Summary
Questo protocollo descrive la labyrinthectomy chirurgica di un topo, che è un metodo utile per lo studio del sistema vestibolare.
Abstract
Per studiare il sistema vestibolare o il processo di compensazione vestibolare, un numero di metodi è stato sviluppato per causare danno vestibolare, tra cui labyrinthectomy chirurgica o chimica e neurectomia vestibolare. Labyrinthectomy chirurgica è un metodo relativamente semplice, affidabile e rapido. Qui, descriviamo la tecnica chirurgica per ratto labyrinthectomy. Un'incisione postauricular fatta in anestesia generale per esporre il canale uditivo esterno e la membrana timpanica, dopo di che la membrana timpanica e gli ossicini vengono rimossi senza stapes. L'arteria dello stapes, che si trova tra la staffa e la finestra ovale, è una struttura vulnerabile e dovrà essere conservato per ottenere un campo chiaro chirurgico. Un buco a fenestrate il vestibolo è realizzato con una fresa trapano 2,1 mm superiore a stapes. Poi, 100% etanolo è iniettato attraverso questo foro e aspirato più volte. Dissezione meticolosa sotto un microscopio e un attento controllo del sanguinamento sono essenziali per ottenere risultati affidabili. Sintomi di perdita vestibolare, quali nistagmo, inclinazione testa e un movimento di rotolamento, sono visibili immediatamente dopo la chirurgia. Il test di sedia rotarod o rotazione può essere utilizzato per oggettivamente e quantitativamente valutare la funzione vestibolare.
Introduction
L'organo vestibolare è essenziale per il controllo di equilibrio e con gli occhi. Una normale funzione vestibolare dipende simmetrici segnali afferenti dagli organi vestibolari nei due orecchi interni. Ipofunzione vestibolare o perdita induce vertigini, nistagmo e squilibrio posturale. Dopo danno acuto, la funzione vestibolare recupera spontaneamente entro alcuni giorni, un processo conosciuto come il compenso vestibolare1,2. Il compenso vestibolare dei deficit statico è un processo di recupero legata allo squilibrio dell'attività spontanea che riposa fra i nuclei vestibolari ipsilaterale e controlaterali. Il compenso vestibolare dei deficit dinamico avviene principalmente tramite sostituzioni sensoriali e comportamentali (utilizzando input visivo o somatosensoriali)3. Questi processi sono attraenti per plasticità neuronale studi4,5.
Un numero di metodi è stato sviluppato per studiare il sistema vestibolare e i meccanismi alla base della plasticità neuronale durante il compenso vestibolare, come labyrinthectomy chirurgico e chimico e neurectomia vestibolare5,6 ,7,8. Neurectomia vestibolare è un certo modo di indurre perdita vestibolare completa, ma è una procedura più complessa e invasiva e può indurre danni cerebrali8,9. Questo metodo richiede una maggiore abilità chirurgica e richiede più tempo che labyrinthectomy. Labyrinthectomy chimici, tra cui la gentamicina, arsanilate e tetracaina, è più facile e può produrre risultati affidabili10,11,12. Tuttavia, la coclea può anche essere danneggiata e perdita vestibolare può svilupparsi nel tempo11. Inoltre, gli effetti delle sostanze chimiche sul cervello, che deve essere conservato per una valutazione accurata, sono poco chiari. Labyrinthectomy chirurgico è stato introdotto negli studi sugli animali in 184215 e in primo luogo è stato segnalato nel ratto in 193616. Questa tecnica è stata usata da allora in molti animale studia5,17,18,19. Labyrinthectomy chirurgica è un metodo specifico, affidabile e relativamente semplice. 13 , 14 inoltre, i sintomi di danno vestibolare sono visti immediatamente dopo la chirurgia. Qui, descriviamo la nostra tecnica chirurgica per ratto labyrinthectomy.
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Protocol
Questo studio è stato svolto in conformità delle istituzionali Animal Care e uso Comitato di Seoul National University Hospital (14-0148-C1A1), che è accreditato dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care Internazionale.
Nota: Gli esperimenti sono stati condotti su ratti maschi Sprague-Dawley (deviazione standard) del 7-8 settimane di età (200/250 g). Ogni animale è stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per 1 settimana prima dell'inizio dell'esperimento. Gli animali sono stati alloggiati in una camera a temperatura e umidità controllata con una costante 12-h:12-h chiaro: scuro ciclo con libero accesso a cibo e acqua.
1. Labyrinthectomy
- Coprire gli strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave con un tampone sterile. Disinfettare la zona operativa con etanolo al 70%. Utilizzare un telino sterile e mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico.
- Indossare un abito, maschera (per coprire naso e bocca), PAC (per coprire la testa) e un paio di guanti sterili. Gli strumenti chirurgici devono solo venire a contatto con superfici sterili.
- Iniettare l'anestetico zolazepam tiletamina (40 mg/kg di peso corporeo) per via intramuscolare nella coscia mediale o intraperitonealmente e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) per via intramuscolare o per via intraperitoneale.
Nota: Altre modalità di anestesia generale, incluse inalazione isoflurane, può anche essere utilizzato. - Posto il ratto su un tappetino riscaldante (inizialmente fissato a 42 ° C). Applicare unguento oculare lubrificante in entrambi gli occhi del ratto per prevenire la secchezza dell'occhio mentre sotto anestesia.
- Posto il ratto sul suo lato destro. Radere il pelo nella zona chirurgica con tosatrici. Disinfettare il sito con etanolo al 70%.
- Iniettare 1% lidocaina cloridrato per via sottocutanea nella zona retroauricular sinistra.
- Utilizzando una lama per bisturi #15, fare un'incisione di retroauricular cm ~5.0. Separare il muscolo e la fascia di esporre il canale uditivo esterno con forbici Iris (Figura 1A). Aprire leggermente il canale uditivo esterno utilizzando la lama #15 o le forbici Iris (Figura 1B). Ampiamente esporre la membrana timpanica (Figura 2A).
- Sotto un microscopio (7.5 X o 12,5 X), rimuovere la membrana timpanica e gli ossicini ad eccezione dello stapes, usando il forcipe. Staccare i muscoli sul crinale lambdoidal con la lama #15 o le forbici Iris (Figura 2B).
- Utilizzando un trapano a bassa velocità (< 3000 giri/min) con una fresa diamantata (2.1 o 1,4 mm), forare l'osso timpanico bulla attorno al punto di uscita del nervo facciale (Figura 3A). Identificare l'arteria stapediali. Fare attenzione a non per danneggiare l'arteria stapediali durante il processo di perforazione.
- Continuare ad esplorare il vestibolo superiore all'arteria stapediali ed esporre la finestra rotonda e il canale semicircolare laterale ossuto. Aprire il canale semicircolare laterale vicino alla sua ampolla. Continuare ad esplorare nel piano del canale semicircolare laterale e forare l'ampolla del canale semicircolare superiore.
- Aspirare il contenuto del vestibolo utilizzando un ago 18-G o 22-G. Iniettare e aspirare 1 cm3 di etanolo 100% 3 x.
- Chiudere i muscoli e la pelle in due strati con i suturare interrotti semplici.
- Non lasciare incustodito un animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Mantenere caldo il ratto fino a quando non risveglia con un rilievo di riscaldamento o una lampada di calore. Dopo il risveglio, spostare il ratto in una gabbia individuale in una sala con le solite condizioni ambientali.
- Somministrare antibiotici (ad es., Cefazoline 20 mg/kg, trimetoprim-sulfonamide 100 µ l per via sottocutanea, o penicillina 300.000 IU) come necessario il giorno 1; un analgesico (non un oppioide; ad esempio, Metacam 2mg/kg, Carprofen 5 mg/kg per via sottocutanea) può anche essere somministrato.
2. sham chirurgia
- Per la chirurgia di sham come controllo, eseguire le stesse procedure chirurgiche e post-chirurgiche (secondo la sezione 1), tra cui l'esposizione del canale uditivo esterno e la membrana timpanica (punto 1.7), la rimozione della membrana timpanica e gli ossicini e la distacco dei muscoli sul lambdoidal colmo (passo 1,8), ma non aprire il canale semicircolare o iniettare etanolo.
3. controllare la perdita della funzione vestibolare
Nota: La perdita della funzione vestibolare può essere valutata utilizzando sia le prove di funzione comportamentale o vestibolare. 13 , 17 , 18 prove comportamentali includono la valutazione della asimmetria posturale e nistagmo.
- Identificare asimmetria posturale che comprende spontanei o evocati barile-rolling, che cade sul lato sinistro, o muoversi mentre sporgendosi verso il lato leso18. Guarda il Video 1.
- Identificare il nistagmo da un controllo visivo del movimento di occhio volontaria. Quando il nistagmo spontaneo è assente in stato di riposo, soffio aria delicatamente sopra la testa dell' animale18. Guarda il Video 2.
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Representative Results
Il successo della chirurgia è stato convalidato da test comportamentali. Tutti gli animali hanno esibito il comportamento tipico di una perdita della funzione vestibolare unilaterale. Barile-rotolamento spontaneo era evidente subito dopo della chirurgia, essere evocato da un soffio di aria sopra la testa o un tocco leggero al corpo nella fase iniziale di recupero (Video 1). 3 d dopo la chirurgia, gli animali spostati sporgendosi verso il lato leso con occasionali cade sul lato sinistro. Il nistagmo spontaneo è stato osservato entro 2 d (Video 2). Nistagmo evocato è stato osservato all'interno di 3 d.
L'intervento chirurgico richiesto solitamente < 30 min. Nel corso di 50 interventi chirurgici, 2 ratti morirono durante l'operazione e 3 all'interno di 1 d della chirurgia. Nel complesso, il tasso di perdita era 10% (5 morti durante/dopo 50 interventi chirurgici). Tutti i decessi sono stati causati da una ferita all'arteria stapediali. Abbiamo notato nessuna morte in ritardo e senza infezione entro 1 settimana. Per diversi giorni dopo l'intervento chirurgico, i ratti possono esibire una scarsa perdita di peso e l'assunzione orale.
Figura 1: incisione alberino-auricolare dell'orecchio sinistro. (A) A postauricular incisione è stata fatta, e il nervo facciale (↑) è stato identificato fra il muscolo di temporalis (*) e il muscolo sternomastoideo (†). (B) quindi, il canale uditivo esterno (↑) è stato aperto leggermente e la cartilagine dell'orecchio esterno è stata separata dall'osso piramidale. La barra della scala di 2 mm si applica a tutti i pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: l'esposizione della parete ossuta del vestibolo. (A) dopo l'apertura del canale uditivo esterno ampio, il malleus (*) è stato visto sotto la membrana timpanica. (B) dopo la rimozione della membrana timpanica e gli ossicini (ad eccezione di stapes), è stato identificato il promontorio coclea (*) e i muscoli sul crinale lambdoidal elevati (†). La barra della scala di 2 mm si applica a tutti i pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la finestratura vestibolare. (A) dopo la rimozione della parete laterale posteriore della cavità timpanica, l'osso attorno al punto di uscita del nervo facciale è stata perforata. L'arteria stapediali (↑) e la finestra rotonda (Δ) sopra il promontorio coclea (*) sono stati esposti. (B) dopo la foratura fuori il vestibolo laterale, ampulla di canali semicircolari era evidente nel resto vestibolare (↑), così come la posizione inferiore del promontorio coclea (*). La barra della scala di 2 mm si applica a tutti i pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1. Barile spontanea di rotolamento. Il ratto di SD che ha subito labyrinthectomy d 2 precedentemente mostrato rotolamento spontaneo barile. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 2. Nistagmo spontaneo. Il ratto di SD che ha subito labyrinthectomy d 2 precedentemente mostrato nistagmo spontaneo. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Questa tecnica è un metodo utile per la creazione di perdita di funzione vestibolare improvvisa, permanente e completa. Questo potrebbe essere utilizzato per lo studio di patologie vestibolari, come neurite vestibolare, un tumore acustico e la malattia di Meniere. Molti studi hanno utilizzato questa tecnica per studiare la plasticità neuronale dei nuclei vestibolari o il relativo processo centrale5,17,18,19.
Le fasi critiche per il successo della chirurgia sono 1) la conservazione dell'arteria stapediali, 2) una foratura attenti alla posizione precisa, e 3) meticoloso controllo del sanguinamento. Una grande incisione postauricular può causare un grande esterno della ferita, che disturba il movimento delle gambe sul lato trattato. Tuttavia, una piccola incisione limita il campo chirurgico e fa sì che l'operazione richieda più. Una ritrattazione corretta è essenziale per mantenere un sufficiente vista chirurgico13. Dopo l'incisione postauricular, il nervo facciale può essere identificato sopra la bulla e tra il muscolo digastrico e il muscolo sternocleidomastoideo, in esecuzione anteriore inferiorly al viso. L'arteria retroauricular e maggior nervo auricular correre nella direzione opposta. Eventuali danni al nervo facciale provoca paralisi facciale dopo la procedura. Per raggiungere una più ampia vista chirurgico ed evitare una lesione dell'arteria dello stapes, preferiamo rimuovere la parete superiore del canale uditivo esterno e quindi approccio superiore al stapes arteria17,19. Questo approccio è associato con un rischio maggiore di infezione rispetto all'approccio ventrolateral, che non prevede l'apertura del canale uditivo esterno muro o la rimozione della membrana del timpano (che espone l'orecchio medio verso l'esterno ambiente). Nella nostra esperienza, le sequele a lungo termine (le prestazioni generali di animale, sue abitudini d'alimentazione e bevente, la ripresa dell'aumento di peso e lo stato di infezione) non differiscono in particolare tra gli animali sottoposti all'approccio elettrococleografia descritto qui e l'approccio ventrolateral17,20. Bulla di apertura può danneggiare il muscolo associata e, talvolta, risultato in qualche sanguinamento. Nel ratto, l'arteria dello stapes attraversa vicino al sito della finestratura vestibolare. In esseri umani, tuttavia, l'arteria dello stapes scomparirà durante l'embriogenesi. Quando il campo operatorio è stretto, non è facile controllare il sanguinamento e il campo rapidamente può riempirsi di sangue. Per evitare ciò, alcuni autori coagulano l'arteria dello stapes prima di effettuare il foro. Anche se il suo ruolo non è chiaro, alcuni autori preferiscono non coagula l' arteria dello stapes14 perché può fornire l'orecchio interno, sistema nervoso centrale (il ganglio genicolato, Lemnisco mediale e corpo trapezoidale) e del nervo facciale nel ratto14 ,21. Se il sanguinamento si verifica, abbiamo comprimere l'arteria con un piccolo cotton fioc e quindi utilizzare coagulazione elettrica con sufficiente aspirazione.
Una bava di piccole dimensioni è utile per fare un buco nel vestibolo. Un piccolo gancio o un ago potrebbe essere utilizzato invece di una bava. Un sistema di foratura meccanico si traduce in meno trauma finestratura e aiuta a ottenere risultati coerenti. Senza irrigazione di etanolo, abbiamo osservato le risposte comportamentali variabile dopo il labyrinthectomy13,17. Aspirazione e irrigazione di etanolo è necessario assicurarsi che il labirinto è terminalmente danneggiato. 13 blunt coagulazione elettrica del nervo vestibolare può essere eseguita tramite questo foro22. Ingrandimento adeguato è essenziale, e un microscopio è obbligatorio nella maggior parte dei casi.
L'orecchio medio e interno sono danneggiati durante la labyrinthectomy, con conseguente sordità. Non esiste alcun modo per preservare l'orecchio interno in modo sicuro. Labyrinthectomy chimica può preservare l'udito dell'animale, ma produce risultati variabili8. Neurectomia vestibolare può anche danneggiare il nervo cocleare8. Per eseguire l'operazione di sham nel gruppo di controllo, abbiamo rimosso la membrana timpanica e ossicini senza la staffa, che ha provocato la capacità uditiva conduttiva delicata senza alcun danno vestibolare13.
Diversi test di funzione vestibolare e comportamentale può essere utilizzato per confermare che il labyrinthectomy è stato effettuato con successo il13,14. Immediatamente dopo la procedura, si può osservare una deviazione obliqua dell'occhio. Dopo il recupero dall'anestesia, il nistagmo spontaneo, un moto di rotolamento e inclinazione testa può essere visto. Rotazione di coda appeso è il più affidabile test17,20. Questi deficit recupero lentamente entro parecchi giorni17,20. Nistagmo spontaneo con movimento rapido al lato controlaterale spariranno entro 3-4 d dopo la procedura. L'inclinazione testa rimarrà per diversi mesi. Test di funzione vestibolare, come test di rotazione di una sedia o un test di rotarod, può fornire più obiettivo e dati quantitativi23,24.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Corea Health Technology R & D Project attraverso Corea salute industria Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI15C2651).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
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