Summary
Den primære cilium er fundamentalt vigtigt i neural progenitorcelle proliferation, neuronal differentiering, og voksen neuronal funktion. Her beskriver vi en metode til at studere ciliogenesis og handel med signalproteiner til cilia i neurale stamceller / progenitorceller og differentierede neuroner anvender primære neurosfære-kulturer.
Introduction
Den primære cilium er en mikrotubulus-baserede dynamisk subcellulært afsnit, der fungerer som en sensorisk antenne i koordineringen cellulære signalveje, herunder Sonic Hedgehog (Shh) pathway under embryonisk neuronal udvikling 1, 2, og opdelte subcellulære signalering hos voksne neuronal funktion 3, 4 . Signalering komponenter af disse veje såsom Shh receptoren Patched 5; reaktionsvejen aktivator Smoothened (Smo) 6; og Gpr161 7, sjældne G-protein-koblet receptor (GPCR), som negativt regulerer Shh pathway, lokalisere til cilier på en dynamisk måde. Flere GPCR'er er blevet rapporteret at lokalisere til cilia i neuroner i hjernen 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekter i cilier og cilia-genererede signalveje påvirker multiple væv og er kollektivt kendt som ciliopathies 17, 18, 19. Den ciliopathy sygdomsspektrum omfatter ofte neuro defekter, såsom kraniofaciale abnormiteter 20, 21, 22. Desuden primære cilier i hypothalamus neuroner regulerer centrale mæthed veje, og defekter resulterer i det centrale fedme 23, spejling fedme i syndromisk ciliopathies såsom Bardet Biedel syndrom 24. Desuden Neuropeptidreceptoren signalering i cilia regulerer central mæthed veje i 11, 14. Ciliære lokalisering af adenylylcyclase III (ACIII) og GPCR'er såsom somatostatinreceptor 3 i hippocampale neuroner resulterer i hidtil ukendte defekter objekt anerkendelse og hukommelsessvigt 25, 26 og parallel manglende ciliær integritet 27. De udviklingsmæssige aspekter af cilier-genererede signalering er nært knyttet til vævshomeostase; navnlig cilier er vigtige for udviklingen af Shh-undertype medulloblastomer forbindelse granula progenitorer i cerebellum 28, 29. Således primære cilier spille vigtige roller i løbet af embryonale, postnatal og voksne neuronal udvikling og funktion.
Neurale stamceller (NSC) bosiddende i subventrikulære zone (SVZ) af den laterale ventrikel, den subgranulære zone af gyrus dentatus i hippocampus, ogventrikulær zone af den tredje ventrikel i hypothalamus hos pattedyr 30, 31, 32. NSC er multipotente, besidder evnen til selv-fornyelse, og er vigtige for hjernens udvikling og regenerativ medicin 30. De fleste NSC'er i SVZ'en er hvilende og besidde et ensomt primær cilium, at i mange tilfælde strækker ud til den laterale ventrikel 33. De primære cilium signaler via lokaliseringen af forskellige receptorer, inducere nedstrøms cellulære responser, især i forbindelse med Shh, TGFp, og receptortyrosinkinase pathways 2, 34, 35, 36. Idet primære cilier strækker sig ind i laterale ventrikel, antages det primære cilier detektere cytokiner i cerebrospinalvæsken (CSF) for at aktivere NSC'er 37 38, 39, 40, 41. Imidlertid er de mekanismer, ved hvilke CSF kommunikerer med NSC'er og enten primære cilier er involveret er ikke kendt. Adhærente NSC'er i kultur er cilierede; lokalisere Shh pathway komponenter, såsom Smo og Gpr161 i cilia; og er Shh lydhøre 42. Således kan NSC'er tjene som et vigtigt modelsystem til at studere Shh pathway, ciliær handel, og neuronale differentieringsveje. Desuden kan neuroner differentierede fra NSC'er også anvendes til ciliær trafficking assays.
Neurosfærer udgøres af klynger af fritflydende celler i forbindelse med spredning af neural stamceller / progenitorceller, der vokser i nærvær af specifikke vækstfaktorer og ikke-adhæsive overflader 43, 44. Neurosfærer tjener som vigtig in vitro kultur modeller til at studere neurale stamceller / progenitorceller i normal udvikling og sygdom 31, 45, 46, 47. Her beskriver vi en neurosfære-baseret assay til dyrkning neurale stam- / progenitorceller og for differentiering til neuroner / glia. Vi understreger især handel med signalering komponenter til cilia af neurale stam- / progenitorceller og differentierede neuroner (figur 1). I modsætning til dyrkning primære neuroner, primære neurosfærer er forholdsvis let at dyrke, er modtagelige for multiple passager og fryse-tø-cykler, og kan undergå differentiering til neuroner / glia. Vigtigst vi fastslå, at neurosfære-afledte neuralestamceller / progenitorceller og differentierede neuroner cilierede i kultur og lokalisere signalmolekyler relevante for ciliefunktionen i disse rum. Neurosphære-baserede dyrkningsmetoder kan tjene som en ideel model for at studere ciliogenesis og ciliaere handel med NSC'er og differentierede neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering af Neurosfærer fra voksne mus Brain
- Afliv en voksen mus (omkring 2 måneder gammel) med en overdosis af isofluran. Dobbelttjek, at musen er stoppet vejrtrækning og dissekere umiddelbart efter døden.
- Ved hjælp af en saks, lave en midtlinie incision for at åbne kraniet. Fjern hjernen.
- Placer hjernen i koldt PBS i en 10 cm skål på is. Følge hele-mount dissektion metode til at opnå SVZ'en fra den laterale ventrikel 48.
- Placer laterale ventrikel i et 1,5 ml rør, tilsættes 500 pi af 0,05% trypsin-EDTA i PBS og inkuberes røret i 15 minutter ved 37 ° C i et vandbad.
- Efter 15 minutter tilsættes 500 pi standsning medium og forsigtigt pipetteres 20 - 30 gange med en 1 ml spids. Undgå dannelse luftbobler under pipettering.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for cellens overlevelse. - Spin ned cellerne ved 500 xg i 8 min. Supernatanten fjernes, tilsættes 1 ml af PBS og resuspenderes than celler ved forsigtigt at pipettere 5x med en 1 ml spids.
- Spin ned ved 500 x g i 8 min. Supernatanten kasseres under anvendelse af en 1 ml spids og tilsættes 1 ml basalt medium.
- (Valgfrit) Hvis der observeres cellerester, passerer cellerne gennem en 70 um celle-si.
- Tæl antallet af celler med en hæmocytometer; i almindelighed omkring 30.000 - Der opnås 60.000 celler / SVZ.
- Plate cellerne fra en SVZ i en 10 cm skål med 10 ml NSC-medium og dyrkning ved 37 ° C med 5% CO2.
- (Valgfrit) For at undgå fusion mellem kugler 49, løber 1000 celler i en enkelt brønd i en ultra-low-binding 6-brønds plade, der på forhånd er fyldt med 1,5 ml NSC-medium og dyrkning ved 37 ° C med 5% CO2.
BEMÆRK: Efter 5-7 dage, neurosfærer kan observeres (figur 2A). Dyrkningsperioden kan afvige med en alder af musen eller genetisk baggrund. - Tilsæt 2 ml af NSC medium hver 3-4 dage for at opretholde kulturen(Ikke fjerne den eksisterende medium).
2. Analyse af Differentiering Kapacitet Neurosfærer og Ciliogenesis Tests
- At analysere differentieringskapacitet, analysere neurosfærerne under adhærente forhold i differentieringsmedium.
- Sterilisere 12 mm runde dækglas ved autoklavering eller med UV-eksponering før anvendelse. For en adhærerende cellekultur, sætte en steriliseret 12 mm runde dækglas i en brønd i en plade med 24 brønde under aseptiske betingelser.
- Coat dækglasset i 10 s med 500 pi af 0,002% poly-L-lysin (PLL). Aspirer opløsningen og tørre det i 10-15 min.
- Tilsæt 500 pi af laminin opløsning (5 ug / pi). Inkubere dækglasset i 1 time ved 37 ° C.
- Aspirer laminin og tilsæt 500 pi differentieringsmedium eller NSC medium (udifferentierede kontrol).
- Til differentiering assay afhente en 100 - 200 um kugle med en 200 pi spids under mikroskopet. Tilføje5-10 neurosfærer til hver brønd i en 24-brønds plade og dyrkning i 7-10 dage i differentieringsmedium.
- At analysere udifferentierede neurosfærer, tilsæt 5-10 neurosfærer til hver brønd i en 24-brønds plade og dyrkning i 1-2 dage i NSC medium. Vedhæftede neurosfærer sprede sig og vokse som et monolag (figur 2B).
- Efter forsigtig fjernelse af mediet, fikseres cellerne med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur, og derefter vaske med PBS to gange i 5 minutter ved stuetemperatur. Pladen kan opbevares ved 4 ° C i 1-2 måneder.
BEMÆRK: For at visualisere neurale stamceller / progenitorceller i NSC medium og differentierede celler i differentieringsmedium, udføre immunofarvning mod nestin (neurale stam- / progenitorcelle markør), β-tubulin III (TUJ1 monoklonale, neuronal markør), GFAP (glial fibrillært surt protein , astrocyt markør), og O4 (oligodendrocyt-markør) (figur 2B-E). For at analysere cilier, udføre immunfarvning mod Arl13b (primær cilia markør) og Gpr161 (ciliær GPCR) (figur 3). - Montere dækglasset med montering opløsning på et objektglas. Vip objektglasset for at fjerne overskydende opløsning.
3. Analyse af Ciliogenesis i Neurosfærer
- At analysere celler i intakte neurosfærer ved immunfarvning overføres 1 ml dyrkningsmedium, der indeholder flere neurosfærer til et 1,5 ml rør og spin ned ved 500 x g i 8 min. Fastgør kugler med 4% (PFA) efter fjernelse af mediet i 15 minutter og vaskes med PBS. Spin ned kugler ved 500 xg i 8 minutter, fjern supernatanten og inkubere kuglerne O / N med 30% saccharose ved 4 ° C.
- Supernatanten kasseres under anvendelse af en 1 ml spids og tilsæt 500 pi OLT opløsning under anvendelse af en cut 1 ml spids. Skære kanten af spidsen for at udvide åbningen, som OLT viskøs.
- Overfør OLT opløsning indeholdende neurosfærerne i en engangs plastik frysning formen (10 mm x 10 mm x 5 mm).
- Frys mgamle på tøris i mindst 15 minutter.
- (Valgfrit) Stop eksperimentet og opbevar formen i en -80 ° C fryser i op til 1 år.
- Skær sektioner med en kryostat; tykkelsen af afsnit bør være 15-30 um.
- At visualisere det primære cilier i en neurosfære, udføre immunofarvning mod Arl13b (figur 4).
4. Kultur og Passage af Neurosfærer og Tilhænger NSC'er
- Passage neurosfærerne mens kuglen størrelse er mellem 100-200 um; når neurosfærerne er for stor (300 um eller derover), er de ikke ideelle til eksperimenter.
- Overfør neurosfærerne i et 50 ml rør ved anvendelse af en 1 ml spids og spin ned ved 500 x g i 8 min.
- Supernatanten kasseres under anvendelse af en aspirator, tilsættes 500 pi af 0,05% trypsin-EDTA i PBS og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Mængden af trypsin varierer afhængigt af antallet af kugler.
- Tilsæt 500 pi af serum medium og forsigtigt rørt 20 gange med en 1 ml spids.
- Spin ned ved 500 x g i 8 min. Supernatanten kasseres under anvendelse af en 1 ml spids og tilsættes 1 ml basalt medium.
- (Valgfrit) Hvis cellulær debris eller udissocierede neurosfærer set, passerer cellerne gennem en 70 um celle-si.
- Passage cellerne i en 10 cm skål med en tæthed på 10.000 celler / cm2 i NSC medium; cellerne vil være klar til den næste passage efter en uge.
- (Valgfrit) fryse cellerne, tilsættes frysemedium at generere 500.000 til 1.000.000 celler / ml suspension. Fryse cellerne under anvendelse kryo-frysning beholdere; udissocierede neurosfærer kan også fryses.
- For det vedhængende kultur, dillute cellerne til 50.000 celler / cm2 på PLL- og laminin-overtrukne dækglas med NSC medium og kultur i 1-2 dage.
5. Starvation og analyse af Cilia
- Forberede udsultningsmedium (tabel 1).
- 1-2 dage efter den indledende plating af adhærente celler efter dissociation, skift til NSC medium i én brønd (kontrol) og udsultningsmedium i en anden brønd (eksperiment).
- Kultur de adhærerende celler i 24 timer.
- Fikseres cellerne med 4% PFA i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur og vaskes to gange med PBS i 5 minutter hver ved stuetemperatur.
- (Valgfrit) Stop eksperimentet og lagre de 24-brønds plader med dækglas i PBS ved 4 ° C i 1-2 måneder.
- Udfør en immunofluorescens protokol til farvning 7, 50.
- Montere dækglassene ved hjælp monterings opløsning. Tør objektglasset O / N ved stuetemperatur i mørke.
- Erhverve billeder på en forbindelse mikroskop ved den nødvendige forstørrelse. Brug et mikroskop, et kamera, og mål (40X / 1,3 olie og 63X / 1.4 olie), der kontrolleres ved hjælp af den ledsaget software. Træffe tilstrækkelige z-sektioner på 0,5-0,8 um intervaller (figur 5).
- Til kvantitativ analyse af ciliær lokalisering iadhærerende celler erhverver stakke af billeder fra 3-8 konsekutive felter med sammenflydende celler ved at kigge ind i DAPI kanal. Kvantificere antallet af primære cilier anvendelse ImageJ / Fiji. Typisk bruge "Celletæller" værktøj i ImageJ Plugins> Analysere dialogboksen at tælle cellerne med GPCR-positiv cilier; maksimal fremskrivninger fra stakke af billeder kan også eksporteres fra ImageJ / Fiji.Use lignende billede intensitet og kontrast parametre for alle billeder fra samme eksperiment for optælling og eksporterende formål.
6. Transfektion af Neurosfærer
- Overholde dissocierede celler til dækglas i 24 timer. Brug en celledensitet typisk mellem 75.000 og 150.000 celler i 500 pi NSC medium i en enkelt brønd i en plade med 24 brønde.
- Bland 25 pi af reduceret serummedium og 1,5 pi transfektionsreagens i et 0,5 ml mikrorør ved hvirvelbehandling i 5 s.
- Tilføje 2,5 ug af endotoksin-frit plasmid-DNA til en separat 0,5 ml microtube indeholdende 25 pi af reducerede serum medier og blandes ved vortex i 5 s.
- Tilsæt 1 pi af transfektionsreagens til den anden mikrorør indeholdende DNA og bland ved vortex i 5 s.
- Tilsæt blandingen fra DNA-holdige rør til den første mikrorør og blandes ved pipettering.
- Inkuber blandingen i 10-15 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation forsigtigt tilføje transfektionsblandingen dråbevis til brøndene på toppen af NSC medium (500 pi / brønd).
- Ændre mediet 24 timer efter transfektion til kontrolmedium (NSC-medium) eller udsultningsmedium (500 pi / brønd).
- Fikseres cellerne ved at ændre mediet til 4% PFA efter 24 timer og udføre immunfarvning; typisk op til en 10% transfektionseffektivitet opnås ved anvendelse af denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter udpladning af cellerne fra SVZ i NSC medium i en uge, blev de flydende neurosfærer observeret (figur 2A). Størrelserne af kuglerne varierede mellem 50 og 200 um. At undersøge, om kuglerne blev afledt fra neurale stamceller / progenitorceller, blev neurosfærerne udpladet på PLL- og laminin-overtrukne dækglas i NSC medium i 2 dage. De blev derefter immunfarvet mod neurale stam- / progenitorcelle markering, nestin. To dage var nødvendige for at tillade i områder til tillægger dækglas og at vokse som et monolag af celler. Monolaget af celler var positive for nestin (figur 2B). At undersøge differentieringen kapacitet neurosfærerne, vi belagt dem følge trinene i afsnit 2 på PLL- og laminin-overtrukne dækglas i differentiering medium uden dissociation i 7-10 dage. Det tager mindst en uge til differentiering. De neurosfærer knyttet til dækglas og udvideed til at vokse som et monolag af celler. Vi fastsat cellerne og immunfarvet mod neuron, astrocyt, og oligodendrocytmarkører. Vi observerede adhærente neurosfærer der differentieret i β-tubulin III-positive neuroner, GFAP-positive astrocytter, og O4-positive oligodendrocytter (figur 2C-E). Således kan multipotente neurosfærer afledes fra voksne mus SVZ.
At afgøre, om adhærente neurosfærer og differentierede neuroner har primære cilier, vi immunfarvet imod Arl13b (primær cilium markør) 51 og Gpr161 (ciliær-lokaliseret GPCR) 7. Det er vores erfaring, i tilgængelige musemodeller, der udtrykker ARL13B-mCherry, og i studier med at udvikle mus cortex, de fleste (hvis ikke alle) neuronal cilier i hjernen udtrykker Arl13b, mens alle neuroner ikke er ACIII-positiv 52, 53, 54. Thus, vi hovedsagelig afhænge af Arl13b at opdage neuronal cilier. Vi har registreret primære cilier og lokaliseringen af Gpr161 til cilia af progenitorceller i adhærerede neurosfærer (figur 3A) og i differentierede neuroner (figur 3B). Således er adhærente neurosfærer og differentierede afstamninger cilierede i kultur og lokalisere signalmolekyler.
At bestemme, om flydende neurosfærer har primære cilier, vi cryosectioned flydende neurosfærer efter fiksering som beskrevet i afsnit 3. Vi observerede primære cilier i neurale stamceller / progenitorceller i sektioneret neurosfærer (Figur 4A-B). Det er vigtigt at erhverve z-sektioner tværs af neurosfærer til fuldt ud at visualisere primære cilier, fordi det er svært at undersøge den primære cilier i et enkelt z-planet. Sammenfattende udifferentierede neurosfærer har heterogene populationer af cilierede og ikke-cilierede celler.
(figur 5A-B). Desuden har vi bemærket et forøget antal Gpr161-positive cilier ved sult (% Gpr161-positive cilier / Arl13b-positive cilier) (figur 5A-B). Interessant, en tidligere undersøgelse under anvendelse af udifferentierede humane embryonale stamcellelinjer vist, at humane embryonale stamceller i kultur også besidder primære cilier 55. Antallet og længden af cilier stigning ved serum-udsultning i disse cellelinier, og disse cilier besidder også komponenter af Shh maskiner.
Transficerede vi også vedhængende neural stam- / progenitoR-celler, som beskrevet i afsnit 6. påvises typisk Vi en transfektionseffektivitet på op til 10%, svarende til primære neuronkulturer i laboratoriet (figur 6).
| Løsning | Komponent |
| 1x PBS | Fortynd 10x PBS med autoklaveret vand |
| NSC medium | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100x N2 | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF-basic (human bFGF) (stamopløsning 25 ng / ml i Neurobasal medium): 20 ng / ml eller 2 mg total for 100 ml medier | |
| EGF (Stamopløsning 25 ng / ml i Neurobasal medium): 20 ng / ml eller 2 mg total for 100 ml medier | |
| 95 ml basalmedium | |
| Human FGF-basic (human bFGF) | 1 ml basalt medium til kommercielt humant bFGF 25 ug flaske |
| Opbevares i sterile mikrorør i -20 ° C eller lavere. Bruge en enkelt 80 pi aliquot eller 2 ug / 100 ml NSC medier. | |
| EGF | Tilsæt 8 ml basalt medium til kommerciel EGF 20 ug flaske |
| Opbevares som sterile mikrorør i -20 ° C eller lavere. Bruge en enkelt 80 ug portion / 100 ml medier. | |
| Stop medium | 1 ml FBS |
| 75 U Dnase I (75 U / ul i PBS) | |
| 9 ml PBS | |
| Serum medium | 1 ml FBS |
| 9 ml Basalmedium | |
| nedfrysning medium | 4 ml DMSO |
| 24 ml basalmedium | |
| 12 ml 30% FBS | |
| Differentiering medium | 90 ml basalmedium |
| 5 ml 5% FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF-basic (human bFGF) (Stock opløsning af 25 ng / ml i Neurobasal medium): 10 ng / ml eller 1 mg total for 100 ml | |
| sult medium | 95 ml basalmedium |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tabel 1: Opskrift af løsninger.
ve_content" fo: keep-together.within-side = "1">
Figur 1: Skematisk diagram af neurosfære Kultur og Differentiation protokoller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Neurosfærer Exhibit Differentiering Kapacitet. (A) Repræsentative neurosfærer er vist. (B) Neurosfærer blev udpladet på PLL- og laminin-overtrukne dækglas i NSC medium i 2 dage og blev immunofarvet mod nestin (neurale stam- / progenitorcelle markør). (CE) Neurosfærer blev udpladet følge trinene skitseret i afsnit 2 på PLL- og laminin-overtrukne dækglas i differentieringsmedium i 7 dage without dissociation; fast; og immunofarvet mod β-tubulin III (neuronal markør), GFAP (astrocyt markør), og O4 (oligodendrocyt-markør). Kernerne blev farvet ved DAPI. Målestok = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Neurosfærer og neuroner i Adhærente differentierede Neurosfærer er cilierede. (A) udissocierede neurosfærer blev udpladet på overtrukne dækglas i NSC medium for 2 d; fast; og immunofarvet mod Gpr161 (grøn), Arl13b (rød), og DNA (blå). (B) Differentierede neuroner blev immunfarvet mod Gpr161 (grøn), Arl13b (rød, A) eller β-tubulin III (rød, B), og DNA (blå). Hvide pile angiver Gpr161 lokalisering i cilier.De højre paneler i (A) er forstørrede billeder af den primære cilium angivet ved den hvide pil. Den Gpr161-positive cilium ved hvid-boxed neuron er vist til højre i (B). Skala = 10 um (A); 50 pm (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Flydende, ikke-differentieret Neurosfærer Besidder fimreceller. Flydende neurosfærer blev fikseret, indlejret i OCT, cryosectioned, og forarbejdet til immunofluorescens mod Arl13b (rød) og DNA. Arl13b-positive primære cilier i en neurosfære er vist. Panelet i (A) er en maksimal intensitet projektion af 14 z-sektioner 0.8 um intervaller fra en neurosfære. Panelerne i (B) viser den forstørrede visning af ciliated celler i den hvide indrammede område i (A). Den maksimale projektion billede fra alle z-sektioner er vist som en stak, mens tallene 1 til 14 angiver individuelle z-sektioner. De hvide pile angiver primære cilier. Målestok = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Starvation inducerer Ciliogenesis i dissocierede Adhærente neural stam- / progenitorceller. (A) Dissocierede celler blev udpladet på overtrukne dækglas i NSC medium eller sult medium i 24 timer; fast; og immunofarvet mod Gpr161 (grøn), Arl13b (rød), og DNA (blå). Gpr161-positive cilier observeres i kontrol (venstre) og sultet (højre) celler. De nedre paneler er forstørrede billeder af de angivne hvide kasser i de respektiveøverste paneler. De hvide pile og pilespidser angiver Gpr161-positiv og -negativ cilier hhv. Målestok = 100 um. (B) Kvantificering af Arl13b-positive cilierede celler (venstre graf) og Gpr161 lokaliseres i Arl13b-positive cilier (højre graf) i kontrol og udsultede celler. Procentdelene af både Arl13b-positive cilierede celler og Gpr161 lokaliseres i Arl13b-positive cilier forøget ved sult. Kvantificeringen blev udført fra to synsfelter hver fra to tekniske gentagelser af et enkelt eksperiment. Dataene er vist som middelværdien fra alle 4 synsfelter ± standardafvigelsen. *, P <0,05; **, P <0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Transfektion iDissocierede Adhærente neurale stam- / progenitorceller. Dissocierede celler udpladet på overtrukne dækglas blev transficeret med en LAP-TULP3 N-terminus (1-183 aa) MUT12 konstruktion, der ikke binder til kernen IFT-En sammensat 56. Mediet blev ændret til udsultningsmedium 24 timer efter transfektion. Cellerne blev fikseret efter 24 timer og immunfarvet mod GFP (grønt), Gpr161 (rød), Arl13b (magenta) og DNA (blå). En transficeret celle med Gpr161- og Arl13b-positive cilium er markeret med en hvid pil, mens en transficeret celle uden cilier er vist med en hvid pilespids. Gule pile og pilespidser peger på utransficerede celler med eller uden Gpr161 / Arl13b hhv. Skalasøjle = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en metode til at generere og vedligeholde neurosfære kulturer fra voksne mus SVZ. Et par relevante punkter vedrørende kulturerne er som følger. Første størrelserne af kuglerne er typisk mellem 50 - 200 um. Det er vores erfaring, når en neurosfære bliver større end 300 um i diameter, har det optimale tidspunkt for passage været savnet. Disse større kugler indeholder døde celler i kernen. Sekund, som neurosfærer er almindeligt anvendt til at studere neurale stamceller / progenitorceller, er det vigtigt at anvende EGF og FGF-basic (bFGF) for at bibeholde stemness af disse celler. Derfor faktorer, der inducerer differentiering, såsom FBS, skal undgås under opretholdelse af neurosfærerne. Det er blevet vist, at 10% FBS kan skelne neurosfærer i astrocytter 47. For det tredje kan graden af neuronal differentiering afhænge af alderen af musen. Hvis man ønsker mere neuronal differentiering fra neurosfærer, yngre mus (postnatal day 0) kan anvendes. For det fjerde, hvis du starter nye kulturer, er det altid godt at undersøge differentiering kapacitet af neurosfærer. Femte, vores metode giver også mulighed for nedfrysning og optøning fra etablerede neurosfære-kulturer til fremtidig eksperimenterende brug. Efter optøning celler typisk vokse som adhærente spindelformede celler uden poly-L-lysin eller laminin. Dette kan være forårsaget af fryse-tø skader på cellerne. Det er vigtigt at holde cellerne vokser indtil de bliver 60 - med 80% sammenflydende før passage. Efter passagen, celler typisk vokse som neurosfærer og kan generelt passeres op til 5 - 10 gange.
Neurosfære-baserede dyrkningsmetoder tillade os at studere ciliær handel og signalveje i neurale stam- / progenitorceller og differentierede neuroner. Vi undersøgte primære cilier i flydende / vedhængende og differentierede neurosfærer. Det er vigtigt at erhverve flere z-sektioner for at visualisere cilier i hele det fulde omfang af neurosfærer. Endvidere agterare generering adhærente kulturer af disse neurosfærer, og udsulte dem i 24 timer, er de fleste af cellerne cilierede (figur 5) og beriget i sjældne GPCR, Gpr161. Imidlertid langvarig udsultning af de adhærerende kulturer resulterer i subcellulære vakuolære strukturer. Således er det vigtigt nøje at optimere sult perioder for særlige forsøg.
I øjeblikket er undersøgelser af ciliogenesis overvejende udført i et par cilierede, immortaliserede cellelinier 57. Disse cellelinier ikke altid trofast rekapitulere neuroner og neurale stamceller / progenitorceller i at udtrykke signaling komponenter, såsom GPCR'er eller Shh pathway maskiner, hvilket gør det bydende nødvendigt at udvikle nyere metoder til at studere rollen af cilier i biologiske processer. De neurosfære-baserede fremgangsmåder beskrevet her tillader os at studere cilia-regulerede cellulære veje, herunder GPCR og Shh-signalering i forbindelse med neurale stam- / progenitorceller og differentiated neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G.
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
