Summary
O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.
Abstract
deficiência límbica (LSCD) é um estado de mau funcionamento ou perda de células-tronco epiteliais do limbo, após o qual o epitélio corneano é substituído por conjuntiva. Os pacientes sofrem de defeitos da córnea recorrentes, dor, inflamação, e perda de visão.
Anteriormente, foi descrito um modelo de murídeo de LSCD e comparado com dois outros modelos. O objetivo era produzir um modelo de rato consistente de LSCD que ambos os imita o fenótipo em humanos e dura o tempo suficiente para torná-lo possível estudar a fisiopatologia da doença e avaliar novos tratamentos. Aqui, a técnica é descrita em mais detalhe.
Uma ferramenta motorizada com uma broca rotativa foi concebida para remover os anéis de ferrugem a partir da superfície da córnea ou para suavizar a cama pterígio em pacientes. É um dispositivo adequado para criar o modelo LSCD desejado. É um fácil de usar ferramenta prontamente disponível, com uma ponta fina que torna apropriado para trabalhar em pequenos olhos, comoem ratinhos. A sua aplicação impede traumas desnecessários ao olho e que não resultam em lesões indesejadas, como é frequentemente o caso com os modelos de lesão química. Ao contrário de um raspador romba, que remove o epitélio com a membrana basal. Neste protocolo, a área límbica foi desgastada duas vezes, e então todo o epitélio corneano foi raspada do limbo a limbo. Para evitar lesões estroma, o cuidado foi tomado para não escovar a superfície da córnea uma vez que o epitélio já foi removido.
Introduction
O epitélio corneano é necessária para manter a clareza ea integridade da córnea. É constantemente renovada ao longo da vida através das células estaminais epiteliais que residem no limbo-uma zona estreita na junção da córnea e da conjuntiva. Estas células estaminais do limbo auto-renovação desempenham um papel crucial na regeneração do epitélio da córnea, tanto normalmente e após a lesão. esgotamento parcial ou total destas células estaminais irão resultar em erosões corneanas recorrentes, dor, cicatrização da córnea e neovascularização, a aparência das células caliciformes, e, se deixados sem tratamento cegueira, da córnea. Esta condição é conhecida como deficiência límbica (LSCD) e pode ser idiopática; hereditária; ou adquirida devido a lesões químicas ou térmicas, lentes de contacto prolongado desgaste, e inflamação crônica 1-6.
Investigação sobre LSCD exige um modelo animal adequado que não imita apenas a doença em seres humanos, mas é reprodutível e sustentável, com o mínimo ummontagem de prejuízo para outras estruturas da córnea e oculares. Este modelo é necessário avaliar tratamentos e esclarecer os mecanismos da doença em níveis moleculares e celulares. Tal como descrito antes 1, com a utilização de uma broca rotativa, pode-se facilmente desenvolver um modelo de ratinho de LSCD que apresenta as vantagens acima mencionadas e persiste durante pelo menos três meses. O objetivo deste estudo é apresentar um modelo simples, reprodutível e sustentável do rato de LSCD.
A broca rotativa é uma ferramenta útil que remove uniformemente o epitélio sem ferir o estroma subjacente 1. Ele tem sido usado para induzir a erosão da córnea central 7, 8 em estudos de cicatrização de feridas. A técnica apresentada, ora para criar LSCD em um mouse não tem sido relatada antes. Anteriormente introduzidos métodos de raspagem do epitélio com um resultado espátula romba num menos uniforme lesão, particularmente no limbo e um fenótipo mais variável 1, 9, com mais restauração óepitélio normal da córnea f 1. Ao contrário do raspador sem corte, a broca rotativa elimina a membrana basal epitelial bem como 7, 8, 10. Outros métodos descritos para separar as células estaminais envolvem a utilização de produtos químicos, tais como hidróxido de sódio, n-heptanol, e cloreto de benzalcónio, o que não só pode induzir lesão indesejada para estruturas oculares subjacentes, mas também pode levar a inflamação significativa e subsequente opacificação da córnea ou metaplasia escamosa epitelial 11-15. A rebarba de rotação não está associado a estas complicações graves. A remoção cirúrgica do epitélio do limbo, sozinho ou com o uso de produtos químicos 10, 11, 16, é mais difícil de realizar e não é a melhor opção em animais com pequenas olhos e um epitélio do limbo fina (como ratos). Além disso, surpreendentemente, limbectomy pode ainda deixar algum do epitélio do limbo para trás 10.
A técnica descrita abaixo irá resultar em LSCD com uma neovascularizaçãod conjuntivalização que imita a apresentação de LSCD completa em pacientes e tem a duração de pelo menos três meses 1. É apropriado para aqueles que pretendem estudar LSCD ou fisiopatologia cicatrização de feridas, imunologia e potenciais tratamentos em ratinhos. Possivelmente, com algumas modificações, este procedimento pode ser realizado em ratos ou coelhos 10. À medida que a rebarba rotativo remove eficientemente o epitélio, ele pode ser utilizado em qualquer pesquisa relativos à abrasão da córnea epitelial / ferimento e em qualquer tratamento relacionada ou estudos de biologia molecular.
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Protocol
Todos os procedimentos realizados em animais em conformidade com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia declarações para o uso de animais em pesquisa visão. Quatorze quatro a 6J de seis meses de idade, macho / fêmea C57BL / tipo selvagem foram utilizados: dez ratos para o modelo de lesão e quatro como animais de controlo (córneas sem ferimentos).
1. Preparação de animais
- Anestesiar um rato com uma injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de mistura de xilazina. Após a anestesia começou a produzir efeitos, apertar o dedo do pé para confirmar a profundidade da anestesia; o animal não deve reagir.
- Inspecione o olho sob uma lâmpada de fenda antes de realizar os experimentos para verificar a ausência de qualquer lesão da córnea anterior.
- Instilar uma gota de cloridrato de tetracaína a 1% para o olho. Depois de 60-90 segundos, teste do reflexo corneal para confirmar a ausência de sensação. Anestalcon 0,5% pode ser usado em seu lugar.
- Quando a perda de sensibilidade da córnea édeterminado, suavemente colocar uma gota de 5% de povidona-iodo no olho e no cabelo em torno do olho. Limpe a queda após 1 min ou espalhá-lo sobre o cabelo ao redor do olho para evitar que o cabelo de interferir com a ponta da ferramenta.
2. Equipamento abrasivo do epitélio corneano
- Usar luvas cirúrgicas e um vestido. Prepare as ferramentas necessárias: uma rebarba rotativa estéril e um par de pinças estéreis. Para um melhor controle, use uma pinça dobrados. Coloque as ferramentas em uma folha esterilizada durante o procedimento.
- Usando a pinça dobrados, estabilizar o olho, agarrando as tampas do lado nasal e gentilmente proptosing o olho. Evitar o uso de muita pressão.
- Sob um microscópio cirúrgico, fazer a barba 360 ° ao redor da área de limbo duas vezes utilizando a broca rotativa estéril. Vá ao redor do limbo com uma velocidade de 5-6 segundos por rodada.
NOTA: A broca tem uma velocidade fixa. No entanto, para que o mesmo rode à velocidade estabelecida, a "porca final" deve ser completamente apertados. - Remover todo o epitélio corneano do limbo a limbo com a rebarba giratória. Para melhores resultados, mover a ferramenta de forma circular e prendê-lo de alguma forma paralela à superfície da córnea para trabalhar com a face lateral da ponta da mesma. Tome cuidado para não ferir o estroma por não re-escovar as áreas onde o epitélio já foi removido. Não aplique pressão sobre o olho. Limpe a ponta do pincel conforme necessário.
- Instilar uma gota de tampão fosfato estéril sobre a córnea e limpe as folhas epiteliais isolada com um tecido de limpeza macio.
- Raspar o epitélio remanescente, se alguma.
- Preste atenção para a cauda do rato durante a cirurgia.
NOTA: Se ocorrer qualquer movimento, a profundidade da anestesia se desvaneceu e mais injeção é necessária. Um terço a dois terços do volume injectado primária deve ser suficiente. Não overdose do animal com a medicação anestésica. - Esterilizar todas as ferramentas antes de usá-los em outro olho.
3. Confirmar remoção epitelial completa
- Aplicar uma gota de 1 mg / ml de fluoresceína de sódio sobre a córnea. Limpe a córnea após 30 seg e examiná-lo sob um microscópio com um filtro azul cobalto para verificar a completa remoção do epitélio.
NOTA: As áreas de córnea com defeitos epiteliais são visualizados em verde.
4. Pós-operação Cuidados
- Coloque o animal em um cobertor de aquecimento e mantê-lo em um lugar seguro (por exemplo, em sua gaiola), enquanto em recuperação. Não manter um animal inconsciente na companhia de os conscientes.
- Aplicar uma pomada oftálmica% eritromicina. Isso também irá prevenir o ressecamento dos olhos. Continuar a aplicação da diária de antibiótico por uma semana.
- Injectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea, após o procedimento e novamente após 12 horas. Continuar a injecção duas vezes por dia durante dois dias.
- Observar o animal durante 30 - 45 min, até a recuperação completa da anestesia.
NOTA: Movimento suave dos músculos respiratórios na superfície ventral indica bem-estar animal enquanto em recuperação.
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Representative Results
Dentro de um mês após a realização desta técnica, 100% das córneas desenvolveram neovascularização superficial (Figura 1A. As fotos foram tiradas com uma câmera conectada a uma lâmpada de fenda sob um campo brilhante e filtro azul cobalto). Em 18/20 (90%) dos olhos, neovascularização envolvida a totalidade da superfície da córnea (Figura 1A). Em 2/20 (10%), a neovascularização foi observada em três dos quatro quadrantes da córnea, mas ainda atingido o centro da córnea.
Para validar o desenvolvimento de LSCD, toda a imunocoloração montagem foi realizada 1. Este passo não é uma parte do protocolo e pode ser alterada dependendo objectivos e interesses. Três variações foram consideradas como indicadores de LSCD: ausência de citoqueratina (CK) 12, um filamento intermediário específico para células epiteliais da córnea normais 17, 18; aparecimento de CK8, um marcador epitélios simples
Normais não lesionados, córneas expressa-ck12 um marcador específico de células epiteliais da córnea maduros 17, 18 -throughout a superfície da córnea, mas que são desprovidas de qualquer CK8 ou células caliciformes (MUC5AC) por parte da córnea de toda a amostra de montagem (Figura 1B) . Em comparação aos olhos normais, expressão ck12 é quase ausente no injur y córneas modelo, enquanto eles mostram significativamente coloração positiva para CK8 e células caliciformes (Figura 1B). Estas observações indicam o desenvolvimento de LSCD.
Se estiver interessado em quantificar os resultados de positividade, o uso da imagem-J para quantificar separadamente 20 densidades imunocoloração sobre as imagens originais, inalteradas tomadas pelo microscópio sob as mesmas configurações. Resumidamente, selecionar a parte da córnea de toda a amostra de montagem, medir a densidade integrada e área para aquela região, e calcular a densidade corrigido para o fundo 20. A proporção de ck12 para densidades Ck8 foram anteriormente apresentados em um maior número de amostras 1. A proporção reduzida em comparação com os controlos (córneas normais) e a aparência de células caliciformes na superfície da córnea demonstrar o desenvolvimento de LSCD.
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Figura 1: Fenótipo da córnea após criar LSCD em camundongos. O exame com lâmpada de fenda, que mostra todas as córneas desenvolver algum grau de neovascularização de um mês (A, Barra de escala: 0,5 mM). A córnea normal expressa ck12 tudo sobre a córnea, mas é desprovido de qualquer CK8 ou células caliciformes (MUC5AC). Ck12 está ausente no modelo LSCD, enquanto CK8 e células caliciformes aparece na córnea (B, Barra de escala: 200? M). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve uma técnica reproduzível e relativamente simples para criar um modelo de mouse LSCD. Há vários aspectos importantes deste modelo que são dignos de nota. Em primeiro lugar, ao contrário dos modelos que usam produtos químicos 11, 12, a lesão envolve primariamente o epitélio de superfície (e membrana basal), com danos mínimos para o estroma corneano subjacente ou para outras estruturas intra-oculares. Assim, existe apenas a inflamação limitada e cicatrizes, ambos os quais podem complicar o processo e torná-lo mais difícil de avaliar os resultados de quaisquer intervenções que visam as células-tronco do limbo. Um recente estudo interessante por Li et al. 10, que compara a utilização da broca rotativa com diferentes combinações de tratamentos cirúrgicos e químicos, também descobriram a rebarba de ser mais seguro e mais eficaz na criação de LSCD em coelhos. Em segundo lugar, o modelo parece ser estável durante pelo menos três meses até 1. A criação deste modelo envolve o uso dea broca rotativa, um instrumento que é familiar para os clínicos que trabalham com a córnea, bem como para aqueles que fazem estudos rato ferimento. Sua vantagem sobre usando uma espátula crua é que a lesão é mais uniforme e reprodutível 1.
Para melhor destruir as células estaminais do limbo, a área de limbo, foi tratada duas vezes. Com base em experiências de trabalho em olhos de rato, o tratamento de mais do que duas rondas frequentemente abrades vasos sanguíneos do limbo e provoca o sangramento. No caso da técnica é usada em outros animais, este passo pode ser modificado dependendo da espessura do epitélio da córnea. Neste estudo, uma ferramenta motorizada com uma ponta da rebarba de 0,5 mm foi utilizada; dicas rebarba em outras formas e tamanhos também estão disponíveis e podem ser utilizados em vez disso, dependendo das especificações da córnea e do tamanho do olho. Li et al. 10 relataram a broca de 2,5 mm para ser adequado para remover consistentemente e epitélios da córnea de coelho limbo.
Para se obter a óptimaresultado, epitélios do limbo e da córnea foram raspada em uma forma circular e foi usado o lado lateral da broca. Para evitar que os pêlos de interferir com a ponta da ferramenta, a queda de povidona-iodo foi espalhada sobre o cabelo em torno do olho, em vez de ser apagado. A ferramenta não deve ser operado estaticamente em um ponto, pois isso pode causar perfuração. Tratar o limbo em um ritmo muito lento pode resultar em sangramento; uma velocidade de quase 6 segundos por rodada é adequado para um olho de rato C57BL / 6J. É fundamental para evitar a re-escovar o estroma nua, pois isso irá induzir mais inflamação e opacificação do estroma. A pressão não deve ser aplicada ao olho para desgastar por abrasão, enquanto o epitélio. Após o procedimento, a córnea foi corada com corante de fluoresceína para se certificar de remoção completa epitelial. É importante evitar a secura ocular durante a recuperação animal. Limitações são que esta técnica não é possível remover 100% das células estaminais. É também um pouco dependente do operador e requer prática para dar coresultados nsistent.
Ao estudar o fenótipo epitelial da córnea, toda a coloração de montagem é a melhor maneira de avaliar o resultado deste modelo. Isto é porque permite que todo o epitélio corneano a ser avaliado ao mesmo tempo, ao passo que secções transversais daria apenas informações sobre cada secção particular.
Esta técnica pode induzir controlável LSCD em ratinhos, e provavelmente em outros animais bem. Ele fornece um modelo adequado de LSCD para estudar novos tratamentos e descobrir aspectos mais amplos da fisiopatologia da doença. Com algumas alterações, pode ser útil no estudo de cicatrização da córnea de feridas, angiogénese, linfangiogénese e bem.
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Acknowledgments
Os autores agradecem Ruth Zelkha, MS, por sua assistência generosa em imagem. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Clínica de Desenvolvimento Scientist Award K12EY021475 para mim, conceder R01 EY024349-01A1 a ARD, EY01792 concessão núcleo do National Eye Institute, NIH, e um donativo incondicional da Pesquisa para prevenir a cegueira. ARD é o destinatário de um Prémio Carreira de Desenvolvimento de Pesquisa para prevenir a cegueira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
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