Summary
Den følgende artikkelen gir en enkel, reproduserbar teknikk for effektivt å skape en bærekraftig musemodell for limbale stamcellemangel (LSCD). Denne dyremodell er nyttig i å teste og sammenligne effekten av behandlinger for limbale stamcellesykdommer.
Abstract
Limbale stamcellemangel (LSCD) er en tilstand av funksjonsfeil eller tap av limbale epiteliale stamceller, hvoretter cornealepitelets er erstattet med conjunctiva. Pasienter lider av tilbakevendende korneadefekter, smerte, betennelse og tap av syn.
Tidligere har en murin modell av LSCD ble beskrevet og sammenlignet med to andre modeller. Målet var å frembringe en konsistent musemodell for LSCD at begge etterligner den fenotype hos mennesker og varer lenge nok til å gjøre det mulig å studere sykdom patofysiologien og å vurdere nye behandlinger. Her blir den teknikk som er beskrevet i mer detalj.
En motorisert redskap med en roterende graden er konstruert for å fjerne rust ringene fra hornhinneoverflaten eller å jevne pterygium sengen hos pasienter. Det er en egnet innretning for å skape den ønskede LSCD modell. Det er en lett tilgjengelig, lett-å-bruke verktøy med en fin spiss som gjør det hensiktsmessig for å arbeide på små øyne, somi mus. Sin søknad hindrer unødvendig traume for øyet, og det resulterer ikke i uønskede skader, som ofte er tilfellet med kjemiske skademodeller. I motsetning til en sløv skraper, fjerner det epitel med basalmembranen. I denne protokollen ble limbale området slipes to ganger, og deretter hele cornealepitelets ble barbert fra limbus til limbus. For å unngå stroma skade, omsorg ble tatt ikke å børste hornhinnen overflaten når Epitel er allerede fjernet.
Introduction
Cornealepitelets er nødvendig for å opprettholde klarheten og integriteten av hornhinnen. Det er stadig fornyes gjennom hele livet av epithelial stamceller bosatt i limbus-en smal sone i krysset av hornhinnen og konjunktiva. Disse selvfornyende limbale stamceller spille en avgjørende rolle i å regenerere cornealepitelets, både normalt og etter skade. Delvis eller fullstendig nedbryting av disse stamcellene vil resultere i tilbakevendende hornhinnen erosjoner, smerte, hornhinnen arrdannelse og neovaskularisering, utseende av slimceller, og hvis den forblir ubehandlet, korneal blindhet. Denne tilstanden er kjent som limbale stamcelle-mangel (LSCD) og kan være idiopatisk; arvelig; eller ervervet på grunn av kjemiske eller termiske skader, langsiktig bruk av kontaktlinser, og kronisk betennelse 1-6.
Forskning på LSCD krever en passende dyremodell som ikke bare etterligner sykdom hos mennesker, men er reproduserbar og bærekraftig, med minst enmount for skade på andre hornhinnen og okulære strukturer. Denne modellen er nødvendig for å vurdere behandling og for å avklare sykdomsmekanismene ved molekylære og cellulære nivåer. Som beskrevet før 1, med bruk av en roterende graden, kan man lett utvikle en musemodell for LSCD som har de nevnte fordeler og vedvarer i minst tre måneder. Målet med denne studien er å presentere en enkel, reproduserbar og bærekraftig musemodell for LSCD.
Den roterende Burr er et hendig verktøy som jevnt fjerner epitel uten å skade den underliggende stroma en. Det har blitt brukt til å indusere sentral korneal erosjon 7, 8 i sårheling studier. Den herved presentert teknikk for å skape LSCD i en mus har ikke blitt rapportert før. Tidligere innført fremgangsmåter for skraping av epitel med et stump spatel resultere i en mindre ensartet skadefri spesielt ved limbus-og en mer variabel fenotype 1, 9, med mer restaurering of normal cornealepitelets en. I motsetning til den butte skraper fjerner den roterende graden epiteliale basalmembranen, så vel 7, 8, 10. Andre rapporterte fremgangsmåter for å kutte stamceller innebære bruk av kjemikalier, slik som natrium-hydroksid, n-heptanol, og benzalkoniumklorid, som ikke bare kan forårsake uønsket skade på underliggende øyet strukturer, men også kan føre til betydelige betennelse og påfølgende korneal opasitet eller epitel plateepitel metaplasi 11-15. Den roterende Burr er ikke forbundet med disse alvorlige komplikasjoner. Kirurgisk fjerning av limbale epitel, alene eller sammen med bruk av kjemikalier 10, 11, 16, er mer vanskelig å utføre og er ikke det beste alternativet i dyr med små øyne og en tynn limbale epitel (for eksempel mus). I tillegg overraskende, limbectomy kan fortsatt la noen av limbale epitel bak 10.
Den nedenfor beskrevne teknikken vil resultere i LSCD med neovascularization end conjunctivalization som etterligner presentasjonen av komplett LSCD hos pasienter og varer i minst tre måneder 1. Det passer for de som ønsker å studere LSCD eller sårtilheling patofysiologi, immunologi, og potensielle behandlinger hos mus. Muligens, med noen modifikasjoner, denne fremgangsmåten kan bli utført på rotter eller kaniner 10. Ettersom den roterende graden effektivt fjerner epitel, kan den anvendes i hvilken som helst forskning vedrørende korneal epitelial abrasjon / såret og i andre relaterte behandling eller molekylærbiologiske undersøkelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer utført på dyr i samsvar med Foreningen for forskning i Vision og Oftalmologi regnskap for bruk av dyr i et syn forskning. Fjorten fire til seks måneder gamle mannlige / kvinnelige C57BL / 6J villtype mus ble brukt: ti mus for skaden modell og fire som kontrolldyrene (unwounded hornhinner).
1. Animal Forberedelse
- Bedøve en mus med en intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin blanding. Etter at bedøvelsen har virket, klype tå for å bekrefte anestesi dybde; dyret skal ikke reagere.
- Inspiser øyet under en spaltelampe før du utfører eksperimenter for å bekrefte fravær av tidligere skade på hornhinnen.
- Innpode en nedgang på 1% tetrakain hydroklorid på øyet. Etter 60-90 sek, teste hornhinnen refleks for å bekrefte fravær av sensasjon. Proparacaine-hydroklorid 0,5% kan benyttes i stedet.
- Når tapet av hornhinnen sensasjon erviss, forsiktig plassere en dråpe av 5% povidon-jod på øyet og på håret rundt øyet. Tørk av rulle etter 1 min eller spre det på håret rundt øynene for å hindre at håret fra å forstyrre den verktøytips.
2. Slipe cornealepitelets
- Bruk kirurgiske hansker og en kappe. Klargjør de nødvendige verktøy: en steril roterende Burr og et par sterile pinsetter. For bedre kontroll, bruk bøyde pinsett. Plasser verktøyet på en steril ark under prosedyren.
- Ved hjelp av de bøyde pinsett, stabil øyet ved å gripe lokkene fra nasal side og forsiktig proptosing øyet. Unngå å bruke for mye press.
- Under en kirurgisk mikroskop, barbere 360 ° rundt limbale området to ganger ved hjelp av sterile roterende Burr. Gå rundt limbus med en hastighet på 5-6 sek per runde.
MERK: Gradene har en fast hastighet. Imidlertid, for det til å rotere med den etablerte hastighet, den "endemutteren" skal være fullstendig strammet. - Fjern hele cornealepitelets fra limbus til limbus med den roterende Burr. For bedre resultater, flytter verktøyet i en sirkulær måte og holde det litt parallelt med hornhinnen overflaten til å jobbe med den laterale siden av spissen. Pass på å ikke skade stroma ved ikke å re-børste de områdene der Epitel har allerede blitt fjernet. Bruk ikke noe press på øyet. Rengjør penseltuppen etter behov.
- Innpode en dråpe steril fosfatbufret saltvann på hornhinnen og tørk vekk eventuelle frittliggende epiteliale ark med en myk vev.
- Barbere de gjenværende epitel, hvis noen.
- Vær oppmerksom på musehale under operasjonen.
MERK: Hvis noen bevegelse oppstår, har anestesidybde falmet og ytterligere injeksjon er nødvendig. En tredjedel til to tredjedeler av den primære injeksjonsvolumet bør være tilstrekkelig. Ikke overdose dyret med bedøvelse medisinering. - Steriliser alle verktøyene før du bruker dem på en annen øyet.
3. Bekreft Komplett Epitelial fjerning
- Påfør en dråpe av 1 mg / ml fluorescein natrium på hornhinnen. Rengjør hornhinnen etter 30 sek og undersøke den under et mikroskop med en koboltblått filter for å kontrollere fullstendig fjerning av epitel.
MERK: Hornhinnen områder med epiteldefekter er visualisert i grønt.
4. Post-drift Care
- Sett dyret på en varmeteppet og oppbevar den på et trygt sted (for eksempel i buret) mens under utvinning. Ikke holde en bevisstløs dyr i selskap med bevisste seg.
- Påfør 1% erytromycin oftalmisk salve. Dette vil også forhindre øye tørrhet. Fortsett programmet antibiotika daglig i en uke.
- Injisere 0,1 mg / kg buprenorfin subkutant etter inngrepet og igjen etter 12 timer. Fortsett injeksjon to ganger daglig i to dager.
- Observere dyret i 30 - 45 min, til fullstendig utvinningen fra anestesi.
NOTAT: Mild bevegelse av pustemuskulaturen på ventral overflaten indikerer dyr velvære mens under utvinning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innen en måned etter å ha utført denne teknikken, 100% av hornhinner utviklet overfladisk neovaskularisering (figur 1A. Bildene ble tatt med et kamera koblet til en spaltelampe under et sterkt felt og koboltblått filter). I 18/20 (90%) av øynene, er involvert neovaskularisering hele hornhinneoverflaten (figur 1A). I 2/20 (10%), ble neovascularization observert i tre av fire hornhinnen kvadranter, men det fortsatt nådde hornhinnen sentrum.
For å validere utviklingen av LSCD, ble hele mount farging utført en. Dette trinnet er ikke en del av protokollen og kan endres avhengig av mål og interesser. Tre varianter ble regnet som indikator for LSCD: fravær av cytokeratin (CK) 12, et mellomliggende filament spesifikt til normale corneale epitelceller 17, 18; Utseendet av CK8, en enkel epitel markør
Normal, uskadde hornhinner express CK12-en spesifikk markør for modne hornhinne epitelceller 17, 18 -throughout hornhinnen overflaten, men de er blottet for enhver CK8 eller slimceller (MUC5AC) på hornhinnen del av hele mount prøvene (figur 1B) . I forhold til vanlige øyne, er nesten fraværende på injur CK12 uttrykk y modell hornhinner, mens de betydelig viser positiv farging for CK8 og slimceller (figur 1B). Disse observasjonene tyder på utvikling av LSCD.
Hvis interessert i å tallfeste farging resultat ved å bruke bilde-J til separat kvantifisere 20 farging tettheter på de opprinnelige, uendret bilder tatt av mikroskop under de samme innstillingene. Kort beskrevet, velger hornhinnen del av hele montere prøven, måle det integrerte tetthet og område for dette området, og beregne den korrigerte tetthet for bakgrunnen 20. Forholdet mellom CK12 til CK8 tettheter er tidligere presentert på et større antall prøver 1. Den reduserte forholdet i forhold til kontrollene (normale hornhinner) og utseendet av slimceller på hornhinneoverflaten viser utviklingen av LSCD.
658 / 54658fig1.jpg "/>
Figur 1: Hornhinnen Phenotype Etter Opprette LSCD i Mus. Slit lampe undersøkelse viser at alle hornhinner utvikle noen grad av neovaskularisering av en måned (A, Skala: 0,5 mm). En normal hornhinne uttrykker CK12 over hornhinnen, men er blottet for enhver CK8 eller slimceller (MUC5AC). CK12 er fraværende i LSCD modellen, mens CK8 og slimceller vises på hornhinnen (B, Skala: 200 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en reproduserbar og relativt enkel teknikk for å skape en musemodell for LSCD. Det er flere viktige aspekter ved denne modellen som er verdt å merke seg. Først, i motsetning til modeller som bruker kjemikalier 11, 12, skaden innebærer først og fremst overflaten epitel (og basalmembran), med minimal skade på den underliggende hornhinnen stroma eller andre intraokulære strukturer. Det er således bare begrenset inflammasjon og arrdannelse, som begge kan komplisere prosessen og gjør det mer vanskelig å vurdere resultatet av eventuelle tiltak som tar sikte på limbale stamceller. En interessant fersk studie av Li et al. 10, som sammenligner bruken av den roterende Burr med forskjellige kombinasjoner av kirurgiske og kjemiske behandlinger, har også funnet at graden til å være sikrere og mer effektiv i å skape LSCD i kaniner. For det andre synes modellen å være stabil i minst opp til tre måneder 1. Opprette denne modellen innebærer bruk avden roterende Burr, et instrument som er kjent for klinikere som arbeider med hornhinnen, så vel som til de som gjør mus såret studier. Dens fremfor å bruke en butt spatel er at skaden er mer ensartet og reproduserbar en.
For bedre å ødelegge limbale stamceller ble limbale området behandles to ganger. Basert på erfaring på mus øyne, behandling av mer enn to runder sliper ofte limbale blodårer og forårsaker blødninger. Ved den teknikk som er brukt i andre dyr, kan dette trinnet endres avhengig av hornhinneepitel tykkelse. I denne studien ble en motorisert redskap med en graden spiss 0,5 mm utnyttet; Burr tips i andre former og størrelser er også tilgjengelige og kan anvendes i stedet, avhengig av hornhinnen spesifikasjoner, og øyet på størrelse. Li et al. 10 rapporterte 2,5 mm Burr å være egnet til å konsekvent fjerne kanin hornhinnen og limbale epitel.
For å oppnå optimalresultat, limbale og hornhinnen epitel ble barbert i en sirkulær mote og den laterale siden av Burr ble brukt. For å hindre at dyret håret fra å forstyrre verktøyspissen, er povidon-jod slipp spredt på håret rundt øyet, i stedet for å bli tørket av. Verktøyet skal ikke brukes statisk på ett sted, da dette kan føre til perforering. Behandling av limbus på et svært sakte tempo kan føre til blødning; en hastighet på omtrent 6 sekunder per runde er egnet for en C57BL / 6J mus øyet. Det er viktig å unngå re-børsting nakne stroma, da dette vil forårsake mer betennelse og stroma opasifikasjon. Trykket bør ikke brukes på øyet mens sliping epitel. Etter prosedyren ble hornhinnen farget med fluorescein fargestoff for å sørge for fullstendig epitel fjerning. Det er viktig å hindre at øyet tørrhet under dyr utvinning. Begrensninger er at denne teknikken ikke kan fjerne 100% av stamceller. Det er også noe avhengig av operatør og krever øvelse for å gi consistent resultater.
Når studere hornhinneepitel fenotype, er hele mount flekker den beste måten å vurdere utfallet av denne modellen. Dette er fordi det tillater hele corneale epitel som skal evalueres på en gang, mens tverrsnitt vil bare gi informasjon om hver enkelt seksjon.
Denne styrbare teknikken kan indusere LSCD i mus, og sannsynligvis i andre dyr i tillegg. Det gir en passende modell av LSCD å studere nye behandlinger og til å oppdage bredere aspekter av sykdommen patofysiologi. Med noen endringer, kan det være nyttig i å studere korneal sårheling, angiogenese, og lymphangiogenesis også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ruth Zelkha, MS, for hennes generøse assistanse i bildebehandling. Denne forskningen ble støttet av klinisk forsker Development Program Award K12EY021475 til ME, gi R01 EY024349-01A1 til ARD, core stipend EY01792 fra National Eye Institute, NIH, og en ubegrenset stipend fra forsknings å hindre blindhet. ARD er mottaker av en Career Development Award fra forskning for å hindre blindhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
