Summary
Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien wird beschrieben, so dass für die Zerlegung der Signalwege im Endothel, glatte Muskulatur, oder zwischen Endothel und glatte Muskulatur (der Myoendothelial-Kreuzung). Die selektive Anwendung des Agonisten oder Protein isoliert, Elektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenz kann mit diesem Handy-Kultur-Modell genutzt werden.
Abstract
Die Myoendothelial Kreuzung (MEJ), eine eindeutige Signalisierung Microdomain in kleinem Durchmesser Widerstand Arterien, Exponate Lokalisierung von spezifischen Proteinen und Signalisierung Prozesse, die Gefäßtonus und Blutdruck steuern können. Es ist eine Projektion von entweder der Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zelle, und aufgrund seiner geringen Größe (durchschnittlich eine Fläche von ~ 1 µm2), die MEJ ist schwierig, isoliert zu studieren. Jedoch entwickelten wir ein Zelle-Kultur-Modell namens die vaskulären Co Zellkultur (VCCC), die für in-vitro- MEJ Bildung, Endothelzellen Polarisation und Dissektion der Signalisierung Proteine und Prozesse in der Gefäßwand der Widerstand ermöglicht Arterien. Die VCCC hat eine Vielzahl von Anwendungen und kann verschiedene Zelltypen angepasst werden. Das Modell besteht aus zwei Zelltypen gewachsen auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters mit 0,4 µm-Poren, in denen die in-vitro- MEJs bilden können. Hier beschreiben wir, wie erstelle ich die VCCC über Beschichtung von Zellen und Isolierung von Endothelzellen, MEJ, und glatte Muskulatur Brüche, die dann für Protein isoliert oder Aktivität verwendet werden können Assays. Der Filter mit intakten Zellschichten kann eingebettete und geschnittenen immunofluorescent Analyse fixiert werden. Wichtiger ist, wurden viele der Entdeckungen von diesem Modell bestätigt, mit intakten Widerstand Arterien, unterstreicht seine physiologische Bedeutung.
Introduction
In kleinem Durchmesser Widerstand Arterien trennt eine dünne internen elastischen Lamina (IEL) Endothelzellen (EG) und glatten Muskelzellen (SMC). Die Zellen können durch Löcher in dieser elastischen Matrix Projekt und zytoplasmatischen Direktverbindungen über Gap Junction Kanäle1,2. Diese einzigartige Struktur ist die Myoendothelial-Kreuzung (MEJ) bezeichnet. Die MEJ ist eine kleine (ca. 0,5 µm x 0,5 µm, je nach dem vaskulären Bett), zelluläre Projektion besteht überwiegend aus Endothelzellen aber möglicherweise stammen aus glatten Muskulatur sowie3,4. Eine Reihe von Forschern haben gezeigt, die immense Komplexität von Netzwerken, die selektiv auf die MEJ, wodurch es einen besonders wichtigen Standort zur Erleichterung der Bi-direktionale Signalisierung zwischen Endothel und glatten Muskulatur5 auftreten-Signalisierung ,6,7,8,9,10.
Eine mechanistische Dissektion der Signalwege in der MEJ ist jedoch schwierig in einer intakten Arterie. Da die MEJ eine zelluläre Projektion ist, ist es nicht aktuell möglich, eine in Vivo MEJ aus der Gefäßwand zu isolieren. Aus diesem Grund wurde die VCCC Modell1 entwickelt. Wichtig ist, die VCCC repliziert, physiologische endotheliale Morphologie11 und Polarisierung der Signalisierung zwischen der apikalen und MEJ Teile der Zelle12. Es war dieses einzigartige Modell, das die Entdeckung erleichtert, die alpha Hämoglobin in den Endothelzellen polarisiert, die MEJ ist. Dies steht im Gegensatz zu konventionell kultivierten Endothelzellen die alpha Hämoglobin13nicht ausdrücken. Für Forscher mikrovaskulären Endothel interessiert ist es möglicherweise sinnvoller, Endothelzellen, die in der VCCC kultiviert worden verwenden, besonders wenn Sie beabsichtigen, Signalwege zu zergliedern, die in kleinem Durchmesser Widerstand Arterien auftreten.
Kokultur zwei verschiedene Zelltypen eine robuste Kunststoff-Einlage, enthält einen Filter mit kleinem Durchmesser Poren (0,4 µm im Durchmesser) mit wird verhindert, dass die Zellen die Migration zwischen den Schichten. Es ergibt sich ein 10 µm-Abstand zwischen den Zellen, die deutlich länger als in Vivo, aber immer noch viele der in Vivo -Eigenschaften der MEJs, einschließlich Protein Lokalisierung und second Messenger Signalisierung1 repliziert , 14. Darüber hinaus ermöglicht die VCCC für die Ausrichtung der Zelle typspezifische Signalisierung über die Zugabe von ein Agonist oder Antagonist zu den spezifischen zellulären Fach. Z. B. laden die EG mit BAPTA-AM, Kalzium Chelat und Stimulierung der SMC mit Phenylephrin14. Im Gegensatz zu anderen Beschreibungen von Kokulturen Modelle15,16,17,18,19,20,21stellt dies Hinweise auf die unterschiedlichen Fraktionen mRNA und Protein, einschließlich den ausgeprägten MEJ Bruch innerhalb der Poren des Filters zu isolieren. Diese Technik, um die VCCC können für spezifische Untersuchung von Veränderungen der mRNA Lokalisierung oder Transkription22, Protein Phosphorylierung12,23und Protein Aktivität12. Dieser Artikel beschreibt Beschichtung der EG auf dem Filter und SMC auf dem Boden, obwohl es möglich ist, die zwei Zelltypen in verschiedenen Konformationen11,18,24Kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. galvanischen Zellen für die VCCC
- großen 225 cm 2 Kulturflaschen der EG und SMC unter sterilen Bedingungen bei 37 ° C, bis zum Zusammenfluss von 70-90 %. Sicherstellen Sie, dass mehr EG als SMC verwendet werden; Wenn primäre menschlichen EG und SMC, in der Regel 3 große Fläschchen der EG, 1 große Flasche mit SMC.
- Primärzellen im unteren Passagen verwenden und verwenden Sie nicht vorbei Durchgang 10. Wählen Sie die Kultur Medien basierend auf Zellen, Co kultiviert werden. Verwenden Sie für primäre menschliche Koronararterie EG EBM-2 EG basale Medien mit EGM2 MV Wachstumsfaktoren. Verwenden Sie für primäre menschlichen koronare SMC SmBM SMC basale Medien mit Wachstumsfaktoren SmGM-2. Vor dem Einsatz mit kultivierten Zellen Wachstumsfaktoren zu Medien hinzufügen.
- Bau der VCCC Tag1: Petrischalen groß (150 mm) und Deckel mit einem Desinfektionsmittel (z.B. Cavicide) sprühen und wischen Sie mit einem Papiertuch oder fusselfreien Wischtücher. Dann sprühen Sie die Petrischalen mit 70 % Ethanol (EtOH) und legen Sie sie in die Haube an der Luft trocknen.
- Öffnen die Platte der Filtereinsätze (siehe die Tabelle der Materialien) unter sterilen Bedingungen und Mantel die SMC-Seite (Unterseite des Filters) des Einsatzes mit Fibronektin-Lösung. Halten die Einlage in die vorgesehenen 6-Well-Platte, Pipettieren der Fibronektin-Lösung durch die Seite Schlitze an der Unterseite der Platte, die dafür sorgen, dass die untere Hälfte des Filters ist (nicht mehr als 1 mL) bedeckt.
- Nach 30 min Behandlung mit Fibronektin Lösung bei Raumtemperatur in der Zelle-Kultur-Haube, Einsätze aus dem Blech nehmen, Vakuum überschüssige Lösung und invertieren, Platzierung in der unteren Hälfte der sauberen Petrischale. Beiseite stellen. Achten Sie darauf, nicht die Filtermembran einfügen zu stören, wenn überschüssige Lösung Absaugen; Dies kann durch sanft die Platte kippen und Staubsaugen die Lösung über den Rand des Einsatzes vermieden werden.
- Trypsinize 225 cm 2 Kolben des SMC mit 3 mL vorgewärmten 2 X Trypsin-EDTA-Lösung, und sobald die Zellen aus der Platte gehoben haben hinzufügen 9 mL SMC Medien, Trypsin (3:1, Medien: Trypsin) zu neutralisieren. Übertragen auf eine konische Rohr, mischen Sie gut und Pipettieren 10 µL auf eine Hemocytometer Anzahl von Zellen zu bestimmen.
- Count die Anzahl der Zellen in 5 x 5 Felder (d. h., 18), multiplizieren Sie diese mit 10.000, die Anzahl der Zellen in 1 mL (180.000) erhalten. Multiplizieren Sie dann mit 12 mL (Gesamtvolumen der Zellsuspension, 2,16 Millionen SMC). Sicherzustellen, dass es genügend SMC auf die gewünschte Anzahl von Brunnen Platte.
Hinweis: Z. B. 1 gut 75.000 SMC haben sollte und somit 18 Vertiefungen 1,35 Millionen insgesamt SMC. Dividieren von 1,35 Millionen Zellen von 180.000 Zellen pro 1 mL benötigt, und dies führt zu 7,5 mL Zellsuspension, die für die Beschichtung benötigt werden. Berechnen Sie dann das endgültige Volumen benötigt (18 Brunnen X 750 µL = 13,5 mL). So nehmen Sie 7,5 mL Zellsuspension, bringen das Volumen bis zu 13,5 mL vorgewärmten SMC Medien und gut mischen.
- Count die Anzahl der Zellen in 5 x 5 Felder (d. h., 18), multiplizieren Sie diese mit 10.000, die Anzahl der Zellen in 1 mL (180.000) erhalten. Multiplizieren Sie dann mit 12 mL (Gesamtvolumen der Zellsuspension, 2,16 Millionen SMC). Sicherzustellen, dass es genügend SMC auf die gewünschte Anzahl von Brunnen Platte.
- Platte 750 µL Zellsuspension mit ca. 75.000 SMC auf der Unterseite jedes Filters, wobei Sie darauf achten, keines der Medien und Zelle Lösung zu verschütten. Setzen Sie den Deckel an der Spitze und sorgfältig zu übertragen, die Petrischale mit den Einsätzen in den Brutschrank bei 37 ° C über Nacht.
Hinweis: Die optimale Zelldichte für andere Zelltypen müssen empirisch ermittelt werden. - Am 2. Tag, saubere 6-Well Tellern mit 2 mL frisches, vorgewärmten SMC Medien. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator. Die Einsätze aus einzeln nacheinander und entfernen Sie das Medium durch Absaugen, dann setzen Sie die 6-Well-Platte mit den SMC Medien.
- Mantel die gegenüberliegende Seite des Filters (EG-Seite) mit 1 mL einer 0,5 % bovine Gelatine-Lösung für mindestens 30 min bei 37 ° c
- Trypsinize 225 cm 2 Flask(s) EG mit 3 mL vorgewärmten 2 X Trypsin-EDTA (10-fach verdünnt in sterilen Dulbecco ' s PBS) Lösung mit sanften Klopfen des Kolbens um die Zellen aus der Platte zu heben.
Hinweis: Es möglicherweise notwendig, um die Kolben zurück in den Brutschrank bei 37 ° C für 1-3 min zu platzieren.- Einmal die Zellen aus der Platte gehoben haben hinzufügen 9 mL EG Medien zu neutralisieren die Trypsin (3:1). Transfer zu einem konischen Rohr, Pool gemeinsam, mischen Sie gut und Pipettieren 10 µL auf eine Hemocytometer Anzahl von Zellen zu bestimmen.
- Count die Anzahl der Zellen in 5 x 5 Felder (d. h. 60), multiplizieren Sie diese mit 10.000, die Anzahl der Zellen in 1 mL (600.000) erhalten. Multiplizieren Sie dann mit 12 mL (Gesamtvolumen der Zellsuspension, 7,2 Millionen EG). Sicherzustellen, dass es genügend EG auf die gewünschte Anzahl von Brunnen Platte.
Hinweis: Ca. 360.000 EG sind pro Bohrloch erforderlich. Beispielsweise erfordern 18 Brunnen 6,48 Millionen EC Dividieren von 6,48 Millionen Zellen von 600.000 EC pro 1 mL benötigt, und dies führt zu 10,8 mL Zellsuspension, die für die Beschichtung benötigt werden. Berechnen Sie dann das endgültige Volumen benötigt (18 Brunnen x 1 mL = 18 mL). So nehmen Sie 10,8 mL Zellsuspension, bringen das Volumen bis zu 18 mL mit EG Medien vorgewärmt und sanft Aufschwemmen.
- Count die Anzahl der Zellen in 5 x 5 Felder (d. h. 60), multiplizieren Sie diese mit 10.000, die Anzahl der Zellen in 1 mL (600.000) erhalten. Multiplizieren Sie dann mit 12 mL (Gesamtvolumen der Zellsuspension, 7,2 Millionen EG). Sicherzustellen, dass es genügend EG auf die gewünschte Anzahl von Brunnen Platte.
- Einmal die Zellen aus der Platte gehoben haben hinzufügen 9 mL EG Medien zu neutralisieren die Trypsin (3:1). Transfer zu einem konischen Rohr, Pool gemeinsam, mischen Sie gut und Pipettieren 10 µL auf eine Hemocytometer Anzahl von Zellen zu bestimmen.
- Platte 1 mL 360.000 EG auf der Oberseite der einzelnen Filter einfügen. Lassen Sie die Zellen, die bei 37 ° C für 24 Std. ersetzen Medium am 4. Tag ungestört brüten. Ernte am Tag 5.
2. Ernte-Fraktionen aus der VCCC
- führen die Isolation in einem Raum von 4 ° C und halten alle Instrumente im Ice.
- Denken Sie daran, die Anzahl der einzelnen Einfügungen, isoliert und eine 50 mL-Tube MEJ (für die isolierte Filter) beschriftet Lyse Puffer hinzu. Bezeichnen Sie zwei 10 mm Schalen; eins für EG und eins für SMC.
- Stellen Sie die Lautstärke der Lyse Puffer je nachdem, wie konzentriert die lysate muss sein; für 15 Einsätze, 500 µL Lyse Puffer für die MEJ-Röhre und 250 µL pro Petrischale werden empfohlen.
- Arbeiten mit einem 6-Well-Platte von Einsätzen zu einem Zeitpunkt. Saugen Sie das Medium in die Zelle Kultur Kapuze und dann Verkehr in einen kalten Raum auf Ice
Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für 1 Isolation einfügen. - Pipettieren 10 µL 1 X PBS auf der SMC-Seite des Einschubs.
- Verwenden den Zelle Lifter zu kratzen an den Zellen an einem Ende des Einsatzes, und übertragen Sie die Zellen aus der Lifter, der SMC Petrischale mit Lyse Puffer in it.
- Sobald die Zelle Heber den Lyse-Puffer in der Schale berührt hat es darf nicht den einfügen-Filter zu berühren, bis es vollständig abgewischt und abgetrocknet auf Küchenpapier. Wiederholen Sie das Kratzen der SMC Filter mindestens ein bis zwei Mal, um vollständig zu entfernen, die restlichen SMC-Zellenrückstand.
- Drehen Sie den Einsatz über und Pipettieren 10 µL 1 X PBS in der oberen/EG-Seite des Filters einfügen. Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 mit Schabeisen Zelle und der EG-Petrischale.
- Sammeln die noch verbleibende Zelle und PBS Gülle aus der EG-Seite des Filters mit einer Pipette und Übertragung der EG Petrischale mit Lyse Puffer. Seien Sie sehr gründlich in Schaben die Zellen an beiden Seiten des Filters, minimale EG/SMC-Kontamination in der MEJ-Fraktion verlassen.
- Verwenden Sie Vorsicht das Skalpell schneiden Sie die Filter aus den Kunststoffeinsatz. Zu diesem Zweck schneiden 70-80 % davon weg von Kunststoff und Zange den Filter komplett von den Kunststoffeinsatz Struktur ziehen. Setzen Sie den Filter in der 50 mL konische Röhre MEJ mit Lyse Puffer beschriftet, und sicherzustellen, dass es sitzt in der Lyse-Puffer und bleibt feucht.
- Wiederholen Sie die Isolation, in Gruppen von 6, bis alle Einsätze abgearbeitet wurden.
- Sorgen dafür, dass die verschiedenen Behandlungsgruppen in getrennten Röhren und Gerichte gehalten werden.
- Vortex 50 mL MEJ konischem Rohr auf voller Stärke für 15 s oder bis alles gut vermischt. Entfernen Sie die Filter aus dem konischen MEJ mit Zangen, ziehen sie entlang der Seitenwände des Rohres, die maximale Menge an Proteinen und Flüssigkeit im Rohr lassen. Nach diesem Zeitpunkt die Filter verwerfen.
- Sobald die Filter aus der MEJ konischem Rohr entfernt wurden tun ein schnelle Runde (10-15 s bei max. Drehzahl ~ 16.000 x g) in einer Zentrifuge, die Flüssigkeit und die Proteine an der Unterseite des Rohres zu ziehen. Übertragen Sie den Inhalt des Rohres MEJ und die EG und SMC Petri Gerichte in separate, kleinere Zentrifuge Röhren.
- Optional: beschallen den Inhalt der MEJ/SMC/EG Rohre auf Stufe 4 für drei 10 s-Pulse auf Eis oder sanft mit der Hand zu homogenisieren.
- Zentrifugieren bei max. Geschwindigkeit (~ 16.000 x g) 15 min bei 4 ° C. Pipettieren aus der Überstand und assay lysate für den Eiweißgehalt unter Verwendung der Methode Bicinchoninic Assay.
3. Ernte der VCCC für En Face Immunfluoreszenz
- auf den Tag 5 der VCCC Inkubation, entfernen Sie die Einsätze aus dem Inkubator. Arbeiten in der Zelle-Kultur-Haube, Absaugung von SMC Medien aus jedem der unteren Brunnen des Insert Filters und spülen zweimal mit 1 X PBS. Wiederholen Sie dies mit der EG-Seite.
- Halten die Einsätze, intakt und in der Platte, 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 10-20 min in einem begehbaren 4 ° C Raum auf einem sanften Shaker hinzufügen. Beide Seiten des Insert Filters mit 1 X PBS für 5 min waschen und zwei Mal wiederholen.
Achtung: PFA ist giftig und müssen sorgfältig behandelt werden. - Führen die blockierende, primäre und sekundäre Antikörper Inkubationen in die Platte, um sicherzustellen, dass beide Seiten des Filters in der Antikörper beibehalten werden + blockiert Lösung (9 mL PBS, 25 µL Triton X100, 50 mg Rinderserumalbumin, 500 µL normal Serum)
- Montieren Sie den Filter auf einer Folie, die Filter aus den Kunststoffeinsatz mit einem Skalpell schneiden montiert auf einen Griff und auf einen Objektträger mit Eindeckmedium.
4. Ernte der VCCC für transversale Immunfluoreszenz
- auf den Tag 5 der VCCC Inkubation, entfernen Sie die Einsätze aus dem Inkubator. Saug-aus den Medien von beiden Seiten des Filters in der Zelle Kultur Haube einfügen und spülen Sie jede Seite des Filters zwei Mal mit 1 X PBS.
- Halten die Einsätze, intakt und in der 6-Well-Platte hinzufügen 4 % PFA und inkubieren Sie über Nacht in einem begehbaren 4 ° C Raum auf einem sanften Shaker.
Achtung: PFA ist giftig und müssen sorgfältig behandelt werden.
5. Einbettung der VCCC für transversale Immunfluoreszenz
- nach Filter Einsätze wurden behoben, etwa für 24 h in 4 % PFA, Übertragung auf 70 % EtOH für mindestens 24 Stunden, aber bis zu mehreren Wochen.
- Verarbeiten die Filter auf eine lange (über Nacht) auf einem automatisierten Gewebe-Prozessor laufen. Verwenden Sie das Programm wie folgt: 70 % EtOH für 30 min, 85 % EtOH 30 min, 95 % EtOH 30 min, 100 % EtOH 30 min, 100 % EtOH 45 min, 100 % EtOH 45 min, Xylol 30 min, Xylol 30 min, Xylol 45 min, 60 ° C paraffin 30 min, 60 ° C 30 min paraffin , 60 ° C 45 min. paraffin
- Nach der Verarbeitung der geernteten Filter transfer zum Einbetten in flüssigem Paraffin, halten Sie die Filter in der Kassette.
- Entfernen Sie den Filter aus der Kassette vorsichtig mit einer Pinzette es nur am Rande zu halten. Halbieren Sie mit einer Schere den Filter, bilden zwei halbrunde Hälften geformt. Lag der 2 Hälften auf der Kühlplatte Teil der einbettenden Station gerade lange genug, um die Einbettung füllen Schimmel mit flüssigem Paraffin.
- Einmal gefüllt mit flüssigem Paraffin, ganz kurz berühren die einbettende Form, um die kalte Platte, dann jeweils die Hälfte des Filters in Form (Schnittseite nach unten) einbetten einzubetten; dies wird sichergestellt, dass beim Schneiden, einer aus der Mitte des Filters gegen den Rand schneiden wird .
- Nutzungszeit einbetten, Pinzetten, halten Sie den Filter im Ort, um zu verhindern, dass die Hälften ineinander fallen, bis das Paraffin kühl genug für sie ist, allein zu stehen. Bewegen Sie den Einbetten von Schimmel auf einen kalten Teller bis völlig erstarrt.
Hinweis: Kühlung Blöcke auf Eis Tabletts, um faltige Abschnitte zu verhindern hilft.
6. -Schnitt und Färbung der VCCC für transversale Immunfluoreszenz
- für die Paraffin-Blöcke schneiden und schieben, Montage: 5 µm Abschnitte schneiden, legen Sie die Abschnitte in ein Wasserbad 42 ° C und nehmen Sie in den Abschnitten mit positiv geladenen Folien. Dann halten Sie Dias über Nacht in einem 42 ° C Ofen trocknen.
- Vor Beginn der Rehydratation Schritte, backen die Folien bei 60 ° C das Paraffin schmilzt und helfen die VCCC Abschnitte auf der Folie haften. Kurz abkühlen, dann rehydrieren die Folien durch zwei Änderungen von Xylol, 100 % EtOH, 95 % EtOH, eine Änderung von 70 % EtOH und zwei Änderungen von destilliertem Wasser.
- Antigen Abrufmethoden, bei denen Mikrowelle oder Heizung wie Abschnitte, aus der Folie fallen können zu vermeiden.
- Führen die standard Sperrung für 1 h bei Raumtemperatur, dann die Nacht Inkubation mit dem primären Antikörper bei 4 ° C, gefolgt von Wasch-Schritte und Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur. Montieren Sie mit der Montage Medien- und Deckgläschen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Filtereinsätze für die VCCC verwendet haben kleine, 0,4 µm Löcher. Abbildung 1A, ein En Flächenansicht des VCCC Filter Einschub zeigt die Poren, in denen die MEJ in Vitrobilden kann. Der Schaltplan zeigt die glatten Muskelzellen vergoldet auf der unteren Seite des Filters einen Tag vor der Endothelzellen auf der gegenüberliegenden Seite (Abbildung 1 b) überzogen sind. Sobald die Zellen überzogen sind, kann die EG, MEJ und SMC-Fraktionen isoliert drei Tage später. Ein Beispiel für dies ist in Abbildung 2A, wo Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) hoch in der MEJ Bruchteil im Vergleich zum Rest der EG, ausgedrückt wird, die auch bei in Vivo MEJs25gilt. Diese Daten zeigen die Nützlichkeit der VCCC in Rekapitulation der intakten Arteriolen Gefäßwand.
Als nächstes wird die VCCC in Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie demonstriert. Die VCCC bleibt intakt und Feste mit PFA für transversale Immunfluoreszenz. Abbildung 3A zeigt die glatte Muskulatur spezifischen Alpha-1 adrenerge Rezeptor und der endothelialen spezifische Bradykinin-Rezeptor. Phalloidin Färbung des F-Aktin zeigt die Aktin-Brücken in der MEJ (weißer Pfeil) zwischen den zwei Zellen, die den Ausdruck in einer intakten Arterie26gesehen repliziert. In Abbildung 3 bist ein Querschnitt durch die VCCC wie von Transmissions-Elektronenmikroskopie angesehen demonstriert, die in 3D in Abbildung 3dargestellt ist. Diese Ansichten von der VCCC zeigen die Fähigkeit, Proteine, Rezeptoren und Ultrastruktur, in-vitro- MEJs speziell zu lokalisieren.
Abbildung 1: Beschichtung von vaskulären Co Zellkultur (VCCC). (A) En Face Licht Schliffbild der Poren in der Insert-Filter. Schwarze Pfeile bezeichnen die einzelnen Löcher. (B) schematische Darstellung der VCCC Beschichtung. Tag1 zeigt Umkehrung der Filtereinsatz und Beschichtung SMC auf der Unterseite. Am Tag 2 die EG sind vergoldet, auf der gegenüberliegenden Seite des Filters und der VCCC bleibt in dieser Konformation in einem 6-Well-Platte bis zur Ernte. Weiße Pfeile zeigen auf die Seite des Filters, wo die Zellen sind vergoldet und werden wachsen. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Proteinanreicherung in der MEJ. (A) Immuno-Übertragung elektronenmikroskopische Aufnahme der Maus Arterie mit Ausdruck der alpha-Globin an MEJ (gold-Beads, die als schwarze Punkte dargestellt werden). (B) Western-Blot zeigt Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) Ausdruck in der MEJ-Fraktion gegenüber der EG oder SMC Fraktionen bereichert wird. Kunststoff EG gibt EG angebaut auf einer Plastikschale, die bilden keine MEJ. Maßstabsleiste = 1 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: quer Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie in Querschnitte der VCCC. (A) Färbung für glatte Muskelzellen und Endothelzellen spezifische Proteine. F-Aktin Färbung ist in der gesamten Zelle Arten und die in-vitro- MEJ (weißer Pfeil). Ein Beispiel der Elektronenmikroskopie zur Untersuchung der Ultrastruktur des in-vitro- MEJs in 2D (B) und 3D (C). Maßstabsleiste = 10 µm (A); 2,5 µm (B); und ca. 2,5 µm vertikale und horizontale 0,5 µm (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die VCCC hat eine Reihe von Vorteilen in Bezug auf die Rekapitulation MEJs in Vitro, aber es gibt Punkte der Diskussion beim festlegen, ob die VCCC für spezifische Anwendung genutzt werden kann. Beispielsweise, wenn verschiedene Zelltypen sind bei diesem Modell verwendet werden, es müssen optimiert werden. Wir haben primären humanen Zellen verwendet, aber es ist möglich, Zellen aus bovine Hauptschlagadern24oder Wildtyp oder Knockout-Mäusen zu isolieren, und verwenden sie in der VCCC1,5,14.
Wenn die VCCC MEJ Isolation verwenden, ist die wichtigste Technik zu meistern gründliche Schaben des Filters zu gewährleisten, dass die Reinheit des MEJ Bruchteil von überschüssigen Endothelzellen oder glatten Muskel Zellen nicht verändert wird. Wir haben über Western blotting gezeigt, dass alpha Hämoglobin der beste Marker von einem "reinen" MEJ Isolierung13, da sie stark in der MEJ Bruchteil im Vergleich zu den Endothelzellen Bruch ausgedrückt werden sollte. Ein weiterer Grund ist PAI-1, regelt die Bildung von MEJ (Abbildung 2)25. Wir fühlen, dass diese besonders gute Marker für eine robuste MEJ isoliert werden können. Für zusätzliche Sicherheit in der Ernte-Technik können die Filter nach dem Schaben für Ernte gehalten und gebeizt für EG/SMC Marker25.
Imaging-Protein-Expression in den VCCC kann auf zweierlei Weise erfolgen: En Face (Abbildung 1A) oder quer (Abbildung 3). Beide Präparate ermöglichen die Visualisierung von Proteinen in die Löcher des Filters aus zwei unterschiedlichen Perspektiven. De Gesicht bei dieser Technik wird die Arterien, die längs aufgeschnitten und dann steckte flach, mit der EG nach oben, zur Visualisierung der EG Monolage und die Löcher in der IEL, der einzige Ort wo MEJ bilden kann. Ein Fluoreszenzsignal in die Löcher der IEL zeigt die Lokalisation des Proteins in der MEJ10,27. Das gleiche Prinzip kann übersetzt werden, die VCCC durch bildgebende EG Monolage von oben ohne in Paraffin einbetten oder Abschnitte machen zu müssen. Die transversale Methode ist komplizierter zu Meister ist aber entscheidend für deutliche Visualisierung von Proteinen in der EG im Vergleich zu der SMC-Monoschichten (Abbildung 3).
Der Mangel an Fluss- oder Strecke in das System ist eine mögliche Einschränkung, aber es ist möglich, fließen in eine endotheliale Glattmuskel Zelle Kokultur16,19. Es scheint, dass die statischen Verhältnisse noch ermöglichen physiologisch korrekte Proteinexpression und Aktivierung, so kann es sein, dass der Heterocellular Kontakt ist der wichtigste Faktor in Dissektion der MEJ Signalwege.
Es gibt mehrere Anwendungen dieser Technik über Widerstand Arterie signalisieren, da die VCCC nicht unbedingt auf bestimmte Zelltypen beschränkt. Anderen Kokultur Modellen verwendete Auswuchs Endothelzellen und Osteoblasten17oder modelliert die Blut-Hirn-Schranke mit Endothelzellen und Pericyte/Astrozyten Kulturen zusammen21. Metastasierung von Tumorzellen durch das Endothel kann auch mit diesem Modell21quantifiziert werden. Es ist auch möglich, wachsen Zellen auf dem Filter und der Kultur einer anderen Zelle geben Sie in den Boden der Schale 6-Well, parakrine Signalisierung zu testen, oder wachsen Endothelzellen am oberen Teil der Membran Polarisation der Zelle (unveröffentlichten Beobachtungen) anzusehen. Leukozyten oder anderen zirkulierenden Zellen können die EG-Medien hinzugefügt werden und die Adhäsion der Zellen kann quantifizierte12. Darüber hinaus kann der VCCC verwendet werden, um Pathologien wie Glattmuskel Migration24 und Verbreitung als Reaktion auf Endothelzellen Verletzungen15,18zu untersuchen.
Zusammenfassend haben wir eine Methode um MEJ aus einer in-vitro- Kultur Zellsystem, zu isolieren, die für die Untersuchung der Prozesse zwischen zwei gekoppelten Zelltypen Signalisierung ermöglicht vorgestellt. Wichtig ist, der Kokulturen-System beschränkt sich nicht auf die Studie der MEJ und wertvoll, eine Reihe von Fragen, vor allem solche, die Heterocellular Mitteilung zu beantworten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit von National Heart unterstützt wurde, Lung and Blood Institute gewährt R01088554, der T32HL007284 und der American Heart Association predoctoral Gemeinschaft 14PRE20420024. Wir danken vor allem die St. Jude Cellular Imaging geteilt Forschung Core, einschließlich Randall Wakefield und Linda Horner für die Elektronenmikroskopie Bilder, Adam Straub für die Unterstützung bei repräsentativen Immunfluoreszenz Bilder und Pooneh Bagher für Sie wertvolles Feedback über das Manuskript-Protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
