Summary
Das primäre cilium ist von fundamentaler Bedeutung in neuralen Vorläuferzellproliferation, die neuronale Differenzierung, und adulten neuronalen Funktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren ciliogenesis und den Handel mit Signalproteinen zu Zilien in neuralen Stamm- / Progenitorzellen und differenzieren Neuronen unter Verwendung von primären Kulturen Neurosphäre zu studieren.
Introduction
Das primäre cilium ist ein Mikrotubulus-basierte dynamischer subzellulären Kompartiment, das als sensorische Antenne in zellulären Signalweg koordinierenden, einschließlich der Sonic Hedgehog (Shh) -Weg während der embryonalen neuronalen Entwicklung 1, 2 und compartmentalized subzellulären Signalgebung in adulten neuronalen Funktion 3, 4 . Signalisierungs Komponenten dieser Wege, wie der Shh - Rezeptor 5 Patched; der Weg Aktivator Smoothened (Smo) 6; und Gpr161 7 ein Orphan - G - Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) , die sich negativ auf die Shh - Weg reguliert, lokalisieren Zilien in einer dynamischen Art und Weise. Multiple GPCRs wurde auf die Zilien in Neuronen im Gehirn 7, 8, 9, 10 lokalisieren berichtet sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekte in Cilien und Zilien generierte Signalwege beeinflussen multiple Gewebe und werden als Ziliopathien 17, 18, 19 gemeinsam bekannt. Das Ziliopathie Krankheitsspektrum umfasst häufig die Entwicklung des Nervenstörung, wie kraniofazialen Anomalien 20, 21, 22. Außerdem regulieren primären Zilien in hypothalamischen Neuronen zentralen Sättigungswege und führen Defekte in 23 zentrale Fettleibigkeit, Übergewicht in syndromic Ziliopathien wie Bardet Biedel Syndrom 24 Spiegelung. Zusätzlich Signalisierungsneuropeptid-Rezeptor in Cilien reguliert central Sättigungsweg 11, 14. Ciliary Lokalisierung von Adenylylcyclase III (ACIII) und GPCRs wie Somatostatin - Rezeptor 3 in Hippokampus - Neuronen führt in neuartigen Objekterkennungsfehlern und Gedächtnisdefiziten 25, 26 und verläuft parallel einen Mangel an Integrität ciliary 27. Die Entwicklungsaspekte der Zilien-generated-Signalisierung sind eng mit Gewebshomöostase gebunden; insbesondere sind Zilien wichtig für die Progression von Shh-Subtyp Medulloblastom aus Granulat Vorläufern im Cerebellum 28, 29 entstehen. So spielen primäre Zilien eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, nach der Geburt, und adulter neuronaler Entwicklung und Funktion.
Neuronale Stammzellen (NSC) befinden sich in der Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel, die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und derventrikulären Zone des dritten Ventrikels im Hypothalamus bei Säugetieren 30, 31, 32. NSCs sind multipotent , besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind wichtig für die Entwicklung des Gehirns und der regenerativen Medizin 30. Die meisten NSC in dem SVZ sind ruhende und besitzen ein einsames primäres cilium , die, in vielen Fällen 33 an den lateralen Ventrikel erstreckt. Die primären cilium Signale über die Lokalisierung der verschiedenen Rezeptoren, nachgeschaltete zelluläre Antworten zu induzieren, insbesondere in Bezug auf Shh, TGFß, und Rezeptor - Tyrosin - Kinase - Wege 2, 34, 35, 36. Da primäre Zilien in die lateralen Ventrikel erstrecken, wird die Hypothese aufgestellt , dass die primären Zilien Cytokine in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) erfassen , 37 zu aktivieren NSC 38, 39, 40, 41. Jedoch kommuniziert die Mechanismen, durch die CSF mit NSC und ob primäre Zilien beteiligt sind, sind nicht bekannt. Adhärenten NSCs in Kultur sind bewimpert; Shh Stoffwechselweg Komponenten wie Smo und Gpr161 in Cilien lokalisieren; und Shh reaktions 42. Somit kann NSC als wichtiges Modellsystem dienen der Shh Stoffwechselweg, ciliary Handel und neuronalen Differenzierungswege zu untersuchen. Darüber hinaus von NSCs differenzierten Neuronen können auch für ciliare Handels-Assays verwendet werden.
Neurosphären werden von Clustern von frei schwebenden Zellen gebildet aus der Proliferation von NEURA ergebendenl Stammzellen / Vorläuferzellen , die in Anwesenheit von spezifischen Wachstumsfaktoren und nicht klebender Oberflächen 43, 44 wachsen. Neurospheres dient in vitro Kulturmodellen als wichtiges neuralen Stamm- / Vorläuferzellen in der normalen Entwicklung und Krankheit 31, 45, 46, 47 zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Neurosphäre basierende Assay zur Kultivierung von neuralen Stamm- / Vorläuferzellen und zur Differenzierung zu Neuronen / Glia. Wir betonen , insbesondere den Handel mit Komponenten Zilien neuraler Stammzellen / Vorläuferzellen und differenziert Neuronen (Figur 1) signalisiert. Im Gegensatz zu primären Neuronen Kulti, sind primäre Neurosphären relativ leicht zu Kultur, zugänglich sind, um mehrere Durchgänge und Gefrier-Auftau-Zyklen, und die Differenzierung zu Neuronen / Glia eingehen können. Wichtig ist, stellten wir fest, dass die Neurosphäre abgeleiteten neuralenStamm- / Progenitorzellen und differenzierte Neuronen in Kultur bewimpert und lokalisieren Moleküle relevant Zilienfunktion in diesen Kompartimenten Signalisierung. Neurosphere Basis Kultivierungsverfahren kann als ein ideales Modellsystem dienen zur Untersuchung von ciliogenesis und ciliare Handel in NSCs und differenzierten Neuronen.
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Protocol
1. Isolierung von Neurosphären aus der erwachsenen Maus-Gehirn
- Euthanize einen erwachsenen Maus (etwa 2 Monate alt) durch eine Überdosis Isofluran. Doppelklicken Sie sicher, dass die Maus Atmung und seziert unmittelbar nach dem Tod gestoppt hat.
- Mit einer Schere, machen Sie einen Mittellinienschnitt, den Schädel zu öffnen. Entfernen Sie das Gehirn.
- Legen Sie das Gehirn in kaltem PBS in einer 10 cm Schale auf Eis. Folgen Sie der whole-mount Dissektion Methode 48 die SVZ von der lateralen Ventrikel zu erhalten.
- Platzieren Sie den lateralen Ventrikel in ein 1,5 ml-Röhrchen, 500 & mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA in PBS, und inkubieren das Röhrchen für 15 min bei 37 ° C in einem Wasserbad.
- Nach 15 min, 500 & mgr; l Stoppmedium und pipettieren sanft 20 - 30 mal mit einer 1 ml-Spitze. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren zu bilden.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben der Zelle. - Spin down die Zellen bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen, 1 ml PBS und Resuspendieren ter Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 5 x 1 ml-Spitze.
- Spin down bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von 1 mL Basalmedium.
- (Optional) Falls Zelldebris beobachtet werden, passiert die Zellen durch eine 70 & mgr; m-Sieb-Zelle.
- Zähle die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer; in der Regel etwa 30.000 - 60.000 Zellen / SVZ erhalten.
- Platte , die die Zellen von einem SVZ in eine 10 - cm - Schale mit 10 ml NSC Medium und die Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- (Optional) Fusion zwischen 49 Kugeln zu vermeiden, setzte 1.000 Zellen in einer einzelnen Vertiefung einer Ultra-Low-bindenden 6-Well - Platte , die mit 1,5 ml NSC Medium und die Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2 vorbefüllt ist.
HINWEIS: Nach 5-7 Tagen können Neurosphären (2A) beobachtet werden. Die Kultivierungszeit kann mit dem Alter der Maus oder dem genetischen Hintergrund unterscheiden. - In 2 ml NSC Medium alle 3-4 Tage, um die Kultur zu pflegen(Nicht entfernt das vorhandene Medium).
2. Analyse der Differenzierungskapazität von Neurosphären und Ciliogenesis Tests
- Um die Differenzierungsfähigkeit zu analysieren, analysiert die Neurosphären unter adhärenten Bedingungen in Differenzierungsmedium.
- Sterilisieren 12 mm runde Deckgläser durch Autoklavierung oder mit UV-Exposition vor der Verwendung. Für eine adhärente Zellkultur, legte ein sterilisiertes 12 mm rundes Deckglas in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen unter aseptischen Bedingungen.
- Coat das Deckglas für 10 s mit 500 ul 0,002% Poly-L-lysin (PLL). Aspirieren die Lösung und trocknen Sie es für 10-15 min.
- In 500 ul Laminin-Lösung (5 ug / ul). Inkubieren des Deckglases für 1 h bei 37 ° C.
- Absaugen Laminin und füge 500 ul Differenzierungsmedium oder NSC Medium (undifferenzierte Kontrolle).
- Für die Differenzierung Assay, Pick-up eine 100 bis 200 & mgr; m-Kugel mit einer 200 & mgr; l Spitze unter dem Mikroskop. Hinzufügen5-10 Neurosphären zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Kultur für 7-10 Tage in Differenzierungsmedium.
- Zur Analyse undifferenzierten Neurospheres, fügen 5-10 Neurosphären zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Kultur für 1-2 Tage in Medium NSC. Befestigt Neurosphären ausbreiten und wachsen als Monoschicht (2B).
- Nach vorsichtigem Entfernen des Mediums, fixiert die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min bei RT und dann mit PBS wäscht zweimal für 5 min bei RT. Die Platte kann bei 4 ° C für 1-2 Monate gelagert werden.
HINWEIS: Neuronale Stammzellen / Vorläuferzellen in NSC Medium und differenzierten Zellen in Differenzierungsmedium zu visualisieren, führt Immunofärbung gegen Nestin (neurale Stammzellen / Vorläuferzellmarker), β-Tubulin III (TuJ1 monoclonal, neuronaler Marker), GFAP (saures Gliafaserprotein , Astrozyten - Marker) und O4 (Oligodendrozyten - Marker) (2B-E). Zur Analyse der Zilien, führen Immunofärbung gegen Arl13b (primäre cilia marker) und Gpr161 (ciliary GPCR) (Abbildung 3). - Montieren Sie das Deckglas mit der Lösung auf ein Objektglas montieren. Kippen Sie den Glasobjektträger überschüssige Lösung zu entfernen.
3. Analyse von Ciliogenesis in Neurosphären
- Um Zellen in intakten Neurosphären durch Immunfärbung, 1 ml des Kultivierungsmediums, enthaltend mehrere Neurosphären in ein 1,5 ml-Röhrchen und Abschalten bei 500 · g für 8 min zu analysieren. Fix die Kugeln mit 4% (PFA), nachdem das Medium für 15 min entfernt und waschen mit PBS. Spin-Down-Kugeln bei 500 · g für 8 min, Überstand entfernen, und Inkubieren der Kugeln O / N mit 30% Saccharose bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze verwendet, und fügen 500 ul der OCT-Lösung mit einer 1 ml cut Spitze verwendet wird. Schneiden Sie die Kante der Spitze um die Öffnung zu erweitern, wie Oktober viskos ist.
- Überträgt die OAT Lösung, die die Neurosphären in eine Einweg-Kunststoff-Gefrierform enthält (10 mm x 10 mm x 5 mm).
- Frieren Sie das malt auf Trockeneis für 15 Minuten mindestens.
- (Optional) Stoppen Sie das Experiment und speichern Sie die Form in einer -80 ° C Gefrierschrank für bis zu 1 Jahr.
- Schneiden Sie die Abschnitte mit einem Kryostaten; die Dicke der Abschnitte sollten 15-30 um betragen.
- Um die primären Zilien in einer Neurosphäre zu visualisieren, führt Immunofärbung gegen Arl13b (Abbildung 4).
4. Kultur und Passage von Neurosphären und Adherent NSCs
- Passage der Neurosphären, während die Kugelgröße zwischen 100-200 & mgr; m ist; wenn die Neurosphären zu groß sind (300 & mgr; m oder darüber), sind sie für Experimente nicht ideal.
- Übertragen der Neurosphären in ein 50 ml-Röhrchen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von Spin-Down bei 500 · g für 8 min.
- Überstand verwirft einen Sauggebläses verwendet, 500 & mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA in PBS und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Die Menge an Trypsin, variiert in Abhängigkeit von der Anzahl der Kugeln.
- Fügen 500 ul Serummedium und sanft Rohrt 20-mal mit einer 1 ml-Spitze.
- Spin down bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von 1 mL Basalmedium.
- (Optional) Falls Zelldebris oder undissoziierten Neurosphären zu sehen sind, übergeben Sie die Zellen durch ein 70 & mgr; m-Sieb-Zelle.
- Passage der Zellen in einer 10 cm - Schale in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 in NSC Medium; die Zellen werden für den nächsten Durchgang nach einer Woche fertig sein.
- (Optional) um die Zellen gefrieren, fügt Medium Einfrieren 500.000 bis 1.000.000 Zellen / ml-Suspension zu erzeugen. Einfrieren der Zellen unter Verwendung von Kryo-Gefrierbehältern; undissoziiertes Neurosphären können auch eingefroren werden.
- Für die adhärente Kultur, dillute um die Zellen zu 50.000 Zellen / cm 2 auf PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser mit NSC Medium und die Kultur für 1-2 Tage.
5. Starvation und Analyse von Cilia
- Bereiten Hungermedium (Tabelle 1).
- 1-2 Tage nach der ersten plating adhärenter Zellen nach dem Dissoziation Änderung NSC Medium in einer Vertiefung (Kontrolle) und Hungermedium in einer anderen Vertiefung (Versuch).
- Kultur der anhaftenden Zellen für 24 h.
- Fix die Zellen mit 4% PFA in PBS für 15 min bei RT und wäscht zweimal mit PBS für jeweils 5 min bei RT.
- (Optional) Stoppen des Experiments und speichert die 24-Well-Platten mit Deckgläschen in PBS bei 4 ° C für 1-2 Monate.
- Führen Sie ein Immunofluoreszenz - Protokoll zum Färben von 7, 50.
- Montieren Sie die Deckgläser mit Befestigungslösung. Trocknen Sie die Gleitglas O / N bei RT im Dunkeln.
- Erwerben von Bildern auf einem zusammengesetzten Mikroskop bei der notwendigen Vergrößerung. Verwenden, um ein Mikroskop, eine Kamera und Ziele (40X / 63X 1.3 Öl und / 1,4-Öl), gesteuert, um die Software begleitet. Nehmen ausreichende z Schnitte an 0,5-0,8 & mgr; m Intervallen (Abbildung 5).
- Für die quantitative Analyse der Lokalisierung in ciliaryadhärenten Zellen erwerben Stapel von Bildern 3-8 aufeinanderfolgende Felder mit konfluenten Zellen durch Tauchen in die DAPI Kanal suchen. Quantifizierung der Anzahl der primären Zilien mit ImageJ / Fiji. Typischerweise nutzen das „Zellenzähler“ Werkzeug in der ImageJ Plugins> Analysieren Dialogfeld die Zellen mit GPCR-positiven Zilien zu zählen; maximale Projektionen aus Stapeln von Bildern kann auch aus ImageJ / Fiji.Use ähnlicher Bildintensität und Kontrastparameter für alle Bilder aus dem gleichen Experiment zum Zählen und Exportieren Zwecke exportiert werden.
6. Transfektion von Neurosphären
- Adhere dissoziierten Zellen auf Deckgläser für 24 h. Verwenden, um eine Zelldichte typischerweise zwischen 75.000 und 150.000 Zellen in 500 ul Medium NSC in einem einzigen Well einer 24-Well-Platte.
- Mischen 25 ul reduzierten Serummedium und 1,5 ul Transfektionsreagenz in ein 0,5 ml Mikroröhrchen durch Vortexen für 5 s.
- Hinzufügen 2,5 ug Endotoxin-freie Plasmid-DNA mit einer getrennten 0,5 ml microtube 25 ul reduziert Serum enthaltenden Medien und mische für 5 s durch Vortexen.
- 1 & mgr; l Transfektionsreagenz an dem zweiten Mikroröhrchen, enthaltend DNA und mischt für 5 s durch Vortexen.
- Fügen Sie die Mischung aus dem DNA-enthaltenden Rohr mit dem ersten Mikroröhrchen und Mischen durch Pipettieren.
- Inkubieren Sie die Mischung für 10-15 min bei RT. Nach der Inkubation vorsichtig hinzu Das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Vertiefungen auf der Oberseite des NSC-Medium (500 ul / Vertiefung).
- Ändert die Medium 24 h nach der Transfektion zu steuern Medium (NSC-Medium) oder Hungermedium (500 & mgr; l / Well).
- Fixieren Sie die Zellen durch das Medium zu 4% PFA Wechsel nach 24 h und führt Immunofärbung; typischerweise bis zu einem 10% igen Transfektionseffizienz wird dieses Protokoll erhalten werden.
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Representative Results
Die Zellen aus dem SVZ in NSC - Medium für eine Woche nach dem Plattieren floating Neurosphären wurden (2A) beobachtet. Die Größen der Kugeln variiert zwischen 50 und 200 um. Um zu untersuchen, ob die Kugeln aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen abgeleitet wurden, wurden die Neurospheres ausplattiert PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser in NSC-Medium für 2 Tage. Sie wurden dann immunhistochemisch gegen die neuralen Stammzellen / Vorläuferzellmarker, Nestin. Zwei Tage waren nötig, die Kugeln zu ermöglichen, zu den Deckgläsern zu befestigen und als Monoschicht von Zellen wachsen zu lassen. Die Monoschicht von Zellen war positiv für Nestin (2B). Um die Differenzierungsfähigkeit der Neurosphären zu untersuchen wir sie Schritte in Abschnitt 2 auf PLL- und skizzierte folgende plattierten Laminin beschichteten Deckgläschen in Differenzierungsmedium ohne Dissoziation für 7-10 Tage. Es dauert mindestens eine Woche für die Differenzierung. Die Neurosphären an den Deckgläsern und erweiterned als eine Monoschicht von Zellen zu wachsen. Wir setzten die Zellen und immunhistochemisch gegen Neuron, Astrozyten und Oligodendrozyten-Marker. Wir beobachteten adhärenten Neurosphären, die in β-Tubulin III-positive Neurone, GFAP-positive Astrozyten differenziert und O4-positive Oligodendrozyten (2C-E). Somit kann multiNeuroSphären aus adulten Maus SVZ abgeleitet werden.
Um zu bestimmen , ob adhärente Neurosphären und differenzierte Neuronen primäre Zilien haben wir immunhistochemisch gegen Arl13b (primäre cilium Marker) 51 und Gpr161 (ciliary lokalisierte GPCR) 7. Nach unserer Erfahrung in verfügbaren Mausmodellen ARL13B-mCherry und in Studien mit der Entwicklung der Maus Kortex, die meisten (wenn nicht alle) neuronalen Zilien im Gehirn exprimieren Arl13b exprimieren, während alle Neuronen nicht-ACIII positive 52, 53, 54. Thus, wir setzen vor allem auf Arl13b neuronale Zilien zu erkennen. Wir haben festgestellt primäre Zilien und die Lokalisierung von Gpr161 an die Cilien von Vorläuferzellen in Neurosphären verklebt (Figur 3A) und in differenzierten Neuronen (3B). Somit sind adhärente Neurosphären und differenzierte Abstammungslinien in Kultur bewimpert und Signalmoleküle lokalisieren.
Um zu bestimmen , ob schwimmende Neurosphären primäre Zilien haben, gefriergeschnitten Neurosphären nach der Fixierung schwebend, wie im Abschnitt 3. Wir beobachteten primäre Zilien in neuralen Stamm- / Vorläuferzellen in den geschnittenen Neurosphären (4A-B). Es ist wichtig, z-Abschnitte über die Neurosphären zu erwerben, um vollständig primäre Zilien sichtbar zu machen, weil es schwierig ist, die primären Zilien in einer einzigen z-Ebene zu untersuchen. Zusammengefasst haben undifferenzierte Neurosphären heterogene Populationen von bewimpert und nicht-Zilienzellen.
(5A-B). Darüber hinaus haben wir festgestellt , eine erhöhte Anzahl von Gpr161-positiven Zilien auf Verhungern (% Gpr161-positiven Zilien / Arl13b-positive Zilien) (5A-B). Interessanterweise zeigte eine frühere Studie undifferenzierte humane embryonale Stammzelllinien , dass die menschliche embryonale Stammzellen in Kultur besitzen auch primäre Zilien 55. Die Anzahl und Länge der Zilien Anstieg auf Serumentzug in diesen Zelllinien, und diese Zilien besitzen auch Komponenten der Shh Maschinen.
Wir transfizierten auch anhaftende neurale Stamm / progenitoR - Zellen, wie im Abschnitt 6 Wir haben festgestellt typischerweise eine Transfektionseffizienz von bis zu 10%, ähnlich den primären Neuronenkulturen im Labor (Abbildung 6).
| Lösung | Komponente |
| 1x PBS | Verdünnte 10x PBS mit autoklaviertem Wasser |
| NSC Medium | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100x N2 | |
| 1 ml 200 mM L-Glutamin | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF-basic (Human bFGF) (Stammlösung 25 ng / mL in Neurobasal-Medium): 20 ng / ml oder 2 mg Gesamt 100 ml Medium | |
| EGF (Stammlösung 25 ng / mL in Neurobasal-Medium): 20 ng / ml oder 2 mg Gesamt 100 ml Medium | |
| 95 ml Basalmedium | |
| Human-FGF-basic (HumanbFGF) | 1 ml Basismedium zu kommerzieller HumanbFGF 25 & mgr; g Flasche |
| Speichert in sterilen Mikroröhrchen in -20 ° C oder niedriger. Verwendet ein einziges 80-ul-Aliquot oder 2 & mgr; g / 100 ml NSC Medien. | |
| EGF | In 8 ml Basismedium zu kommerzieller EGF 20 ug Flasche |
| Speichern, wie sterile Mikroröhrchen in -20 ° C oder niedriger. Verwenden Sie ein einzelnes 80 ug aliquoten / 100 ml Medien. | |
| Stoppen Medium | 1 ml FBS |
| 75 U DNase I (75 U / & mgr; l in PBS) | |
| 9 ml PBS | |
| Serum-Medium | 1 ml FBS |
| 9 ml Basalmedium | |
| Einfriermedium | 4 ml DMSO |
| 24 ml Basalmedium | |
| 12 ml 30% FBS | |
| Differenzierungsmedium | 90 ml Basalmedium |
| 5 ml 5% FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-Glutamin | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF-basic (Human bFGF) (Stammlösung von 25 ng / mL in Neurobasal-Medium): 10 ng / ml oder 1 mg insgesamt 100 ml | |
| Starvation Medium | 95 ml Basalmedium |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-Glutamin | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tabelle 1: Rezept von Lösungen.
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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Neurosphäre Kultur und Differenzierungsprotokolle. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Neurospheres Exhibit Differenzierungsfähigkeit. (A) sind repräsentativ Neurosphären gezeigt. (B) Neurosphären wurden ausplattiert auf PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser in NSC - Medium für 2 Tage und wurden immunhistochemisch gegen Nestin (neurale Stammzellen / Vorläuferzellmarker). (CE) Neurosphären wurden nach den in Abschnitt beschriebenen Schritte plattierten 2 auf PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser in Differenzierungsmedium für 7 Tage without Dissoziation; fest; und immunhistochemisch gegen β-Tubulin III (neuronale Marker), GFAP (Astrozyten-Marker) und O4 (Oligodendrozyten-Marker). Die Kerne wurden durch DAPI gefärbt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Neurosphären und Neurons in adhärenten Differentiated Neurosphären werden Ciliated. (A) nicht dissoziierten Neurosphären wurden für 2 d auf beschichtete Deckgläser in NSC Medium ausplattiert; fest; und immunhistochemisch gegen Gpr161 (grün), Arl13b (rot) und DNA (blau). (B) Differentiated Neuronen wurden immunhistochemisch gegen Gpr161 (grün), Arl13b (rot, A) oder β-Tubulin III (rot, B) und DNA (blau). Weiße Pfeile zeigen Gpr161 Lokalisierung in Zilien.Die rechten Felder in (A) sind vergrößerte Ansichten des primären cilium durch den weißen Pfeil angedeutet. Das Gpr161-positives cilium in den weiß-geschachtelt Neurons nach rechts in (B) gezeigt. Menge = 10 um (A); 50 & mgr; m (B). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Schwebend, Undifferenzierte Neurosphären Verfügen Zilienzellen. Schwimmdock Neurosphären wurden fixiert, in OCT eingebettet, gefriergeschnitten, und verarbeitet für Immunofluoreszenz gegen Arl13b (rot) und DNA. Arl13b-positive primäre Zilien in einem Neurosphäre sind gezeigt. Die Platte in (A) ist eine Maximalintensitätsprojektion von 14 Z-Profilen bei 0,8 & mgr; m Intervallen von einem Neurosphäre. Die Platten in (B) zeigen , der vergrößerten Ansicht von ciliated Zellen in der weißen Region geschachtelt in (A). Die maximale Projektionsbild aus allen z-Abschnitten ist als Stapel dargestellt, während Zahlen 1 bis 14 einzelne z-Abschnitte anzeigen. Die weißen Pfeile zeigen primäre Zilien. Maßstabsbalken = 50 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Starvation Induziert Ciliogenesis in Dissociated Adherent Neural Stem / Progenitor Cells. (A) dissoziierte Zellen wurden auf Deckgläser in NSC beschichtete Medium oder Hungermedium für 24 h ausplattiert; fest; und immunhistochemisch gegen Gpr161 (grün), Arl13b (rot) und DNA (blau). Gpr161-positive Zilien sind in Kontrolle (links) und ausgehungert (rechts) Zellen beobachtet. Die unteren Platten sind vergrößerte Ansichten des angegebenen weißen Kästchen in den jeweiligenobere Platten. Die weißen Pfeile und Pfeilspitzen zeigen Gpr161-positive und -negative Zilien sind. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (B) Quantifizierung der Arl13b-positiver Flimmerzellen (linke Graphik) und Gpr161 lokalisierende in Arl13b-positiven Zilien (rechte Graphik) in Kontroll- und ausgehungert Zellen. Die Prozentsätze der beiden Arl13b-positive Flimmerzellen und Gpr161 lokalisierende in Arl13b-positive Zilien auf erhöhte Verhungern. Die Quantifizierung wurde aus zwei Sichtfeldern jeweils aus zwei technischen Replikate von einem einzigen Experiment durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert aus allen 4 Sehfelder ± Standardabweichung dargestellt. *, P <0,05; ** P <0,01. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Transfection inDissociated Adherent Neural Stem / Progenitor Cells. Dissoziiert plattierten Zellen auf beschichtete Deckgläsern wurden mit einem LAP-TULP3 N-Terminus transfiziert (1-183 aa) mut12 Konstrukt , das auf den Kern IFT-A - Komplex 56 nicht bindet. Das Medium wurde zu Hungermedium 24 h nach der Transfektion verändert. Die Zellen wurden nach 24 h fixiert und immunhistochemisch gegen GFP (grün), Gpr161 (rot), Arl13b (Magenta) und DNA (blau). Eine transfizierte Zelle mit Gpr161- und Arl13b-positiven Flimmer ist durch einen weißen Pfeil gekennzeichnet, während eine transfizierte Zelle ohne Zilien mit einem weißen Pfeilspitze dargestellt ist. Gelbe Pfeile und Pfeilspitzen weisen auf nicht-transfizierten Zellen mit oder ohne Gpr161 / Arl13b, respectively. Maßstabsbalken = 10 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung und Neurosphere Kulturen von adulten Maus SVZ zu halten. Einige relevanten Punkte, die Kulturen in Bezug auf sind wie folgt. Erstens sind die Größen der Kugeln typischerweise zwischen 50 bis 200 & mgr; m. Unserer Erfahrung nach, wenn ein Neurosphere größer als 300 & mgr; m im Durchmesser bekommt, hat die optimale Zeit für Passagierung verfehlt. Diese größeren Kugeln enthalten tote Zellen im Kern. Zweitens, wie Neurosphären üblicherweise verwendet werden, neurale Stammzellen / Vorläuferzellen zu untersuchen, ist es wichtig, EGF und FGF-basic (bFGF) zu verwenden, um die stemness dieser Zellen aufrechtzuerhalten. Daher Faktoren, die Differenzierung, wie FBS induzieren, müssen während der Wartung der Neurosphären vermieden werden. Es hat sich gezeigt , dass 10% FBS Neurosphären in Astrozyten 47 unterscheiden kann. Drittens könnte der Grad der neuronalen Differenzierung nach dem Alter der Maus ab. Wenn man mehr neuronale Differenzierung von Neurosphären wünscht, jüngere Mäuse (postnatale day 0) verwendet werden. Viertens, wenn neue Kulturen beginnt, ist es immer gut, um die Differenzierungsfähigkeit der Neurosphären zu untersuchen. Fünftens unsere Methode ermöglicht es auch Einfrieren und Auftauen von etablierten Neurosphere Kulturen für zukünftige experimentelle Nutzung. Nach dem Auftauen der Regel wachsen Zellen als adhärente spindelförmige Zellen ohne Poly-L-Lysin oder Laminin. Dies kann durch Frost-Tau-Schäden an den Zellen verursacht werden. Es ist wichtig, um die Zellen zu wachsen, bis sie 60 werden - 80% konfluent vor der Passage. Nach der Passage, wachsen Zellen typischerweise als Neurosphären und in der Regel bis 5 agierten werden können - 10 mal.
Neurosphärenkultur-basierte Methoden erlauben uns ciliary Handel und Signalwege in neuralen Stamm- / Vorläuferzellen und differenzierten Neuronen zu untersuchen. Wir untersuchten primäre Zilien in floating / haftend und differenzierten Neurosphären. Es ist wichtig, mehrere z-Abschnitte zu erwerben Zilien über den gesamten Umfang der Neurosphären zu visualisieren. Ferner achterner Erzeugen adhärenten Kulturen dieser Neurosphären, und sie für 24 h hungern, werden die meisten der Zellen bewimpert (Abbildung 5) und in der orphan GPCRs, Gpr161 angereichert. Allerdings Hunger der adhärenten Kulturen führt zu subzellulärer vacuolar Strukturen verlängert. Daher ist es wichtig, sorgfältig zu Hungerperioden für bestimmte Versuchszwecke zu optimieren.
Derzeit werden Studien über ciliogenesis überwiegend in wenigen ciliated ausgeführt, immortalisierte Zelllinien 57. Diese Zelllinien nicht immer treu rekapitulieren Neuronen und neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen bei der Expression Signalisierungskomponenten, wie GPCRs oder Shh Weg Maschinen, so dass es zwingend notwendig, neuere Methoden zu entwickeln, um die Rolle der Flimmerhärchen in biologischen Prozessen zu untersuchen. Die Neurosphären basierenden hier beschriebenen Methoden ermöglichen es uns, Zilien-regulierte zelluläre Wege zu untersuchen, einschließlich GPCR und Shh Signalisierung im Zusammenhang mit der neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen und differentiated Neuronen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
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