Summary
저항 동맥의 세포 문화 모델, 신호 경로 내 피, 평활 근, 또는 피와 부드러운 근육 (myoendothelial 교차점) 사이 해 부에 대 한 수 있도록 설명 되어 있습니다. 이 셀 문화 모델을 사용 하 여 면역 형광 검사, 전자 현미경, 또는 단백질 격리, 촉진제의 선택적 응용 프로그램을 활용할 수 있습니다.
Abstract
Myoendothelial 접합 (MEJ), 작은 직경 저항 동맥에 독특한 신호 microdomain 특정 단백질과 혈관 음색 및 혈압을 제어할 수 있는 신호 프로세스의 지역화를 전시 한다. 그것에서 프로젝션 내 피 또는 부드러운 근육 세포와 그것의 작은 때문에 MEJ (평균에, ~ 1 µ m2의 영역), 크기 격리에서 공부 하기 어렵습니다. 그러나, 우리는 MEJ 대형 생체 외에서 내 피 세포의 양극 화, 그리고 신호 단백질 및 프로세스의 저항 혈관 벽에의 해 부에 대 한 있도록 혈관 세포 공동 문화 (VCCC) 라는 세포 문화 모델 개발 동맥입니다. VCCC 다양 한 응용 프로그램 있으며 서로 다른 세포 유형에 맞게 적용할 수 있습니다. 0.4 µ m 모 공에는 생체 외에서 MEJs를 형성할 수 있습니다와 필터의 반대 측에 2 개의 세포 유형 모델에 의하여 이루어져 있다. 여기 우리가 설명 셀의 도금 및 절연의 내 피, 통해 VCCC 만드는 방법을 MEJ, 및 단백질 격리 또는 활동에 사용할 수 있습니다 부드러운 근육 분수 분석 실험. 포함 된, 그리고 immunofluorescent 분석 sectioned에 그대로 셀 레이어 필터를 해결할 수 있습니다. 중요 한 것은,이 모델에서 발견의 많은 생리 적인 관련성을 강조 하는 그대로 저항 동맥을 사용 하 여 확인 되었습니다.
Introduction
작은 직경 저항 동맥, 얇은 내부 탄력 있는 lamina (IEL) 내 피 (EC)와 평활 근 세포 (SMC)를 분리합니다. 셀이 탄성 매트릭스에 구멍을 통해 프로젝트 하 고 갭 정션 채널1,2를 통해 직접 세포질 연결을 만들 수 있습니다. 이 독특한 구조는 myoendothelial 접합 (MEJ) 이라고 불린다. MEJ 작은 (약 0.5 µ m 혈관 침대에 따라 0.5 µ m x), 셀룰러 투영 하지만 내 피 세포의 주로 구성3,4뿐만 아니라 부드러운 근육에서 발생 한 수 있습니다. 수 사관의 수 신호 그것은 피와 부드러운 근육5 사이의 양방향 신호 촉진을 위한 특히 중요 한 위치를 렌더링 MEJ에 선택적으로 발생 하는 네트워크의 엄청난 복잡성을 증명 하고있다 ,6,,78,,910.
그러나,는 MEJ에 신호 통로의 기계 해 부 그대로 동맥에서 어렵습니다. MEJ 셀룰러 프로젝션 때문에 그것 불가능 현재는 비보에 MEJ 혈관 벽에서 분리 합니다. 이러한 이유로 VCCC 모델1 개발 되었다. VCCC 생리 내 피 형태11 와 양극 화는 꼭대기 사이 신호를 복제 하는 중요 한 것은, 셀12MEJ 부분. 그것을 발견 알파 헤모글로빈에에서 있는 내 피 세포는 MEJ에 편광이 독특한 모델 이었습니다. 이것은 알파 헤모글로빈13를 표현 하지 않는 전통적으로 교양된 내 피 세포와 달리 이다. Microvascular 내 피에 관심이 연구원에 대 한 더 작은 직경 저항 동맥에서 발생 하는 신호 경로 해 부 하는 것입니다 의도 하는 경우에 특히 VCCC에서 경작 된 내 피 세포를 사용 하 여 적절 한 수 있습니다.
공동 문화 2 가지 종류를 튼튼한 플라스틱 삽입을 포함 하는 직경이 작은 숨 구멍 (직경에서 0.4 µ m)와 필터를 사용 하 여 계층 간의 마이그레이션에서 세포를 방지 합니다. 그것은 크게 비보, 보다 긴 하지만 여전히 많은 MEJs, 단백질 지 방화, 두 번째 메신저1 신호 등의 비보에 특성의 복제 세포 사이의 10 µ m 거리에서 결과 , 14. 또한는 VCCC 셀 주 작동 근 또는 특정 세포 구획에 적의 추가 통해 신호 유형 특정의 대상에 대 한 수. 예를 들어 BAPTA-킬레이트 칼슘, 오전으로 EC를 로드 하 고 phenylephrine14SMC를 자극. 이 제공 하는 공동 문화 모델15,,1617,18,19,20,21의 다른 설명, 달리 지침에 mRNA와 단백질, 필터 모 공 내의 별개 MEJ 분수를 포함 하 여 독특한 분수를 분리. VCCC에이 기술 추가 mRNA 현지화 또는 전사22,23, 단백질의 인 산화12,및 단백질 활동12변화의 특정 조사 수 있습니다. 이 기사 다른 conformations11,,1824두 세포 유형 문화 수도 있지만 아래에 필터와 SMC EC의 도금 설명 합니다.
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Protocol
1. 도금 셀은 VCCC
- 문화 큰 225 cm 2 플라스 크 EC 및 SMC의 70-90% 합칠 때까지 37 ° C에서 살 균 조건 하에서. SMC 보다 더 많은 EC는 사용; 기본 인간 EC 및 SMC, SMC의 1 큰 플라스 크를 EC의 일반적으로 3 큰 플라스 크를 사용 하 여 경우.
- 낮은 구절에서 1 차 셀을 사용 하 고 통로 10 과거 사용 하지 마십시오. 문화 미디어 기반 공동 경작 될 셀을 선택 하십시오. 기본 인간 관상 동맥 EC, EGM2 MV 성장 요인으로 EBM-2 EC 기저 미디어를 사용 합니다. 기본 인간 관상 SMC, SmGM-2 성장 요소와 SmBM SMC 기저 미디어를 사용 합니다. 배양된 세포와 함께 사용, 이전을 미디어 성장 요인 추가.
- VCCC 주 1의 건설: 살 균 제 (예, Cavicide)와 큰 (150 m m) 접시와 뚜껑을 스프레이 종이 타월 또는 보풀 물티슈로 닦아. 그런 다음 70% 에탄올 (EtOH) 페 트리 접시를 살포 하 고 건조 공기를 후드에 배치.
- 무 균 조건 하에서 필터 삽입 (재료의 표 참조)의 접시 열고 코트 fibronectin 솔루션 삽입의 SMC 측면 (필터의 밑바닥 측). 확인 하단의 필터의 절반은 (더 이상 1 mL)을 적용 하 고, 접시의 바닥에 슬릿 피펫으로 측면을 통해 fibronectin 솔루션 제공된 6 잘 플레이트에 삽입을 유지,.
- 실내 온도 셀 문화 후드에 fibronectin 솔루션 치료 후 30 분 접시에서 삽입, 진공 모든 초과 솔루션 및 반전, 깨끗 한 페 트리 접시의 절반을 하단에 배치. 따로 설정 합니다. 초과 솔루션; suctioning 때 필터 삽입 멤브레인을 방해 하지 않도록 주의 하십시오 이 부드럽게 접시, 기울이기 및 삽입의 가장자리에서 솔루션을 진공 청소기로 청소 하 여 방지할 수 있습니다.
- Trypsinize 225 cm 2 플라스 크의 SMC 미리 데워 2 X 트립 신-EDTA 솔루션, 그리고 일단 세포가 접시를 낸 3 mL와 함께 9 mL SMC 미디어 트립 신 (3:1, 미디어: trypsin) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브에 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L.
- 수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 18), 1 ml (180000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 2.16 백만 SMC의)를 곱하십시오. 충분 한 SMC 접시 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오.
참고: 예를 들어 1 잘 75000 SMC 있고 따라서 18 우물 1.35 백만 총 SMC 했. 1.35 백만 세포 1 mL 당 180000 셀에 필요한 분할 하 고 도금 하는 데 필요한 세포 현 탁 액의 7.5 mL에이 결과. 다음 계산 필요 마지막 볼륨 (18 우물 x 750 µ L = 13.5 mL). 따라서, 세포 현 탁 액의 7.5 mL, 볼륨을가지고 미리 따뜻하게 SMC 미디어와 잘 혼합 최대 13.5 mL.
- 수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 18), 1 ml (180000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 2.16 백만 SMC의)를 곱하십시오. 충분 한 SMC 접시 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오.
- 약 75000 SMC 각 필터의 아래쪽 면에 미디어와 셀 솔루션의 유출 하지 않도록 주의 되 고 포함 된 셀 서 스 펜 션의 플레이트 750 µ L. 뚜껑 위에 놓고 신중 하 게 삽입 된 페 트리 접시에 전송 37 ° C에서 인큐베이터 하룻밤.
참고: 다른 셀 형식에 대 한 최적의 셀 밀도 경험적으로 결정 해야 합니다. - 하루에 2, 채워 깨끗 한 6 잘 요리 신선한, 미리 데워 진 SMC 미디어의 2 mL. 인큐베이터에서 플레이트를 제거 합니다. 삽입 한 번에 하나를와 미디어 흡입, 다음 SMC 미디어 6-잘 접시에 놓습니다.
- 37에서 적어도 30 분 동안 0.5% 소 젤라틴 해결책의 1 mL로 필터 (EC 측)의 반대편 코트 ° c.
- 미리 데워 2의 3 mL와 EC의 225 cm 2 flask(s) trypsinize X 트립 신-EDTA (10 x 메 마른 Dulbecco에 희석 ' s PBS) 솔루션, 접시에서 셀 리프트 위해 플라스 크의 부드러운 도청.
참고: 그것은 다시 1-3 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 플라스 크를 필요할 수 있습니다.- 한 번
- 셀 접시를 낸는 9 mL EC 미디어 트립 신 (3:1) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브, 수영장을 함께 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L를 혼합.
- 수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 60), 1 ml (600000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 7.2 백만 EC의)를 곱하십시오. 충분 한 EC 격판덮개 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오.
참고: 약 360000 EC는 잘 당 필요. 예를 들어 18 우물 6.48 백만 적 필요 1 mL 당 600000 EC에 필요한 6.48 백만 셀 분할 하 고 도금 하는 데 필요한 세포 현 탁 액의 10.8 mL에이 결과. 다음 계산 필요 마지막 볼륨 (18 우물 1 mL = 18 mL x). 따라서, 세포 현 탁 액의 10.8 mL, 최대 볼륨을가지고 18 mL와 함께 미리 EC 미디어를 예 열 하 고 부드럽게 resuspend.
- 수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 60), 1 ml (600000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 7.2 백만 EC의)를 곱하십시오. 충분 한 EC 격판덮개 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오.
- 셀 접시를 낸는 9 mL EC 미디어 트립 신 (3:1) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브, 수영장을 함께 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L를 혼합.
- 각 삽입 필터의 상단 측면에 360000 EC의 1 mL 접시. 셀 4 일에 24 h. 대체 매체에 대 한 37 ° C에서 그대로 품 어 보자. 5 당일 수확.
2. 분수는 VCCC에서 수확
- 4 ° C 방에 격리를 수행 하 고 얼음에 모든 악기를 유지
- 마음에 고립 되 고 개별 삽입의 수를 유지 하 고 (격리 된 필터)에 대 한 MEJ 분류 50 mL 튜브에 세포의 용 해 버퍼를 추가. 다음 레이블 두 10mm 요리; EC 및 SMC.
- 조정 어떻게 집중은 lysate 해야; 15에 대 한 삽입에 따라 세포의 용 해 버퍼의 볼륨, MEJ 튜브에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L 및 페 트리 접시 당 250 µ L 좋습니다.
- 작업 삽입 한 번에의 한 6 잘 플레이트. 셀 문화 후드 그리고 얼음에 차가운 방에 전송 매체에서 흡입
참고: 다음 지침은 1 삽입 격리에 대 한 것입니다. - 삽입의 SMC 측에 1 x PBS의 피펫으로 10 µ L.
- 셀 삽입의 한쪽 끝을 아래로 밀고 셀 기중 장치를 사용 하 고 그것에 세포의 용 해 버퍼는 SMC 페 트리 접시에 기중에서 셀 전송
- 일단 셀 기중 기는 접시에 세포의 용 해 버퍼만 진 되었습니다 때까지 그것은 완전히 닦아 종이 타 올에 건조 삽입 필터를 터치를 허용 하지 않습니다. 반복 하는 근 근이 SMC 필터의 적어도 1을 2 번 나머지 SMC 세포 파편을 완전히 제거 하.
- 삽입 필터의 위/EC 쪽에 삽입 하 고 피펫으로 10 µ L 1 x PBS의 켜십시오. 셀 스 크레이 퍼와 EC 페 트리 접시 2.6 및 2.7 단계를 반복 합니다.
- 세포의 용 해 버퍼와 EC 페 트리 접시에 피 펫 및 전송 필터의 EC 측에서 나머지 셀 및 PBS 슬러리를 수집합니다. MEJ 분수에 두고 최소한의 EC/SMC 오염으로 필터의 양쪽 모두에서 세포를 근 근이 살아가고에 아주 철저 하 게.
- 에서는 신중 하 게 메스를 사용 하 여 플라스틱 삽입에서 필터를 잘라. 플라스틱에서 그것의 절단 70-80%에 의해이 작업을 수행 하 고 집게 플라스틱 삽입 구조에서 완전히 필터를 사용 하 여. 세포의 용 해 버퍼, MEJ 표시 50 mL 원뿔 튜브에 필터를 넣고 세포의 용 해 버퍼에 앉아서 젖은 남아 보장.
- 삽입의 모든 처리 될 때까지 6, 그룹의 격리 단계 반복.
- 다른 치료 그룹 별도 튜브와 요리에 보관 됩니다 확인 하십시오.
- 소용돌이 15 전체 강도에 50 mL MEJ 원뿔 튜브 s 또는 잘 혼합 때까지. 집게, 튜브에서 단백질 및 액체의 최대 금액을 떠나로 튜브의 측면 벽을 따라 끌어와 원뿔 MEJ에서 필터를 제거 합니다. 이 시점 후 필터 삭제.
- 모든 필터 MEJ 원뿔 튜브에서 제거 되었습니다 일단 할 한 튜브의 하단에 모든 액체와 단백질을 뽑아 원심 분리기에 빠른 스핀 (최대 속도 ~ 16000 x g에서 10-15 s). 별도, 더 작은 원심 분리기 튜브로 MEJ 튜브와 EC 및 SMC 페 트리 접시의 내용을 전송.
- 옵션: MEJ/SMC/EC 튜브의 내용을 Sonicate에 얼음에 4 세 10의 펄스에 대 한 설정 또는 손으로 부드럽게 균질.
- 4 시 15 분 최대 속도 (~ 16000 x g)에서 원심 ° C. 피펫으로 상쾌한 고 시험의 bicinchoninic 분석 결과 메서드를 사용 하 여 단백질 함량에 대 한 lysate.
3. En 얼굴 면역 형광에 있는 VCCC 수확
- 에 하루 5의 VCCC 인큐베이션, 인큐베이터에서 삽입을 제거. 각 삽입 필터와 린스 1 x PBS와 두 번의 낮은 우물의 SMC 미디어에서 흡입 세포 문화 후드에서 working. EC 측을 가진 반복.
- 부드러운 통에 있는 도보 4 ° C 룸에 10-20 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA) 추가 및 접시에 그대로 삽입을 유지. 5 분에 대 한 1 x PBS와 삽입 필터의 양쪽 모두를 세척 하 고 두 번 반복.
주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다. - 접시는 항 체에는 필터의 양쪽 모두를 유지 + 차단 솔루션 차단, 1 차 및 이차 항 체 외피를 수행 (9 mL PBS, 25 µ L 트리톤 X100, 50 mg 소 혈 청 알 부 민, 500 µ L 정상 혈 청)
- 메스와 플라스틱 삽입에서 필터를 잘라 슬라이드에 필터를 탑재 하는 핸들에 장착 매체와 현미경 슬라이드에 탑재.
4. VCCC 가로 면역 형광 검사에 대 한 수확
- 에 하루 5의 VCCC 인큐베이션, 인큐베이터에서 삽입을 제거. 셀 문화 후드에 삽입 필터의 양쪽에서 미디어에서 흡입 하 고 두 번 1 x PBS와 필터의 각 측면을 린스.
- 그대로 삽입 유지 6 잘 플레이트에 추가 4 %PFA 부드러운 통에 있는 도보 4 ° C 룸에서 밤새 품 어.
주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.
5. VCCC 가로 면역 형광 검사에 대 한 포함
- 필터 후 삽입 약 4%에 24 h에 대 한 해결 되었습니다 PFA, 전송 70 %EtOH 적어도 24 시간, 하지만 몇 주까지.
- 긴 자동된 조직 프로세서에서 실행 (하룻밤)에 필터를 처리 합니다. 다음과 같이 프로그램을 사용 하 여: 70% EtOH 30 분, 85% EtOH 30 분, 95% EtOH 30 분, 100% EtOH 30 분, 100% EtOH 45 분, 100% EtOH 45 분, 크 실 렌 30 분, 크 실 렌 30 분, 크 실 렌 45 분, 60 ° C 파라핀 30 분, 60 ° C 파라핀 30 분 60 ° C 파라핀 45 분
- 액체 파라핀, 카세트에는 필터를 유지로 전송 수확된 필터 포함 역으로 처리 후.
- 는 가장자리에 그냥 잡고 집게를 사용 하 여 신중 하 게 카세트에서 필터를 제거 합니다. 가 위, 반, 필터를 잘라 반쪽 모양의 두 세미 원형 형성. 그냥 오래 포함 채우기 위해 충분히 액체 파라핀과 금형 포함 역의 차가운 접시 부분에 2 반쪽의 각 위치.
- 한번 액체 파라핀으로 가득 찬 격판덮개를 포함 형 터치 매우 간략하게 다음 필터의 각 반 형 (측면 줄이려고)를 포함에 포함; 그러면는, 단면 중 하나 절단 됩니다 가장자리 쪽으로 필터의 중심에서 .
- 포함, 하는 동안를 사용 하 여 집게는 파라핀 혼자 서 서 그들을 위해 충분히 차갑게 될 때까지 서로 떨어지는 반쪽을 방지 하기 위해에서 필터를 잡아. 완전히 경화 될 때까지 차가운 접시 포함 형 이동.
참고: 얼음 쟁반에 블록을 냉각 주름된 섹션을 방지 하는 데 도움이 됩니다.
6. 단면화 및 가로 면역 형광 검사에 대 한는 VCCC 얼룩
- 파라핀 블록에 대 한 단면 및 장착 슬라이드: 5 µ m 섹션 잘라내기, 42 ° C 물 욕조에 섹션을 배치 및 충전 된를 사용 하 여 섹션을 선택 슬라이드입니다. 다음 슬라이드를 건조 42 ° C 오븐에 하룻밤 유지.
- 재 단계를 시작 하기 전에 빵을 60 ° C에 파라핀을 녹기에서 슬라이드와 슬라이드에 VCCC 섹션을 준수 하는 데 도움이. 짧게, 냉각 후 크 실 렌, 100%의 두 가지 변화를 통해 슬라이드를 rehydrate EtOH, 95 %EtOH, 70%의 한 변화 EtOH, 2의 그리고 변화 증류수.
- Microwaving 또는 난방 섹션 수 있습니다 슬라이드에서가로 포함 하는 항 원 검색 방법을 방지.
- 수행 세척 단계 및 이차 항 체 1 시간 실 온에서 다음 4 ° C에서 1 차적인 항 체를 가진 다음 하룻밤 외피, 실내 온도에 1 시간에 대 한 표준 차단. 설치 미디어와 coverslip 탑재.
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Representative Results
필터 삽입 사용 VCCC는 있다 작은, 0.4 µ m 구멍. 그림 1A, VCCC 필터 삽입의 en 얼굴 보기는 MEJ 생체 외에서형성할 수 있다 숨 구멍을 보여줍니다. 회로도 1 일 내 피 세포는 반대 측 (그림 1B)에 도금 하기 전에 필터의 더 낮은 측에 도금 하는 평활 근 세포를 묘사 한다. 일단 세포는 도금 EC, MEJ, 및 SMC 분수 3 일 후에 격리 될 수 있습니다. 이 예제는 그림 2A, 플라스 미노 겐 활성 제 억제 물 1 (파이-1) 또한 MEJs25 vivo에서 에서 볼 수 있는 EC의 나머지 부분에 상대적으로 MEJ 분수 표현 매우에 표시 됩니다. 이러한 데이터에 그대로 arteriolar 혈관 벽 업과 VCCC 유틸리티를 보여 줍니다.
다음 면역 형광 및 전자 현미경 VCCC 시연입니다. 그대로 고 가로 면역 형광 검사에 대 한 고정 PFA는 VCCC 남아 있습니다. 그림 3A 평활 근 특정 알파-1 아드레날린 수용 체와 내 피 특정 bradykinin 수용 체를 보여줍니다. Phalloidin F 걸의 얼룩 그대로 동맥26에서 본 식 복제 두 셀 사이의 MEJ (흰색 화살표)에 걸 다리를 보여 줍니다. 그림 3B, 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 표시 된 대로 VCCC의 횡단면은 시연, 그림 3C에서 3 차원에서 렌더링 되는. 이러한 뷰는 VCCC의 특히 단백질, 수용 체, 그리고 열 대권 외의 생체 외에서 MEJs를 지역화 하는 기능을 보여 줍니다.
그림 1: 혈관 세포 공동 문화 (VCCC) 도금. (A) En 얼굴 빛 숨 구멍의 현미경 사진 삽입 필터. 검은색 화살표는 개별 구멍을 나타냅니다. (B) 회로도 VCCC 도금의 주 1 필터 삽입 하 고 바닥에 SMC 도금의 반전을 표시 됩니다. 하루에 2, EC는 필터의 반대편에 도금 고는 VCCC 수확까지 6 잘 플레이트에이 구조에 남아 있다. 흰색 화살표는 셀 도금은 성장할 것 이다 필터의 측면을 나타냅니다. 눈금 막대 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 단백질 농축은 MEJ에. (A) 알파 globin MEJ (검은 점으로 표시 되는 골드 구슬)에서 식이 마우스 동맥의 면역-전송 전자 현미경 이미지. (B) 서쪽 오 점 식 EC 또는 SMC 분수 대 MEJ 분수에서 풍성 하 게 보여주는 플라스 미노 겐 활성 제 억제 물 (파이-1) 1. 플라스틱 EC 나타냅니다 플라스틱 접시에 성장 하는 EC는 MEJ 형성 하지 않는다. 눈금 막대 = 1 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 가로 면역 형광 고는 VCCC의 가로 섹션에서 전자 현미경 검사 법. 평활 근과 내 피 특정 단백질에 대 한 (A) 얼룩. F-말라 얼룩이 모두 셀 종류와 생체 외에서 MEJ (흰색 화살표)를 통해 이다. 생체 외에서 MEJs 모두 2d (B)의 열 대권 외의를 공부 하는 데 사용 하는 전자 현미경의 예 및 3D (C). 눈금 막대 = 10 µ m (A); 2.5 µ m (B); 세로 약 2.5 µ m와 0.5 µ m 수평 (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
VCCC는 다양 한 MEJs에서 생체 외에서업과 측면에서 이점 하지만 토론의 경우는 VCCC 특정 응용 프로그램에 대 한 이용 될 수 있다 결정할 때. 예를 들어 다른 세포 유형이이 모델 사용할 수 있다면, 그것은 최적화가 필요 합니다. 우리는 기본 인간 세포 사용 하지만 소 aortas24또는 wildtype 또는 녹아웃 쥐에서 세포를 분리 하 여 사용 VCCC1,5,14에서.
VCCC MEJ 격리를 사용 하는 경우 마스터에 가장 중요 한 기술은 MEJ 분수의 순도 초과 내 피 또는 부드러운 근육 세포에 의해 변경 되지 않도록 하는 필터의 철저 한 스크 이다. 우리 나타났습니다 부 럽을 통해 알파 헤모글로빈은 "순수한" MEJ 격리13, 최고의 마커는 내 피 세포 분수 대 MEJ 분수에 강력 하 게 표현 한다. 또 파이-1, MEJ (그림 2)25의 형성을 조절입니다. 우리는 이러한 강력한 MEJ 절연을 위한 특히 좋은 마커 수 있습니다 느낀다. 수확 기술에 더 자신감에 대 한 필터는 수확, 근 근이 살아가고 후 고 EC/SMC 마커25스테인드 될 수 있습니다.
단백질 표정에는 VCCC 이미징 두 가지 주요 방법으로 수행할 수 있습니다: en 얼굴 (그림 1A) 또는 가로 (그림 3). 모두 준비 두 가지 서로 다른 관점에서 필터의 구멍 내의 단백질의 시각화에 대 한 수 있습니다. En 얼굴 기법 동맥을 경도 자르면 다음 평면, 밖으로 향하도록 EC 단층와 IEL, MEJ 형성할 수 있다 유일한 장소에서에서 구멍을 시각화 하는 EC를 고정 한다. IEL의 구멍 내의 형광 신호 MEJ10,27내 단백질의 지 방화를 나타냅니다. 이 같은 원리는 VCCC 파라핀에 포함 또는 섹션을 만들 필요 없이 위에서 EC 단층 영상으로 변환 수 있습니다. 통과 방법은 마스터 더 복잡 하지만 SMC monolayers (그림 3) 대 EC에 단백질의 개별 시각화에 대 한 중요 합니다.
흐름 또는 시스템에서 스트레칭의 부족은 잠재적인 제한 하지만 내 피 부드러운 근육 세포 공동 문화16,19에 흐름을 추가 하려면 가능 합니다. 그것은 정적 조건 여전히 허용 정확한 순수 단백질 식 및 활성화, heterocellular 연락처 MEJ 신호 통로의 해 부의 가장 중요 한 요소는 있을 수 있습니다 나타납니다.
저항 동맥 신호는 VCCC 반드시 특정 세포 유형으로 제한 되지 않습니다 넘어이 기술의 여러 응용 프로그램을 확인 하 고 있습니다. 다른 공동 문화 모델 파생물 내 피 세포 및 osteoblasts17, 활용 또는 내 피와 혈액 뇌 장벽 모델링 그리고 pericyte/사이토 공동21문화. Endothelium 통해 종양 세포의 전이 수 있습니다 또한이 모델21을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 그것은 또한 필터와 문화 다른 셀 paracrine 신호, 테스트 6-잘 접시의 하단에 입력 하거나 셀 (우리의 되지 않은 관찰)의 양극 화를 보면 막의 위쪽 부분에 내 피 세포 성장에 세포 성장을 가능. 백혈구 또는 다른 순환 셀 EC 미디어에 추가할 수 있습니다와 세포의 접착 정량된12수 있습니다. 또한,는 VCCC pathologies 부드러운 근육 마이그레이션24 등 확산 내 피 부상15,18에 대 한 응답을 조사에 사용할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 체 외에서 세포 문화 시스템에서 신호 두 결합 된 셀 형식 간의 프로세스의 조사에 대 한 수 있는 MEJ를 격리 하는 방법을 제시 했습니다. 중요 한 것은, 공동 문화 체계는 MEJ의 연구에 국한 되지 않습니다 하 고 질문, heterocellular 통신을 포함 하는 특히 그들의 숫자를 대답을 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국가 심 혼에 의해 지원 되었다, 폐 및 혈액 학회 R01088554, T32HL007284 및 미국 심 혼 협회 predoctoral 친목 14PRE20420024 부여 합니다. 우리는 특히 세인트 주드 세포 이미징 공유 연구 핵심, 랜달 웨이크필드와 전자 현미경 이미지에 대 한 린다 Horner, 아담 스트로브를 통해 대표적인 면역 형광 이미지, 및 그녀에 대 한 Pooneh Bagher를 포함 하 여 감사 합니다. 원고 프로토콜에 귀중 한 피드백입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
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