Behandlungen auf die Zellproliferation, Gen-Knock-out oder Überexpression oder zur Identifizierung und Quantifizierung verschiedenen Zellpopulationen zu testen, angewendet werden.
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Protocol
Die Universität Ausschuss für Tierforschung an der Universität von Rochester genehmigt alle Tierversuche. Ten-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6J-Mäuse wurden verwendet.
1. Vorbereitung der Tiere für Beugersehne Chirurgie (~ 15 min)
- Autoklav chirurgische Instrumente zu sterilisieren, tragen sterile Handschuhe im gesamten Gebäude, und ein steriles Operationsfeld halten.
- Anästhesieren die Maus über intraperitoneale Injektion (ip) mit einem Volumen von Ketamin (80 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) Körpergewicht entspricht. Bestätigen Tiefe der Sedierung über Abwesenheit von Zehen Prise Reflex.
- Verabreichen präemptive Analgesie (Buprenorphin, 0,05-0,1 mg / kg) als subkutane Injektion. Anwenden ophthalmische Salbe zu verhindern Augen vor dem Austrocknen.
- Bereiten Sie die Operationsstelle durch das Fell auf der gesamten hinteren Gliedmaßen Clipping. Sterilisieren Sie die Haut, indem nacheinander mit Povidonjodid Schrubben, gefolgt von 70% Ethanol und wieder mit Povidonjodid.
- Finden Sie den langen Zehenbeugers (FDL) Sehne, oberflächlich in der medialen Seite der Wade gesehen. Mit einem Skalpell, machen einen kleinen 0,5-1 cm Schnitt in der Haut mit Mikro Schere, um die Sehne zu belichten.
- Verwenden einer Pinzette, die FDL-Sehne zu trennen von dem umgebenden Gewebe und Spuren es dem Muskel-Sehnen-Übergang auf. Schneiden Sie die Sehne an dieser Kreuzung mit Feder Schere um sie zu lösen, wobei darauf geachtet, die A. tibialis posterior zu vermeiden.
- Schließen Sie die Haut mit 5-0 Nylonnaht.
Hinweis: Die FDL transection und Reparatur (Schritte 2.4) sollte ein Stereomikroskop durchgeführt werden. - Machen Sie einen 3 mm Schnitt über dem dorsolateralen Aspekt der Hinterpfote mit Federmikro Schere. Vorsichtig fahren Sie das umgebende Weichgewebe und Muskeln mit einer Pinzette, um sicherzustellen, Gewebeschäden zu minimieren und die FDL-Sehne zu identifizieren.
- Sie vorsichtig die FDL-Sehne erhöhen und es vollständig mi mit transectcro-Schere. Vernähen der Enden der Sehne FDL zusammen in einem modifizierten Kessler Muster mit 8-0 Nähten, die Vermeidung Trocknen der Sehne durch periodisches es mit Kochsalzlösung benetzen.
- Ersetzen Weichgewebe und Muskulatur über die Sehne, und schließen Sie den Schnitt mit 5-0 Nylonnaht.
- Platzieren Mäuse auf einem Objektträger wärmeren Satz auf 37 ° C, die Körpertemperatur zu halten, bis von der Anästhesie erholt.
- Monitor-Mäuse postoperativ auf Anzeichen einer Beeinträchtigung oder Infektion einschließlich erhöhter vocalizing und zerzauste Fell. Injizieren Buprenorphin (50 ul / Maus) als Analgetikum alle 12 h bis Mäuse nicht mehr Anzeichen von Schmerzen oder Leiden zeigen.
- Erlauben Mäuse für einen Zeitraum von 10 Tagen nach dem chirurgischen Eingriff zu heilen, bevor sie zu den nächsten Schritten fortfahren.
Hinweis: Die Zellen können jederzeit Punkt nach der Operation geerntet werden. Hier werden 10 Tage für diese repräsentativen Experimenten die relativ hohe Zellularität des Gewebes zu diesem Zeitpunkt gegeben ausgewählt.
3. LABÉLIng Cycling Zellen (~ 10 min)
- Bereiten EdU (5-Ethinyl-2'deoxyuridine) -Lösung (10 mg / ml in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung [PBS] + 1% Dimethylsulfoxid [DMSO] zur Erhöhung der Löslichkeit).
- Injizieren von Mäusen mit 100 & mgr; l EdU (50 mg / kg) über intraperitoneale Injektion 24 Stunden vor der Tötung.
4. Ernte Zellen für Zytologie Zentrifugation (2,5 h, ~ 30 min Hands-on-Zeit)
- Bereiten Sie 3 mg / ml Kollagenase I in PBS.
- Euthanize Maus über Erstickung mit Kohlendioxid bei einer Strömungsgeschwindigkeit von nicht mehr als 3 l / min, und zervikale Dislokation als Sekundärmaßnahme durchführen.
- Suchen Sie die reparierte Sehne Schritt unter Verwendung von 2.4 oben und Sehnengewebe isolieren, indem man etwa 2 mm auf beiden Seiten der Verletzungsstelle mit Mikro-Schere schneiden.
- Mince Gewebe mit Skalpell in einer Petrischale mit 1 ml 3 mg / ml Kollagenase, dann passieren Mischung durch eine 18 G-Nadel mehrmals um das Gewebe zu brechen. Sammeln Gemisch in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Digest Sehnengewebe für 1 Stunde bei 37 ° C unter Schütteln.
- Spin Gewebe nach unten (300 g für 5 min), Kollagenase absaugen, dann durch Auf- und Abpipettieren mehrmals Zellen / Gewebe mit 500 ul 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS resuspendieren.
- Filter Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb Schutt und große Stücke von Sehne zu entfernen und beiseite in einem 37 ° C Inkubator eingestellt.
- Legen Sie Sehnengewebe in ein anderes 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und Refresh mit 1 ml Kollagenase-Lösung, Pipettieren nach oben und unten zu mischen.
- Inkubieren Gewebe noch eine Stunde bei 37 ° C unter Schütteln.
- Spin down verdaute Sehnengewebe (300 g für 5 min), dann resuspendieren in 500 ul 3% BSA in PBS durch Auf- und Abpipettieren mehrmals.
- Filter Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb, verbinden sich mit Suspension isoliert in 4.3.3, dann zählen die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Waschen Zellen noch einmal mit 3% BSA in PBS, dann Resuspendieren bis 3-6x 10 4/100 & mgr; l.
- Bringen Sie einen Zytologie-Trichter auf eine positiv geladene Objektträger und rasten in den Schlittenträger. Legen Sie die gesamte Vorrichtung in eine Zytologie Zentrifuge und fügen dem Trichter 100 ul Zellsuspension. Zentrifuge bei 300 xg für 5 min die Zellen auf dem Objektträger zu verteilen.
5. Immunzytochemie zu erkennen EDU (2 h, ~ 45 min Hands-on-Zeit)
Hinweis: Alle Inkubationsschritte sollten im Dunkeln durchgeführt werden Photobleichens Fluorophore zu begrenzen.
- Kreis-Zellen mit einer hydrophoben Barriere Stiftlösung zu minimieren, die für Schritte folgen, dann fixieren sofort mit 150 ul 3% Paraformaldehyd in PBS 15 min bei Raumtemperatur (RT).
- zweimal für 5 min mit 150 ul 3% BSA in PBS waschen.
- Permeabilisieren Zellen mit 0,5% Triton-X 100 in PBS 20 min bei RT.
- Wiederholen Waschschritt wie in Abschnitt 5.1.1.
- Bereiten Sie EdU Reaktion Cocktail gemäß Kit Anweisungen nicht mehr als 30 Minuten vor dem Gebrauch.
- In 150 ul Cocktail zu jeder Folie, Inkubation 30 min bei RT.
- Wiederholen Waschschritt wie in Abschnitt 5.1.1.
- Inkubieren mit 150 & mgr; l Kern Gegenfärbemittel Hoechst33342 verdünnt 1: 2.000 in PBS 30 min bei RT.
- Zweimal waschen für 5 min mit 150 ul 1x PBS.
- Fügen Sie 1-2 Tropfen anti-fade Eindeckmediums an Zellen, dann langsam niedriger Deck Blasen zu verhindern.
- Lassen Sie Eindeckmediums über Nacht im Dunkeln bei RT zu heilen.
- Verwenden Sie polieren klaren Nagel das Deckglas auf die Folie zu versiegeln.
- Bildfolien bei 40-facher Vergrößerung eines Fluoreszenzmikroskops mit Anregungs- / Emissionsfiltern ausgestattet mit erfassen kann DAPI (Hoeschst33342) und Texas Red (Alexa Fluor 594).
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Representative Results
Der Flexor digitorum longus (FDL) Muskel, in der Wade befindet, wirkt die Ziffern der Maus Hinterpfote über die Beugesehne (umrissen in blau in 1A und histologisch in 2A gezeigt) zu biegen, die sich von der Muskel - Sehnen läuft proximal Kreuzung und endet in den Endphalangen. In diesem Modell der Beugesehnenheilung wird der FDL - Sehne durchtrennt und in der Mitte Fuß, proximal der Bifurkation in den Ziffern der Hinterpfote (rote Pfeile, Abbildung 1A) repariert. Um zu verhindern , Bruch der Reparatur, die experimentelle Analyse ausschließen würde, die Sehne (und der angrenzenden Muskel) geschnitten wird , oder freigegeben, am Muskel - Sehnen - Übergang (gelber Pfeil in 1B, Freigabe in 1C gezeigt). Während dieser Schritt nicht repräsentativ für das klinische Szenario ist, ist es wichtig , um die Reparatur zu schützen , indem sie Druck auf die verletzte Stelle abnimmt. 2Dist ein histologischer Beispiel eines rupturierten Reparatur Beugesehne im Vergleich zu einer erfolgreichen Reparatur in 2C gezeigt. In letzterem erhöht das Granulationsgewebe zeigt stark Zellularität im Vergleich zu der unverletzten Sehne (2B), und diese Zellpopulation kann dann weiter über Zytologie Zentrifugation auf einen durch Immunzytochemie gefolgt slide analysiert werden. Abbildung 3 Die experimentelle Vorgehensweise skizziert zur Bewertung die proliferative Zustand der von Heil Sehnen 10 Tage nach der Reparatur über EdU Einbau in neu synthetisierte DNA gesammelten Zellen. EdU Markierung zeigt daher nur jene Zellen , die aktiv während der 24 - Stunden - Zeitraum nach dem EdU Puls in lebenden Mäusen stark vermehrt, wie in Abbildung 4 zu sehen. Eine quantitative Beurteilung der Proliferation im Granulationsgewebe der Heilung Sehne kann dann durch Punkt-Zählung bestimmt werden der gesamten Zellpräparation. Auf diese Weise wird ein Ausgangswert von prolifeRation kann zu jedem Zeitpunkt festgelegt werden, und Änderungen aufgrund der genetischen oder pharmakologischen Interventionen bewertet werden können.
Abbildung 1 :. Murine Hinterpfote Anatomie und Identifizierung des Flexor digitorum longus. Der Flexor digitorum longus (FDL) biegt sich die Ziffern in der Maus Hinterpfote und verläuft entlang der Palmarseite der Hinterpfote (FDL blau dargestellt) , wo es die Ziffern gabelt sich in (rote Pfeile) (Abbildung 1A). Proximal verläuft die FDL-Sehne durch den Tarsaltunnel (schwarzer Pfeil), in der Wade, am Muskel-Sehnen-Übergang (gelber Pfeil) (Abbildung 1B) endet. Die Freigabe der Sehne am Muskel - Sehnen - Übergang Bruch zu verhindern , in 1C gezeigt wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Repräsentative histologische Bilder von Un-verletzt, Normal Heilung und Ruptured Beugersehne Reparaturen Die Anatomie der FDL - Sehne im Maus - Hinterpfote ist in 2A gezeigt. Maßstabsbalken entspricht 1 mm. In den 2B-D wird die Sehne mit 8facher Vergrößerung unverletzt Sehnengewebe (2B) zu einer intakten und aufgebrochenen Reparatur (2C und 2D, jeweils) zu vergleichen. Ganze Hinterpfote Proben wurden in neutral gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten in bis 3 & mgr; m Abschnitte, und gefärbt mit Alcianblau / Hematoxylin / Orange G wie zuvor beschrieben 13. Einheimische Sehne wird blau dargestellt, Sehnen- / Granulationsgewebe Verbund wird in grün dargestellt, und schwarze Pfeile zeigen Nähten. Maßstabsbalken repräsentieren 200 & mgr; m. Pleasen klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Experimentelles Verfahren zum Durchführen EdU Click-Chemie es auf Zellpräparate Am Tag 10 nach der Operation FDL Sehnen Heilung von Maus seziert wurden Hinterpfoten.. Die Sehnen wurden zerkleinert dann verdaut zwei Stunden in Kollagenase I um die Zellen zu dissoziieren. Die Zellsuspension wurde belastet Trümmer zu entfernen, und ~ 6 x 10 4 Zellen wurden in einer Monoschicht auf positiv geladenen Objektträger aus Glas mit einer Zytologie Zentrifuge versponnen. Die Zellen wurden mit einer hydrophoben Barriere Stift eingekreist und dann fixiert sofort mit Paraformaldehyd. Nach Permeabilisierung mit Triton X-100, wurden die Zellen mit einem EdU Erkennung Cocktail behandelt und eine Click-Chemie Reaktion gebunden Alexa Fluor 594 aufgenommen EdU. Hoechst 33342 wurde als eine Kernfärbung und die Zellen verwendet wer e bei 10-40x mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Immuncytochemie Analyse von Radfahren EdU-markierten Zellen während Beugersehne Healing Healing FDL Sehnen wurden aus den Hinterpfoten von Mäusen 10 Tage nach der Operation und verdaut mit Kollagenase geerntet um eine Zellsuspension zu erhalten. Die Zentrifugation wurde verwendet, um diese Zellen in einer Monoschicht auf den Folien zu verteilen, gefolgt von Immunzytochemie zu Bild EdU Einbau. 4A und 4B sind Bilder, die am 10X und 40X bzw. der Zellen anschließenden immunzytochemischen Analyse. Kernfärbung Hoechst 33342 ist blau, und Zellen, die EdU haben eingebaut sind mit rot punktiert. Maßstabsbalken stellen 50 & mgr; m.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das chirurgische Verfahren für ein Mausmodell der vollständigen Durchtrennung und die Reparatur der digitorum longus Flexor wird in dieser Studie vorgestellt. Zusätzlich wird eine neuartige Anwendung der Konzentration kleiner Zellpopulationen mit Zytologie Zentrifuge gezeigt, was eine quantitative immunocytochemische Analyse der zellulären Umgebung während der Beugesehnenheilung. Dieses Modell der Beugesehnenreparatur zeigt eine reproduzierbare Heilungsreaktion, die verwendet werden können Veränderungen in den Heilungsprozess Modellen knockout oder pharmakologische Intervention zu beurteilen. Nach der Operation, eine entzündliche Reaktion beginnt innerhalb von 24 Stunden, in denen Zellen zum Ort der Verletzung rekrutiert werden und ein Kallus von Fasergewebe zu bilden beginnt. Eine Proliferationsphase folgt bei etwa vier Tage, stark erhöhte Zellularität und reichliche Ablagerung von unorganisierten extrazellulären Matrix an der Reparaturstelle beteiligt, was zur Bildung von Adhäsionen zwischen 14-21 Tagen. Gewebsumwandlung Kontinues bis Tag 35, zu welcher Zeit die Kontinuität und die Organisation der Beugesehne wird wieder hergestellt, und die Zellularität 18 reduziert wird.
Derzeit gibt es mehrere murine Modelle von flexor tendon Reparatur zusätzlich zu dem hier dargestellt. Tsubone et al., Haben ein in vitro - Modell der Beugesehnenheilung 19 beschrieben. Während dieses Modell Veränderungen in der Genexpression im Laufe der Zeit beurteilen kann, kann es nicht in der entzündlichen / Zytokinmilieu für die Rekrutierung von extrinsischen Zellen oder Veränderungen berücksichtigen , die in vivo auftritt. In vivo, zwei Modelle der Teiltrennung entwickelt wurden , entweder incisional oder excisional mit Defekte 20,21. In jüngerer Zeit, Wong et al., Charakterisiert 22 eine Zone II Modell der Beugesehnenverletzung in einem Mausmodell. Dies ist eine wichtige Entwicklung, da der Beitrag der Synovialscheide abgeleiteten Zellen zum Heilungsprozess ermöglicht definiert werden. Jedoch keine quantifizierbare Änderungen in Gleitflug Funktion wurden unter Verwendung dieses Modells beschrieben. Jedes Modell hat seine eigenen Vorteile und Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen, einschließlich der technischen Leichtigkeit, klinische Relevanz und Anatomie. Eine Hauptbegrenzung der hier beschriebenen Modells ist, dass die heilende Sehne vor der Auswertung bersten kann, unbrauchbar für die weitere Analyse zu machen. ausreichend Zellen Ernte wird nicht machbar unter diesen Umständen gemacht und jede histochemische Analyse ist nicht lebensfähig, wie ein gerissener Sehne folgt nicht den Standard Heilungsprozess oben beschrieben. die FDL-Sehne freisetz proximal Belastung auf den Heilungs Sehne zu verringern, ist daher ein entscheidender Schritt für die Prävention, trotz der Tatsache, dass es nicht klinisch relevant ist. die Operation Durchführung einseitig senkt auch die Rate der Bruch. Eine weitere Einschränkung ist die Unfähigkeit, den Beitrag der peri-sehnigen Scheidenzellen zu verfolgen, wie die Synovialscheide nicht in das Segment der FDL-Sehne nicht umschließt, die in diesem Modell ist verletzt.
jove_content "> Eine wichtige Funktion dieses flexor tendon Reparatur Modells ist, dass es Auswertung der Zellen an der Heilungsstelle ermöglicht. Immunofluorescence / Immunhistochemie (IHC) eine gemeinsame biologische Technik ist, die verwendet werden können, diese Zellen zu charakterisieren. Während IHC einzigartig geeignet ist zur Bestimmung der räumlichen Informationen, ist es weitgehend eine qualitative Methode. Changes in Gewebe- oder Zellzusammensetzung in der gesamten Tiefe des Gewebes übersehen werden kann, und die Quantifizierung von Populationen ist schwierig. Flow ist cytometry einen idealen Ansatz zu definieren, zu quantifizieren und zu isolieren potenziell Zell während der Heilung der Bevölkerung. Die Isolierung und Verdauung der Heilung Sehnengewebe aus diesem Modell liefert sehr geringe Zellzahlen für die durchflusszytometrische Analyse (1-2 x 10 5 im Durchschnitt von jeder Maus) und Fixierung / Permeabilisierung Schritte zur Detektion von intrazellulären Markern reduziert diese Zahl weiter. Zytologie Zentrifugation unter Verwendung der isolierten Zellen zu konzentrieren, gefolgt von immunocytochemistry, bietet eine Möglichkeit, diese kleinen Zellpopulationen zu charakterisieren. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass es keine Notwendigkeit zum Pool Proben zusammen genügend Zellen zu erhalten; daher jede Maus stellt eine einzelne Probe zur Analyse. Eine wichtige Überlegung, diese Zellpräparate bei der Generierung wird die Konsistenz in der für die Analyse gewonnene Gewebe. Umgeben Muskeln und Faszien können dem Granulationsgewebe haften und müssen sorgfältig entfernt seziert werden. Da dieses Verfahren auf Folien minimale Verarbeitung der Zellen vor der Fixierung beinhaltet, behält es eine Mehrzahl von isolierten Zellen für die weitere Analyse. Auf diese Weise kann quantitativ mittels Immunzytochemie beurteilt werden fast die gesamte Population von Zellen, die Adhäsion Gewebe an der Reparaturstelle bilden. In der vorliegenden Studie wird EdU Einbau von wuchernden Zellen verwendet, um die Anwendung dieser Zytologie Technik zu demonstrieren, es kann aber auch für komplexere und eingehende Charakterisierung o verwendet werdenf der heterogenen Zellpopulationen in Beugesehnenheilung beteiligt. Zukünftige Anwendungen dieser Technik kann mehr in die Tiefe Charakterisierung der Zellpopulationen in Sehnenheilung beteiligt führen, da es zur Bestimmung der Kolokalisation von zellulärer Marker in den Zellen, die mit der Granulationsgewebe in die Heilung Sehne erlaubt.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von der amerikanischen Gesellschaft für Handchirurgie Pilot-Award und NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (zu AEL) und NIAMS / NIH P30AR061307 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
