Summary
Здесь мы описываем методы, с помощью спиннинг диска confocal микроскопии изображений одного фагоцитарной события мыши-резидентов перитонеальных макрофагов. Протоколы могут распространяться на другие фагоцитирующих клеток.
Abstract
Фагоцитоз играет ключевую роль в принимающей обороны, а также в ткани разработки и обслуживания и включает в себя быстрое, рецептор опосредованный перестановок Цитоскелет актина захватить, конверт и охватить крупные частицы. Хотя фагоцитарную рецепторов, течению сигнальные пути и эффекторы, например Ро GTPases, были определены, динамический цитоскелета ремоделирования рецептор опосредованный фагоцитарной событий остаются неясными. Четыре десятилетия назад, два отдельных механизмов фагоцитоза, подтверждается Fcγ рецептор (FcγR) - и Рецептор комплемента (CR) - опосредованной фагоцитоза, были определены с использованием растровая электронная микроскопия. Связывание иммуноглобулина G (IgG)-опсонизированными частицы FcγRs вызывает выступ тонкой мембраны расширений, которые первоначально образуют так называемые фагоцитарной Кубок вокруг частицы, прежде чем он становится полностью закрытых и убирается в ячейку. В отличие от этого дополнение опсонизированными частиц, по-видимому, погружаются в фагоцитов, после привязки для дополнения рецепторов. Эти два режима фагоцитоза, фагоцитарной Кубок формирования и тонуть, достаточно хорошо отработаны в литературе. Однако различия между двумя режимами становятся размытыми сообщения, что дополнение фагоцитоза рецептор опосредованный может вызвать различные мембраны выступов. При наличии высокого разрешения, методы визуализации, требуются фагоцитоза анализов, которые позволяют визуализации в реальном времени 3D (трехмерных) как специфических рецепторов фагоцитарной посредником поглощения отдельных частиц. Более часто используемые подходы для изучения фагоцитоза, например концевой анализов, упустить возможность, чтобы понять, что происходит на стыке частиц и фагоцитов. Здесь мы описываем фагоцитарной анализов, используя покадровой вращающийся диск confocal микроскопии, которые позволяют 3D визуализации одного фагоцитарной событий. Кроме того мы описываем анализов однозначно изображение Fcγ рецептор - или дополнить рецептор опосредованный фагоцитоза.
Introduction
Двадцать лет до Metchnikoff в наблюдения фагоцитарной Мезенхима клеток в starfish личинки, в 1882 году и последующее развитие его теории фагоцитоза1, Эрнест Геккель описано, в 1862 году полного охвата контейнера пламенем нерастворимых красителей частиц крови клетки fimbris Фетида (Тетис бахромок), видов хищных пули море (Эрнест Геккель. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Георг фон Verlag Раймер, Берлин, 1862). Он явно описал мембраны выступы, обволакивающий частицы, которые впоследствии были рассмотрены в цитоплазму и накопленных вокруг клеточного ядра. Более чем 100 лет спустя, первопроходца исследование Каплан предположил, что существуют по крайней мере двух морфологически отдельных механизмов фагоцитоза2. Каплан показали посредством растровая электронная микроскопия мыши перитонеальных макрофагов организм IgG опсонизированными овец красных кровяных клеток с помощью тонкой мембраны расширений, которые достигли вверх и плотно обволакивает частицы, первоначально порождая Кубок как структура. Формирование фагоцитарной Кубок требуется актина полимеризации, поскольку он был отменен клетки проницаемой грибковых токсин cytochalasin B, известный блокировать актина динамика3. В отличие от овец красные кровяные клетки опсонизированными с дополнением появился погрузиться непосредственно макрофага без поколение мембранных расширений, хотя, в некоторых изображений, оборками мембраны можно увидеть в непосредственной vacinity тонуть частиц. В отличие от формирования фагоцитарной Кубок дополнением рецептор опосредованный тонуть был без учета регистра для лечения cytochalasin B2. В экспериментах, описал Каплан, дополнением опсонизацию была исполнена инкубации иммуноглобулина М (IgM) помечены овец красные кровяные клетки с сывороткой от мышей дополнением C5-дефицит, который обходит гемолиз в дополнение C5-зависимых терминал дополняют комплекс.
Два режима фагоцитоза, фагоцитарной Кубок формирования и тонуть в, определены Каплан стали установившейся мнение в поле4,5,6,7,,8,9 . Однако, ультра-высоким разрешением изображения используется в первоначальное исследование Каплан2, а также аналогичное исследование по Мунте-Каас и др. 10, только предоставить снимки фагоцитарной событий. В недавнем обзоре, Rougerie и др. 11 подчеркнул, что морфологические различия между FcγR и CR-опосредованной фагоцитоза еще предстоит уточнить, и, Кроме того, мембраны оборками наблюдались во время дополнением рецептор опосредованный частиц поглощения2. Жить клеточной изображений одного фагоцитарной мероприятий, охватывающих от захвата частиц для интернализации, в сочетании с генетически изменение модели мыши, может значительно улучшить наше понимание как фагоцитов захвата и глотать частиц. Один из подходов может быть использовать быстро атомно-силовой микроскопии (АСМ), который позволяет топографических изображений сверхвысокого разрешения (10-20 Нм) живых клеток. Недавно был разработан быстро AFM системы12 , который подходит для визуализации поверхности клетки быстро с низким уровнем шума. Этот метод имеет то преимущество, что с высоким разрешением, топографических и механических параметров живых клеток могут быть измерены в короткие промежутки времени (в секундах), в отличие от растровая электронная микроскопия, который требует фиксации и сушка критической точки клетки. Другой подход — промежуток времени 3D confocal микроскопии, который широко доступен, хотя Фототоксичность и отбеливания ограничивающих факторов во время записи. Этот подход очень универсальна и позволяет оптической секционирование с высоким пространственным разрешением и позволяет чрезвычайной гибкости в маркировки с ошеломляющие спектр флуоресцентных зондов, в том числе генетически закодированный флуоресцентных белков. Здесь мы описываем фагоцитоза анализов с использованием покадровой вращающийся диск confocal микроскопии, которые позволяют высокого разрешения пространственно-временных событий рецептор опосредованный фагоцитарной.
Protocol
Протоколы, следуйте руководящих принципов Комитета по этике наших местных исследований человеческого, а также руководящие принципы ухода за животными.
1. изоляция-резидентов мыши перитонеальных макрофагов
- Пожертвовать мышь (3 – 4 месяцев (любого пола); например Штамм C57Bl/6) с помощью передозировка летучих анестетиков изофлюрановая (> 5% в воздухе) или углекислого газа13, следуют шейки матки дислокации. Индукции анестезии можно легко оценить потери выпрямляющий рефлекс14, а также потери лапы вывода рефлекс.
- После очистки живот мыши с 80% этанола в воде, сделать разрез кожи срединной и предоставляют базовый брюшной стенки.
- Место 24-G катетера в peritonium и промывание полости с 2 x 4.5 мл ледяной Хэнк буфферезированный раствор соли (HBSS), без Ca2 + и Mg2 +через Пластиковый шприц 5 мл. Во время инъекций, оставить около 0,5 мл остаточного HBSS (5 – 4,5 мл (вводится) = 0,5 мл) в шприц в случае ткани всасывается в кончик катетера и должен быть исключен. Перевод без наддува подвеска на 14 мл полипропиленовые раунд дно трубки и центрифуги на 300 x g 6.5 мин при комнатной температуре.
Примечание: Кончик катетера, Блант, который, по сравнению с иглой, сводит к минимуму повреждение содержимого брюшной полости. Как правило следующие нежный массаж живота, 8 мл суспензии брюшной клеток могут быть извлечены из брюшной полости. - Отменить супернатант и Ресуспензируйте брюшной клеток в 1 мл раствора бикарбоната бесплатно RPMI 1640 носитель, содержащий 20 мм Hepes, 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным и антибиотиков, как пенициллин (100 единиц/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), подготовленный Разбавление 100 x пенициллина/стрептомицина 1: 100. Это обычно дает в концентрации около 6 x 106 клеток/мл.
Примечание: Около 30% от изолированных перитонеальный клеток являются макрофагов, в то время как другие (меньше) клетки являются лимфоциты, преимущественно лимфоцитов.
2. Заполнение брюшной клеток в канале слайды
-
После закупорить суспензию клеток вверх и вниз, чтобы уменьшить слипания, Пипетка 100 мкл подвеска в предварительно заполненный канал (объем, 100 мкл) слайда с покрытием фибронектин канал (канал 100 мкл имеет размеры (длина x ширина x высота): 50 x 5 мм 0,4 мм).
- Заполнять палата, добавив 1 мл сыворотки дополнить RPMI 1640 (Hepes) средний к одному из двух резервуаров канала слайд, наклона слайд и затем аспирационных среднего из вниз по течению водохранилища (рис. 1).
- Удаление ненужных воздушные пузыри, или длинные полоски воздуха, в канале путем добавления 1 – 2 мл среднего к одному из двух резервуаров, плотно применения водохранилище крышкой и затем откачки воздуха через художественной палец давление на крышку и, при необходимости, наклоняя слайд. После изгнания воздух, наклона слайд с раскрытый водохранилище (и содержащие среднего) вниз, прежде чем снимать крышку, чтобы избежать воздух всасывается обратно в канал.
- Заполнять палата, добавив 1 мл сыворотки дополнить RPMI 1640 (Hepes) средний к одному из двух резервуаров канала слайд, наклона слайд и затем аспирационных среднего из вниз по течению водохранилища (рис. 1).
- Инкубировать канала слайд, семенами с клетками, во влажной камере втечение 2 ч при 37 ° C в отсутствие CO2 (CO2 не требуется поскольку HCO3-/CO2 буферная система заменяется на Hepes). Канал слайды могут удобно размещены на стойку, которая проводит восемь слайды. Как правило 6 – 8 слайдов готовятся из одной мыши, хотя до возможен до 10 или более.
-
Снимите решетку и обмена среднего RPMI 1640 (Hepes) в каждый слайд для RPMI 1640 средних содержащего бикарбонаты, дополнена плода бычьим сывороточным 10%, а также пенициллин/стрептомицина.
- Наклона слайд и аспирационная средне сначала из нижнего водохранилища и затем из верхнего водохранилища. Далее добавьте 1 mL новой среды к одному из водохранилищ, наклона слайд и аспирата среднего из вниз по течению водохранилища, после того, как она вытекала через канал.
- После этого шага мыть (средний обмен) заполните канал слайд, добавив 1 мл среднего к одному из водохранилищ.
Примечание: Мытье шаги с помощью канала слайды является очень простым и эффективным с точки зрения решения обмена и удаление ячеек не сторонник. Обратите внимание, что средство RPMI 1640 (бикарбонат) обычно предварительно инкубируют с 5% CO2 на ночь для обеспечения тепловой и pH равновесия.
- Инкубируйте клетки на ночь при 37 ° C в увлажненные инкубатор с 5% CO2. Проводить эксперименты на следующий день.
3. изоляция человека красных кровяных клеток
- На 2 день (второй день экспериментов; после ночи инкубации изолированных перитонеальных макрофагов), собирать 1 – 2 мл периферической венозной крови от здорового донора, в гепаринизированным трубку. Передача 1 мл в трубку 2.0 мл (полипропилен) microcentrifuge круглым дном, центрифуги на 300 x g 5 минут при 18 ° C (эмпирические параметр) и удалить супернатант (плазмы и Баффи пальто).
- Аккуратно аспирационная 100 мкл отложившейся красных кровяных клеток и смешивать этот том 1:1 с изменение средних RPMI 1640 (Hepes) (см. ниже) в пробки microcentrifuge 2.0 мл круглым дном. Этикетке трубки «1:1».
Примечание: Средство RPMI 1640 (Hepes), используется на 2 день (для анализов) после изоляции клеток содержит, помимо 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, пенициллин (100 единиц/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и 1 мм N-(2-mercaptopropionyl) глицин (для уменьшения Фототоксичность). Далее это средство называется «измененные» среднего RPMI 1640 (Hepes). - Пипетка 4 мкл суспензии 1:1 разреженных красных кровяных клеток в 2 мл изменение средних RPMI 1640 (Hepes), предварительно накапаны в трубку microcentrifuge 2.0 мл (повторить этот шаг, т.е. готовить 2 трубы). Этикетке каждой трубы «оборудованию». Место «1:1» и «оборудованию» трубы на льду.
4. Маркировка макрофагов плазматической мембраны
- Удаление канала в сеяный слайды из CO2 инкубатора и обмена RPMI 1640 (бикарбонат) среднего в каждый слайд для изменение средних RPMI 1640 (Hepes). Далее поместите клетки во влажной камере при 37 ° C в отсутствие CO2.
Примечание: После ночи инкубации и мытья, большинство лимфоцитов, удаляются из канала. Большинство оставшихся адэрентных клеток являются макрофаги, которые могут быть определены морфологически или путем пятнать иммунофлюоресценции с использованием антител анти F4/80. Около 95%-резидентов перитонеальных макрофагов мыши являются F4/80 положительный. - Разбавьте дневно зеленые помечены анти мыши F4/80 антитела (хранить при 4 ° C) 1:40 в среде изменение RPMI 1640 (Hepes). Возьмите слайд, наклоните его и Пипетка (по капле) 100 мкл антител смеси в отверстие канала 100 мкл слайда (см. Рисунок 1). Аспирационная среда, которая впадает в нижнем водохранилище. Инкубируйте клетки для 20 минут при 37 ° C (увлажненной среде, без CO2). Инкубационный период ярлык человека красных кровяных клеток (см. раздел 5).
Примечание: Как упоминалось выше, CO2 не требуется поскольку HCO3-/CO2 буферная система заменяется Hepes. - После 20 минут время инкубации (во время которого человека красные кровяные клетки витражи и опсонизированными), мыть слайд, добавив 1 мл изменения средних RPMI 1640 (Hepes) и один из водохранилищ и аспирационных среды после того, как она вытекала через канал, способствовало наклона слайд. Добавьте 1 мл среды для краткосрочного хранения или провести эксперимент (т.е., дозирование частиц (опсонизированными эритроцитов в крови) и визуализации фагоцитоза, покадровой вращающийся диск confocal микроскопии).
5. Маркировка плазматической мембраны человека красных кровяных клеток
- Начинают маркировки человека красных кровяных клеток, сразу же после инкубации слайд макрофагов с зеленым дневно обозначенные антитела анти F4/80 (после раздел 4.2). После смешивания нежный, взять 400 мкл от одной из труб «оборудованию» (см. раздел 3.3) и распределить его в пробирку microcentrifuge 2.0 мл (круглая снизу). Дать время для подвески согреть до 37 ° C (см. пункт ниже). Добавление пятно оранжевый/красный флуоресцентные плазматической мембраны 0,4 мкл (аликвоты температуре-20 ° C), смешать и инкубировать при 37 ° C за 5 мин.
Примечание: Подогреваемый алюминиевый блок, внутри Ламинарный шкаф, полезен для минимизации потерь тепла при подготовке слайдов. Трубы могут быть помещены в скважины Отопление блока и отдельное, или комплексных, подогревом алюминиевая пластина может служить в качестве рабочего пространства. - После 5 минут инкубационного периода Подготовьте первый шаг мыть, добавив 1600 мкл изменение RPMI 1640 (Hepes) средний (заполнять пробки microcentrifuge 2.0 мл).
- Центрифуга трубки на 300 x g 5 минут при 18 ° C (эмпирические параметр). Компактный красный Пелле должен быть виден на стене (то есть, вне центр) в нижней части трубки. Поворот трубы так, что гранулы вверх и тщательно удалить все супернатант последовательно (в два этапа) с помощью кончика пипетки 1 – 1.5 мл.
- После аспирационных супернатанта, добавить 2000 мкл изменение RPMI 1640 (Hepes) средний, микс (Ресуспензируйте клетки) и повторите описанные выше шаги стремление центрифугирования и супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле (мембраны плазмы витражи и 2 x промывают красных кровяных клеток) с 400 мкл изменение среды RPMI 1640 (Hepes). Этикетке трубки PMS (аббревиатура для плазматической мембраны пятно).
Примечание: в качестве альтернативы, succinimidyl эфира рН чувствительных родамин производного инструмента, который становится все более решительно флуоресцентные в кислой рН, могут быть использованы для ярлык человека красных кровяных клеток. В этом случае интенсивности флуоресценции дополнительно служит мерой фагосомы созревания после усвоили частиц.
6. opsonization (маркировки) красных клеток крови человека с мыши иммуноглобулина G (IgG)
- Добавить 1 мкл мыши (IgG2b) моноклональные (клон HIR2) антинародным CD235a антитела (1 мг/мл) (хранятся при температуре-20 ° C) для трубки помечены PMS (см. разделы 5.2 – 5.5), содержащие плазматической мембраны окрашенных человека красных кровяных клеток, приостановлено в 400 мкл среде. CD235a (также известный как Гликофорины A) является sialoglycoprotein линии конкретных мембраны клеток.
-
Инкубируйте при 37 ° C 8 мин Примечание что опсонизацию человека красных кровяных клеток с IgG причины агглютинации (ячейка слипания). Хотя Агглютинация может служить индикатором визуального опсонизацию, это нежелательно для изображений одного фагоцитарной эффектов. Чтобы обойти агглютинации, неоднократно перемешать суспензию клеток (каждые 1 мин), с помощью, например, переменной объем Пипетка 20-200 мкл значение 200 мкл.
- К концу 8 мин инкубационного периода Если желаемого, стирать слайд макрофагов, инкубировали с зеленым дневно помечены антитела анти F4/80, с 1 мл изменение среднего RPMI 1640 (Hepes). Убедитесь, что оба водохранилища канал слайд свободны от среднего после стирки шаги.
7. imaging фагоцитоза плазматической мембраны витражи и IgG покрытием человека эритроциты
- После инкубации 8 мин с анти CD235a антитела (раздел 6.2), Пипетка 100 мкл суспензии, содержащей плазматической мембраны окрашенных и опсонизированными IgG человека красных кровяных клеток в канал слайд, содержащий макрофагов, отмеченные зеленым флуоресцентные анти F4 / 80 антитела (шаг 4). Таким образом Зеленый флуоресцентный фагоциты (макрофаги) добавляются красных флуоресцентных, IgG опсонизированными человека красных кровяных клеток.
- Как только были добавлены человека красных кровяных клеток, смонтировать слайд канала на вращающийся диск конфокального микроскопа (с этап-инкубатор, набор до 37 ° C) для обработки изображений, например, через 60 X / 1,49 нефти погружение объектива. Начало обработки изображений как можно скорее, поскольку частицы начинают селиться в течение 1 мин.
Примечание: Использование флуоресцентных бисер диаметром 100 Нм, мы измерили, путем анализа точки распространения функций, XY резолюций x = 0,22 мкм, y = 0,23 мкм (488 нм лазер) и x = 0.27 мкм, y = 0.27 мкм (561 Нм лазер). Однако чтобы уменьшить Фотообесцвечивание и Фототоксичность во время промежуток времени 3D визуализации живых клеток, мы компромисса пространственное разрешение, используя биннинга 2 x 2. Биннинга увеличивает чувствительность (улучшает отношение сигнал шум) и допустимую частоту кадров, но за счет пространственным разрешением. - Использование идеальной фокусировки (или аналогичный) системы для предотвращения смещения фокуса во время записи. После активации системы идеальной фокусировки, используйте элемент смещения сосредоточиться на макрофагов lamellipodial выступами непосредственно над coverslip (см. Примечание ниже) канала слайда. Этот фокус уровень соответствует Z = 0 мкм. получить Z-стеки-1 мкм до + 16 мкм на 0,8 мкм шагов, который составляет 22 Z-ломтики. Z-стеки можно например, получить в размере 1 стека (для каждого канала) каждые 15 s для в общей сложности 16 мин.
Примечание: Записи дольше страдают от потери качества изображения, главным образом из-за Фотообесцвечивание. Z-стеки приобретаются для каждого из двух каналов: макрофаги отражаются с помощью 488 нм лазер (зеленый канал) и человека красные кровяные клетки отражаются с помощью лазера 561 Нм (красный канал). Используя этот подход, можно получить различные виды макрофагов, глотая опсонизированными IgG человека красных кровяных клеток в разных timepoints (например, см. Рисунок 2).
Примечание: Типичные параметры системы (с 2 x 2 биннинга) являются: зеленый канал (20,5% лазер (50 МВт; 488 нм) мощность, 101 чувствительность (диапазон 0-255) и время воздействия 200 мс); красный канал (10,5% лазер (50 МВт; 561 Нм) мощность, 101 чувствительность (диапазон 0-255) и время воздействия 98 МС).
Примечание: В нижней части канала слайд представляет собой полимер с той же толщины, как же оптические свойства стекла и стекла #1.5 coverslip, но, прежде всего, материал имеет преимущество газопроницаемость.
8. изображений фагоцитоза плазматической мембраны витражи и дополнения покрытием человека красные кровяные клетки
- Дополнения opsonize плазматической мембраны витражи и опсонизированными IgG человека красные кровяные клетки аналогично разделы 5 и 6, за исключением, вместо дозирования 4 мкл подвеска 1:1 разреженных красных кровяных клеток в среду RPMI 1640 (Hepes) 2 мл изменены, как описано в разделе 3.3, Пипетка 4 мкл в среду RPMI 1640 (Hepes) 1 мл изменения и соответственно этикетке трубки 4:1, 000. Таким образом человеческий красные кровяные клетки являются 2 x больше сконцентрированы.
- Выполните действия в разделах 4 и 5, но начиная с 4:1,000, вместо того, чтобы 4:2,000 разбавленный фондового человека красных кровяных клеток (4:1, 000 и 4:2,000 ссылаются на последующих разведениях первоначально 1:1 разреженных человека красных кровяных клеток, описаны в разделах 3.1 и 3.2).
- Жертву C5 null мыши (например, B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Лаборатория Джексон) при вдыхании изофлюрановая (> 5% в воздухе), следуют обезглавливание и собирать кровь. Мы обычно закапать около 0,8 мл крови в круглым дном 14 мл пластиковые трубы сразу после ингаляции изофлюрановая и обезглавливание.
- После 1 h когда кровь полностью свернувшийся, передачи остаточной жидкости в пробки microcentrifuge 2.0 мл и центрифуги на 300 x g 5 мин при комнатной температуре. Впоследствии, тщательно собирайте желтоватым сыворотки. Как правило мы восстанавливаем по крайней мере 200 мкл C5 null сыворотки. Место C5 null сыворотки на льду.
- После 4 минут инкубации плазматической мембраны пятнами человека эритроциты с IgG, другой 1 мкл антител анти CD235a (предоставление 2 x концентрации) и затем принять 50 мкл суспензии клеток и смешать его в отдельном 2.0 мл microcentrifuge тубы 50 мкл C5 null Сыворотка. Продолжайте смешивать неоднократно (каждые 1 мин), закупорить вверх и вниз, как и раздел 6.2, еще 4 мин. Таким образом после этого шага, человека красные кровяные клетки были инкубировали с анти CD235a антитела для в общей сложности 8 мин.
Примечание: Инкубационный период 4 мин с null сыворотки C5 достаточно активировать классической дополнением Каскад и opsonize человека красные кровяные клетки с C3b, который расщепляется на коэффициент я к iC3b.
9. подтверждение из IgG - и C3b-опсонизацию человека красных кровяных клеток
-
Подтвердите опсонизацию человека красных кровяных клеток с мыши анти CD235a антитела IgG (IgG2b; см. раздел 6.1), инкубации клеток с Коза анти мыши (вторичного) IgG антитела конъюгированных с зеленой или красной флуоресцентной Флюорофор.
- Добавить 1 мкл мыши анти CD235a IgG антитела и 1 мкл дневно обозначенные анти мыши вторичные антитела к приостановке 400 мкл человека красных кровяных клеток и инкубировать при 37 ° C 8 мин. Впоследствии мыть дважды (как и разделы 5.2 – 5.5).
- Ресуспензируйте клетки лепешка с 400 мкл изменение RPMI 1640 (Hepes) среднего и пипетки 100 мкл суспензии в канал слайд (см. рис. 1 c) для воображения confocal флуоресценции.
Примечание: Клетки будет комок (клееный) после мытья и ресуспендирования, но стирки необходимо снизить фон флуоресценции благодаря несвязанные вторичные антитела.
-
Подтвердить опсонизацию человека красных кровяных клеток, предварительно помечены с помощью мыши IgG и инкубировали с сывороткой C5 null мыши, C3b/iC3b с помощью, например, крыса анти мыши C3b/iC3b/C3c антитела и вторичные антитела, например, коза анти крыса IgG антитело проспряганное для Зеленый флуоресцентный Флюорофор.
- Повторите шаги в раздел 8, используя неокрашенных человека красных кровяных клеток.
- 0,25 мкл дневно помечены анти мыши C3b/iC3b/C3c антитела к 100 мкл смеси (50 мкл IgG меченых красных клеток крови человека + 50 мкл C5 null мыши сыворотки) и инкубировать при 37 ° C 8 мин.
- Мыть дважды, Ресуспензируйте Пелле в 100 мкл изменения средних RPMI 1640 (Hepes) и пипетки подвеска в канал слайд (см. рис. 1 c) для воображения confocal флуоресценции.
Representative Results
Принципиальная схема канала слайда используется для визуализации фагоцитоза покадровой спиннинг confocal микроскопии показано на рисунке 1. Человека красных кровяных клеток (hRBCs) окрашенных с красной флуоресцентной плазматической мембране маркер оранжевый CellMask, тогда как изолированные мыши-резидентов перитонеальных макрофагов (МС) помечены зеленым флуоресцентные Alexa Fluor 488-конъюгированных анти F4/80 антител ( Рисунок 2), который служит в качестве определенного маркера мыши макрофагов и метку плазматической мембраны. Человека красные кровяные клетки могут опсонизированными с мыши IgG (mIgG), или мыши IgM (mIgM), по инкубации клеток с IgG (или IgM) антитело анти CD235a (CD235a, также известный как Гликофорины A, является белок конкретно выразили на человека красных кровяных клеток). Промежуток времени 3D визуализации Зеленый флуоресцентный макрофагов с красной флуоресцентной человека красных кровяных клеток позволяет визуализацию одной частицы фагоцитарной событий (рис. 2). Тщательное наблюдение один фагоцитарной событий позволяет подробности захвата частиц и приеме внутрь, чтобы быть разграничены. Например захват mIgG опсонизированными человека красных кровяных клеток, filopodium макрофагов, тонкий, палец как проекции, можно наблюдать (рис. 3A; см. также Horsthemke и др. 15). Кроме того, сжимая человека красных кровяных клеток во время формирования фагоцитарной Кубка можно наблюдать (рис. 3A). После введения сыворотки свежие мыши, mIgG опсонизированными, или mIgM опсонизированными, человека красные кровяные клетки триггер классической дополнением Каскад, которая завершается в формировании комплекса нападения гемолитический мембраны. Кинетика дополнение опосредованной гемолиз может быть измерен изображений клетки двойной окрашенных с CellMask оранжевый и Флуорексон. Зеленый флуоресцентный цитозольной Флуорексон быстро освобождается от клеток во время гемолиз (рис. 3B).
Рисунок 1: обработка фибронектин покрытием канала слайдов. (A) A слайд канал состоит из двух водоемов, соединены каналом с размерами 50 мм х 5 мм 0,4 мм. канал слайды первоначально заполнено автоматически путем применения 1-2 мл среднего к один из двух водоемов и наклона слайд. (B) колпачки могут быть размещены на водохранилища до инкубации. Колпачки могут быть удобно использовать для откачки нежелательных воздушных пузырей до посева канал с ячейками. (C) воздушный пузырь бесплатно 100 мкл канал могут быть заполнены непосредственно закупорить среднего в устье канала. Этот шаг используется, например, для семян макрофагов в слайд или добавить gfluorophore (Зеленый флуоресцентный)-конъюгированных антител анти F4/80, который служит метку мембраны, а также маркер макрофагов мыши. (.D) после дозирование частиц, таких как опсонизированными человека красных кровяных клеток, в канал семенами с дневно окрашенных макрофагов, слайд может быть размещен на стадии инвертированным микроскопом, и может быть покадровой вращающийся диск confocal микроскопии выполняется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: промежуток времени 3D визуализации фагоцитоза. (A) Схематическая диаграмма, показывающая опсонизацию плазматической мембраны, витражи (красная лампа дневного света) человека красных кровяных клеток (hRBCs) с мышь (m) анти CD235a иммуноглобулина G (mIgG) антител и презентация помечены hRBCs для мыши макрофагов (МС), помечены зеленый флуоресцентные Флюорофор конъюгированных антител анти F4/80 (зеленая лампа дневного света). (B) Промежуток времени изображения (XZ взглядов), полученные при вращении диска confocal микроскопии, показывая фагоцитарной Кубок формирования и употребления опсонизированными mIgG hRBCs. Шкалы бар = 10 мкм. (C) 3D реконструкций показаны макрофагов, глотая опсонизированными mIgG hRBCs. Соответствующие мнения XZ (за 3 timepoints) отображаются в B. Grid расстояния представляют 5.07 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: захватить частицы, filopodium. Промежуток времени изображения, полученные при вращении диска confocal микроскопии, показаны мыши макрофагов, захват мыши иммуноглобулина G (mIgG)-опсонизированными человека красных кровяных клеток (hRBC) через filopodium (стрелки на верхней панели), палец как проекция. Обратите внимание, что красных кровяных телец теряет свою crenations рано во время формирования фагоцитарной Кубок. Кроме того фагоцитарной Кубок, как представляется, выжать запечатанная красных кровяных клеток (обозначается стрелками в нижней панели). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Подавляющее большинство анализов фагоцитоза, особенно конечной точки и высок объём анализов, не обеспечивают визуализация как частицы являются фактически захватили, охватило и проглотить. Новаторские исследования Мунте-Каас и др. 10 и2 Каплан в 1970-х предложил, что разительно отличается цитоскелета реорганизации были вовлечены в фагоцитоз опсонизированными IgG против дополнения опсонизированными частиц (овец красных кровяных телец). Здесь мы описываем фагоцитоза анализов, используя вращающийся диск confocal микроскопии, которые позволяют высокого разрешения, в реальном времени изображений одного фагоцитарной событий. Наша модель фагоцитов является мышь-резидентов перитонеальных макрофагов, которые могут быть изолированы с минимальной обработкой, и мы используем свежевыделенных клеток крови человека красный как частицы. Однако анализов фагоцитоза могут применяться к другим фагоцитов, например мыши костного мозга, полученных макрофаги или нейтрофилов, мыши макрофагов клеточных линий, человека моноцитарных макрофаги или нейтрофилов периферической крови человека. В случае человека фагоцитов или мыши нейтрофилов альтернативные дневно помечены антитела потребуются, например дневно обозначенные анти CD14 антител (человека моноцитов/макрофагов)16 или анти Gr-1 (Ly - 6 G) антител (мышь Нейтрофилы).
Unopsonized человека красных кровяных клеток, как традиционно используемые овец красных кровяных клеток, инертным в том смысле, что эти клетки являются не (или, по крайней мере, очень редко) заглатывается мыши перитонеальных макрофагов. Это гарантирует, в отличие от шарики полистироля, низкой фоновой активности. Человека красные кровяные клетки может быть удобно опсонизированными с иммуноглобулинов, с помощью мыши IgG и IgM моноклональных антител против CD235a (Гликофорины A), маркер конкретного человека эритроцитов (эритроцитов) и эритроидные прекурсоров17, 18. в параллельных анализов, дневно обозначенные анти мыши IgG и IgM вторичные антитела могут быть применены для подтверждения опсонизацию. Антитела класса IgG и IgM, hemagglutinins, вещества (антитела), которые вызывают красные кровяные клетки для склееных. Чтобы избежать агглютинации, мы периодически смешать суспензию клеток в инкубационный период 8 мин с антитела анти CD235a, а затем мы добавить смешанные подвеска непосредственно на макрофагов содержащих канал слайд (с покрытием фибронектин слайд) без мытья шаг . Мыть шаги включают оседания эритроцитов крови центрифугированием, который сильно способствует агглютинации. Перед opsonizing человека красных кровяных клеток, мы обозначаем плазматической мембраны с липофильного флуоресцентного зонда оранжевый/красный. Этот зонд ярко флуоресцентные в начале покадровой записи, но сигнал постепенно исчезает, вероятно объясняется Фотообесцвечивание19. Кроме того слабо оранжевый/красный флуоресцентные во время записи может стать макрофагов и фибронектин покрытие слайда. Эта проблема является предположительно из-за недостаточной стиральных после маркировки человека красных кровяных клеток. Вместо того, чтобы с помощью маркера липофильных флуоресцентных плазматической мембраны, человека красные кровяные клетки могут быть помечены с рН чувствительных родамин производной, используя его Амин реактивной succinimidyl эфира15,20. Это имеет то преимущество, позволяя визуализации фагосомы созревания, так как интенсивность флуоресценции увеличивается с уменьшением рН15,20, но этот подход имеет недостаток, что реактивный Эстер препараты в настоящее время дорого и нестабильной после растворения в водной среде.
IgG опсонизированными человека красные кровяные клетки попадает через FcγRs, который может быть подтверждено, что использование перитонеальных макрофагов изолированы от NOTAM21 или Fcer1g- / - (Fcer1g нокаут) мышах. NOTAM макрофаги привязать опсонизированными IgG человека красных кровяных клеток, но не хватает ИТПМ (immunoreceptor активации тирозин-на основе motif) - опосредованной сигнализации необходимо побудить фагоцитоза, тогда как Fcer1g нокаут макрофаги не выражают поверхности FcγRs. IgG - или IgM опсонизированными человека красные кровяные клетки могут дополнительно опсонизированными с C3b (который расщепляется до iC3b), инкубации клеток с свежевыделенных сыворотки от null мыши дополнение C5 (одичал тип сыворотки вызывает гемолиз). Опсонины, IgG и IgM активировать классический дополнение Каскад, которая приводит к образованию поры (мембраны атаки комплексы) и lysis клетки. В мышей, не хватает дополнением C5, Каскад дополнением приступает к дополнения C3 расщепления, но C5 конвертазы хватает субстрата, необходимые для ускорения терминала путь. Мы разработали простой анализов для измерения кинетики дополнением Каскад. Короче говоря человека красные кровяные клетки могут быть совместно помечены красной флуоресцентной, плазматической мембране маркер и Зеленый флуоресцентный, цитозольной Флюорофор. После формирования комплекса нападения мембраны, образованный компонентами комплемента C5-C9, цитозольной Флюорофор это быстро (в секундах) потеряли от цитозоль. Визуализация конце эффекторных (цитолиза) функции дополнения Каскад указал, что время инкубации 4 мин является достаточно для C3b/iC3b опсонизацию человека красных кровяных клеток. В параллельных анализов C3b/iC3b покрытие человека красных кровяных клеток можно легко оценить после применения смесь анти мыши C3b и дневно помечены вторичные антитела. В этом случае мыть шаг необходим для удаления несвязанных флуоресцентных антител. Хотя шаг мыть включает sedimentaion клетки центрифугированием, который способствует агглютинации, успешно опсонизацию можно легко оценены confocal микроскопии. Дополнением рецептор опосредованный фагоцитоза может отражаться либо применение IgG- / iC3b-опсонизированными человека красные кровяные клетки к нотам или Fcer1g- / - макрофаги или путем введения IgM- / iC3b-опсонизированными человека красные кровяные клетки к одичал тип макрофагов. ИТПМ содержащих FcγRs (FcγRI, FcγRIII и FcγRIV) для фагоцитоза IgG опсонизированными частиц22не распознаются IgM опсонизированными клетками крови.
Чтобы изображение фагоцитарной события, плазматической мембраны макрофаги могут быть помечены конъюгированных антител анти F4/80 Зеленый флуоресцентный Флюорофор, который также служит в качестве определенного маркера мыши макрофагов. Человека красные кровяные клетки могут подготавливаться красный флуоресцентные по инкубации с маркер оранжевый/красный флуоресцентные плазматической мембраны, как обсуждалось выше. Этот маркер липофильных плазматической мембраны позволяет избежать потенциальных смешанные эффекты на основе антител этикеток. Красных флуоресцентных человека красных кровяных клеток, с или без опсонизацию, можно непосредственно накапаны в 100 мкл канал канал слайда и 3D покадровой образы через 60 X / 1,49 масло погружения (или аналогичный) объектив с использованием 488 нм и 561 Нм лазерные линии , соответственно, из микроскопом конфокальный (или аналогичный) диск спиннинг. Это соблазн оптимизировать систему для изображений с высоким разрешением, но приобретение неоднократные Z-стеки свыше 16 мин или может вызвать значительные Фотообесцвечивание и Фототоксичность. Мы решили использовать 2 x 2 биннинга поощрять хорошее соотношение сигнал шум и позволить сокращения интенсивности возбуждения и/или времени экспозиции, но за счет оптическое разрешение. Кроме того чтобы уменьшить Фототоксичность, мы добавить мусорщика реактивнооксигенных видов на носитель. В будущих исследований анализов может быть изменен для изображения фагоцитоз apoptotic человека красных кровяных клеток. Приложение Ca2 + ionophore, например A23187, может использоваться для побудить Фосфатидилсерин экстернализации23, «съешь меня» сигнал и отличительной чертой ранних апоптоз24,25.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантов га 3271/4-1 и га 3271/4-2 от DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) и Грант FF-2016-05 от EXC 1003 (кластер Excellence-1003), клетки в движении (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
- Tauber, A. I.
- Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
- Cooper, J. A.
- Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
- Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
- Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
- Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
- McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
- Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
- Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
- Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
- Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
- Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
- Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).
