Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הקרנת כותנה גנוטיפים לעמידות בפני ההתנגדות של רנפורם

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/58577
Automatic Translation
1, 1
1Crop Genetics Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

כאן, פרוטוקול מוצג עבור הקרנה מהירה הלא הרסנית של גנוטיפים כותנה עבור התנגדות נמטודות. הפרוטוקול כולל בדיקה חזותית את השורשים של שתילי כותנה נגועים nematode כדי לקבוע תגובה זיהום. לירות וגטטיבי מכל צמח מופץ אז לשחזר צמחים לייצור זרעים.

Abstract

מהירה שאינה הרסנית נמטודות (Rotylenchulus reniformis) הפרוטוקול הקרנה נדרשת לפיתוח של כותנה עמידים (Gossypium שעירות) זנים כדי לשפר את ניהול נמטודות. רוב הפרוטוקולים כרוכים מחלץ תוספתן נמטודות או ביצים ממערכת השורש כותנה או אדמה השתילה כדי לקבוע צפיפות האוכלוסייה או שיעור רבייה. גישות אלה בדרך כלל צורכת זמן רב עם מספר קטן של גנוטיפים מוערכים. גישה חלופית מתוארת כאן, שבה מערכת השורש נבדקת ויזואלית עבור זיהום נמטודות. הפרוטוקול כרוך לאחר שתיל כותנה 7 ימים לאחר שתילת עם נמטודות ולקבוע את מספר הנקבות המצורפת למערכת השורש 28 ימים לאחר החיסון. הנתונים מבוטאים כמספר הנקבות לגרם של משקל שורש טרי להסתגל לווריאציה בצמיחת השורש. הפרוטוקול מספק שיטה מצוינת להערכת התנגדות צמח מארח הקשורים ליכולת של נמטודות להקים אתר זיהום; עם זאת, התנגדות המעכבת את הרבייה נמטודות לא מוערך. כמו בפרוטוקולים אחרים ההקרנה, וריאציה היא נצפתה בדרך כלל בזיהום נמטודות בין גנוטיפים בודדים בתוך ובין ניסויים. נתונים מוצגים כדי להמחיש את טווח הווריאציה שנצפתה באמצעות הפרוטוקול. כדי לכוונן את הווריאציה הזאת, גנוטיפים של השליטה נכללים בניסויים. עם זאת, הפרוטוקול מספק שיטה פשוטה ומהירה להערכת התנגדות צמח מארח. הפרוטוקול נעשה שימוש בהצלחה כדי לזהות הצטרפות עמידים מ- G. האוסף של העצים של germפלסטיות ולהעריך אוכלוסיות פנקסי של יותר מ 300 אנשים כדי לקבוע את הגנטיקה של התנגדות. שיטת התפשטות וגטטיבי עבור שחזור צמחים להתרבות ההתנגדות פותחה גם. לאחר הסרת מערכת השורש עבור הערכת נמטודות, וגטטיבי לירות מחדש כדי לאפשר פיתוח של מערכת שורש חדש. יותר מ 95% של נצרי בדרך כלל לפתח מערכת שורש חדשה עם צמחים המגיעים לבגרות.

Introduction

Rotylenchulus רנזה (Linford ו אוליביירה), המכונה גם reniform נמטודות, הוא אחד של מינים נמטודות הגדול פרזיטים נוכח קרקעות של דרום מזרח ארצות הברית1,2,3. נמטודות הוא מחייב, למחצה, בלתי מוחלט לעין האתר המחייב צמח מארח להשלים את מחזור החיים שלה2,4. וורמיטופס טרום למבוגרים נקבה לחדור למערכת השורש המארח כדי להקים אתר האכלה באבן המצבות2,3. החלק האחורי שנשאר מחוץ לשורש המארח יתנפח על ייצור ביצים, ויוצר צורת כליה אופיינית (איור 1). Rotylenchulus reniformis מסוגל להאכיל על מערכת השורש של יותר מ-300 מינים צמח, כולל כותנה4. כותנה (Gossypium ) מעובדת באופן נרחב בדרום-מזרח ארצות הברית, אבל היעדר R. הטיפול בזנים עמידים מונע הנהלה של שתיים,3. אסטרטגיות ניהול כגון טיפול ורוטציה של מינים שאינם מארחים שימשו להפחתת הקרקע R. מדובר בצפיפות אוכלוסין של5,6, אך הפסדים בעלי תשואה כותנה של זרעים יכולים לנוע בין 1 ל -5%2. הסימפטומים של R. reniformis זיהום יכול לכלול המאסטטינג צמח, צמיחה שורש מודחק, ליקויים תזונתיים, הפלה פרי, ו עיכוב בגרות2. עם זאת, הסימפטומים לא ניתן לבירור בשל אחידות של הסימפטומים ברחבי השדה; לכן, גישות להערכת R. יש צורך בזיהום reniformis כדי לזהות ולפתח זנים הכותנה עמידים. הערכה של R. reniformis התנגדות כותנה נחשב קשה7, כי מערכת השורש נגוע עשוי להיראות נורמלי למרות הצמח עשוי להראות סימפטומים של זיהום8.

פרוטוקול סינון נמטודות אפקטיבי נדרש לזיהוי של R. reniformis החסינות עמידים מתוך אוסף כותנה germפלסטיות, ולקביעת הגנטיקה ההתנגדות עבור האביזרים האלה. פרוטוקול כזה יסייע בהעברת גנים ההתנגדות כדי לקשור כותנה. שיטות ביוגרפיות שונות שימשו להערכת R. , הזיהום בכותנה8,9,10,11,12,13,14,15 באופן כללי, נעשה שימוש בשתי גישות עיקריות לזיהוי של R. . בסדר. הגישה הנפוצה ביותר כרוכה בחילוץ ביצים ו/או תוספתן נמטודות מצמחים נגועים או אדמה8,11,12,14,15. המתודולוגיה הכללית עבור גישה זו כוללת נטיעת זרעים עבור גנוטיפים כותנה בודדים בסירים נפרדים, המאפשר לשתילים לפתח במשך 7 עד 14 ימים, התרת שתילים על ידי הוספת תערובת של שלבים תוספתן של R. reniformis על הקרקע, ומאפשר נמטודות להדביק את מערכת השורש עבור 30 עד 60 ימים. הבא, תוספתן נמטודות ו/או ביצים מופקים ממערכת השורש הנגוע של כל צמח או מאדמת השתילה. לאחר מכן נקבע כי מספר הביאודות או הביצים שחולצו ייקבע להעריך את צפיפות האוכלוסייה ואת קצב הרבייה, אשר מושווים לבקרת גנוטיפים כדי לזהות גנוטיפים עמידים.

גישה חלופית, כפי שמתואר כאן, כרוכה בבדיקת מאכל ערכת שורש הכותנה שנדבקה בנמטודות כדי לקבוע את מספר הנמטודות הנקביים הפרזיטיפיים10,16. בדומה גישות אחרות, גנוטיפים כותנה נטועים סירים נפרדים ומחוסן עם תוספתן נמטודות כ 7 ימים לאחר נטיעת. בתוך 30 ימים לאחר החיסון, המערכת מוסרת מצמחים בודדים והקרקע שטפה מן השורשים. לאחר מכן, נמטודות המצורפת למערכת השורש מוכתם עם מזון אדום צביעה17, ושורשים הם בדקו מאכל לקבוע את מספר אתרי זיהום עם גנוטיפים עמידים כותנה (מזוהה בהתבסס על מספר נמטודות לגרם של השורש) בהשוואה לפקד רגיש16. הגישה השנייה הזו יש את היתרון של תפוקה מוגברת על ידי הפחתת מספר הימים הדרושים להערכה והגדלת מספר גנוטיפים בודדים הוערכו בניסוי אחד. הקרנת מתודולוגיות הערכת צפיפות אוכלוסייה או שיעור רבייה הם לעתים קרובות יותר זמן רב יותר מאשר אלה המבוססים על תצפיות חזותיות של סימנים זיהום7. עם זאת, מגבלה אחת של גישה זו היא התנגדות צמח מארח המעכבת את רבייה נמטודות כפי שנקבע על ידי ייצור ביצים אינו מוערך13.

פרוטוקולי סינון עבור R. reniformis התנגדות לעתים קרובות להרוס את מערכת השורש במהלך ההערכה7 וכרוכים לירות וגטטיבי להיות מושלך. כדי להתגבר על מגבלה זו, שיטה של התפשטות וגטטיבי פותחה כדי לאפשר התאוששות של צמחים לייצור זרעים18. לאחר הסרת מערכת השורש עבור הערכת נמטודות, לירות וגטטיבי נטועים בקרקע השתילה כדי לאפשר את מערכת השורש כדי לצמוח מחדש. שיטה זו כוללת יישומים רחבים עבור רוב R. . בסדר. שיטה פשוטה ומהירה של התפשטות וגטטיבי היא בעלת חשיבות קריטית לרבייה R. reniformis וזנים עמידים כותנה, שם ההתאוששות של צאצאי נדרש כדי לקדם גנוטיפים עמידים לדור הבא.

פרוטוקול מוצג עבור הקרנת בקנה מידה גדול של גנוטיפים כותנה עבור התנגדות נמטודות. המטרה היא לפתח שיטת הקרנה פשוטה ומהירה שאינה הרסנית כדי להעריך אוכלוסיות הרבייה כותנה עבור עמידות נמטודות על מנת לסייע ברבייה של מינים עמידים הכותנה. באמצעות פרוטוקול זה, נתונים מתקבלים בדרך כלל בתוך 35 ימים, עם יותר מ 300 גנוטיפים מוערכים בניסוי יחיד. נתונים מוצגים עבור גנוטיפים עמידים ורגישים כדי להמחיש את הווריאציה בדרך כלל הנצפים באמצעות שיטות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שמירה על מקור R. רנפורזה רשת

  1. מילוי סירי חימר טרה כקוטה (15 ס"מ בקוטר, 13.5 ס מ בגובה) עם תערובת מפוסטר קיטור של 1-חלק חולית רקבובית ו 2 חלקים חול. הצמח עגבנייה חשופה (Solanum lycopersicon) מגוון בכל סיר ומניחים את הסירים בתוך החממה.
    הערה: סוגים אחרים של צמחים רגישים כגון כותנה ניתן להשתמש במקום עגבניה.
  2. איחסן את צמחי העגבניות בעזרת תוספתן נמטודות (ראה שלב 3.3). שמרו על הצמחים בחממה בטמפרטורה של כ -28 ° c.

2. נטיעת גנוטיפים כותנה עבור R. רנפורזה הערכת התנגדות

  1. הכינו קרקע על-ידי שילוב של 2 חלקים חול משובח עם 1-חלק חולית רקבובית שנאסף מהשדה.
  2. קיטור מפוסטר את תערובת הקרקע כדי להבטיח כי הקרקע היא חופשית של נמטודות ו הקרקע הנישאים פתוגנים צמחים.
  3. מוסיפים את תערובת האדמה לסירים מפלסטיק חרוטי (4 ס מ קוטר, 21 ס"מ גובה). לפני מילוי הסירים, מניחים כדור כותנה בתחתית הסיר כדי למנוע אובדן אדמה. ממלאים באופן חלקי את הסירים באדמה כ 2 ס מ מלמעלה.
  4. הכינו יתד פלסטיק עבור כל סיר כדי לייעד את גנוטיפ להיות נטוע.
  5. זרעי צמחי הכותנה שנבחרו להערכה.
    1. הצמח זרע אחד בכל סיר להערכת אוכלוסיות פנקסי, שבו כל זרע מייצג גנוטיפ ייחודי.
    2. עבור זנים של כותנה או האביזרים germplasm, צמח 2 כדי 3 זרעים בסיר אחד כדי להבטיח נביטה של צמח לפחות אחד עם שתילים אחרים הוסרו מן הסירים לפני נמטודות החיסון.
      הערה: לחילופין, זרעים יכולים להיות מונבטים עבור 24 כדי 72 h לפני שתילת כדי למזער את מספר הסירים עם זרעים לא קיימא.
  6. זרעי הצמח של גנוסוגים שנבחרו עמידים ורגישים.
    הערה: גנוטיפים של שליטה משוכפלים 5 כדי 10 פעמים כדי להעריך וריאציות טבעיות הטבועה למתודולוגיה ההקרנה.
  7. מילוי סירים עם אדמה נוספת כדי לכסות את הזרע בכל סיר.
  8. הניחו את הסירים בחדר הגידול. שמרו על טמפרטורה קבועה של 28 ° c, טמפרטורת אוויר סביבתית, לחדר הגידול. לספק תאורה מלאכותית עם תערובת של פלורסנט מנורות ליבון עם 16 h photoperiod.
  9. הניחו את המים בכל סיר, והמים את הסירים פעמיים ביום באמצעות מערכת השקיה אוטומטית. להתאים את מערכת השקיה כדי לספק מים נוספים כמו הצמח גדל.

3. מפעלי כותנה והכנת דגימות שורש

  1. תמצית תוספתן reniform נמטודות מתוחזק על צמחי עגבניות רגישים (ראה שלב 1) באמצעות משחררות19 ו ציפה צנטריפוגליים20 מתודולוגיות יום לפני החיסון. אחסן את הנמטודות המחולצים ב-4 ° c.
    הערה: הוצאת משפך ברמן21 היא שיטה חלופית להפקת נמטודות.
  2. לקבוע את מספר נמטודות שחולצו על ידי ספירת מספר של נמטודות במדגם 100 μl משנה ולהכין השעיה של 1,000 נמטודות/mL במים ברז עבור החיסונים.
  3. לחישוב שתילי כותנה 7 d לאחר שתילת עם ההשעיה נמטודות. ליצור דיכאון קטן באדמה ליד הצמח, ו פיפטה 1 מ ל של הבולם נמטודות של reniform לתוך הדיכאון.
  4. הסרת צמחים מסירים 28 d לאחר חיסון להערכת נמטודות.
    הערה: בשלב זה, צמחים הם כ 15 ס"מ גבוה עם 4 עד 6 עלים מורחב לחלוטין.
    1. הסר את רוב העלים מורחבת במלואו מן הצמחים באמצעות מספריים לפני הסרת הצמחים מן הסירים.
    2. כדי להסיר את הצמחים מן הסירים, לסחוט את הסיר ולהחליק את האדמה לתוך היד.
    3. בעדינות להסיר את הקרקע מן השורשים על ידי שורש מערכת השורש במי ברז במיכל 10 L. שטפו בקצרה את מערכת השורש במיכל של מי ברז נקיים.
    4. הסר את מערכת השורש מהמפעל כ 1 ס מ מתחת לקו הקרקע באמצעות מספריים.
  5. מניחים את מערכת השורש לתוך פלסטיק 120 mL, לא סטרילי, מכולה דגימה חד פעמית יחד עם יתד פלסטיק מן הסיר המשמש לזיהוי.
    הערה: דגימות מרובות מעובדות לפני שממשיכים לשלב 3.7. המשך לשלב 4 עבור התפשטות וגטטיבי של המפעל לירות.
  6. להכין 12.5% (v/v) פתרון של מזון אדום צבע17 ב ברז מים כדי כתם נמטודות המצורפת למערכת השורש.
  7. הוסף כ 30 מ ל של הפתרון האדום מזון צביעה למדגם השורש במיכל הדגימה כדי לכסות לחלוטין את מערכת השורש.
  8. מניחים את המיכל דגימה במיקרוגל ומחממים את דגימת השורש עד שהפתרון הכתים מתחיל לרתוח. הסירו את הדגימה מהתנור והניחו למדגם להתקרר בטמפרטורת החדר.
  9. Decant מזון אדום הפתרון צביעה ממדגם השורש ולהוסיף כ 100 mL של מי ברז למיכל הדגימה כדי להסיר את הכתם העודף. הניחו את המכסה על המיכל ואחסנו את המדגם במקרר ב-4 ° c. המשך לשלב 5 להערכת זיהום השורש.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן לפני שתמשיך לשלב 5.

4. הפצת וגטטיבי לשחזור צמחים לייצור זרעים

  1. מניחים כדור של כותנה בחלק התחתון של סיר פלסטיק חרוט (ראה שלב 2.3) ולמלא באופן חלקי את הסיר עם מדיה השתילה כבול איזוב. אז, המקום לירות וגטטיבי בסיר בחוזקה להוסיף מדיה השתילה כדי למלא את הסיר. מניחים יתד פלסטיק חדש בתווית בכל סיר כדי לייעד את גנוטיפ כותנה.
  2. מקום מגש של סירים במיכל פלסטיק (73.6 ס"מ אורך x 45.7 ס"מ רוחב x 15.2 ס"מ גובה) עם מים ולזמן קצר את הצמחים כדי להרטיב את המדיה השתילה. מניחים את הסירים בחדר הגידול עם טמפרטורה קבועה של 28 ° c באמצעות מדחס 16 h photoperiod. הוסיפו מים נוספים למיכל הפלסטיק בהתאם לצורך לשמירה על לחות הקרקע.
  3. להשתיל את הצמחים לסירים גדולים יותר לייצור זרעים לאחר כ 30 ד. מילוי חלקי 6 L סיר פלסטיק עם השתילה מדיה (ראה שלב 4.1), להסיר את הצמח מן הסיר הקטן, מקום הצמח לתוך 6 L סיר, ובחוזקה להוסיף מדיה השתילה כדי למלא את הסיר.
  4. מניחים את הצמחים בתוך החממה ולהוסיף מים כדי להרטיב את התקשורת השתילה. שמרו על טמפרטורת החממה בטמפרטורה של כ -28 ° צ' (אין צורך בתאורה מלאכותית).
    1. צמחי מים בעבודת יד לפי הצורך בערך 30 ד.
    2. כאשר כ 75% של הצמחים דורשים השקיה יומית, צמחי מים מדי יום באמצעות מערכת השקיה אוטומטית. להתאים את מערכת השקיה אוטומטית למים לעתים קרובות יותר לפי הצורך בצמיחה צמח.
    3. להוסיף כ 10 גרם של דשן איטי שחרור לכל סיר לפני תחילת החניכה פרחוני.
  5. הקציר צמחים בבגרות ולעבד את הדגימות כותנה זרע כדי להשיג זרעים להערכה נוספת.
    1. כדי לקצור זרעי כותנה, להסיר את הכותנה מן bolls פתוח על הצמח ביד ולמקם אותו בשקית נייר מתויג. הזרעים מחוברים לסיבי הכותנה שהוסרו בצעדים הבאים.
    2. הסירו סיבי מוך מדגימות הזרע. בעזרת ג'ין מעבדה של 10 מראות
    3. הסירו סיבי פלומה מדגימות הזרעים בעזרת חומצה גופרתית מרוכזת. לנטרל דגימות זרעים ב 15% (v/v) פתרון של נתרן פחמתי, לשטוף את הדגימות עם מי ברז, ולייבש דגימות במייבש האוויר כפויה.
    4. מקם את דגימות הזרעים במעטפות המסומנות בתווית עבור אחסון.

5. הערכת R. רנפורזה דלקת בשורש

  1. הסר את דגימת השורש ממיכל הדגימה וספור את מספר הנמטודות הנקביים המצורפים למערכת השורש באמצעות הגדלה stereomicroscope (20X).
    הערה: רק נמטודות הנשי מסוגלים להדביק שורש הצמח.
  2. מניחים את מערכת השורש על מגבות נייר כ 10 דקות כדי להסיר לחות עודפת. שוקלים את מערכת השורש כדי לקבוע את משקל השורש הצח.
  3. הזן את ספירת נמטודות ונתונים משקל טרי שורש לתוך תוכנית גיליון אלקטרוני מחשב ולחשב את מספר הנקבות לכל גרם של השורש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rotylenchulus reniformis זיהום של מערכת השורש עבור שני זנים מוצג באיור 1. באופן יחסי פחות נשי reniform מסוגלים להקים אתר האכלה של גנוטיפ כותנה עמידים לעומת גנוטיפ רגישים. הגיוון בצמיחת השורש נפוץ בין היתר, כפי שמודגם באיור 2. וריאציה זו כפי שנמדד על ידי משקל שורש טרי יכול להיות גם נצפתה בין הצמחים של אותו גנוטיפ (שולחן 1). Gossypium העצים מראים לעתים קרובות שיעורי צמיחה נמוכה יותר השורש מאשר של גנוטיפים כותנה. כדי לפצות על וריאציה זו, הנתונים נאספים על משקולות בסיס טרי, אשר משמשים כדי לחשב את מספר הנשי reniform נמטודות עבור רקמת השורש של גרם לכל גנוטיפ. המספרים של הנקבה reniform נמטודות לגרם של השורש עבור גנוטיפים עמידים הם בדרך כלל פחות מ 10, בעוד גנוטיפים רגישים בדרך כלל יש יותר מ 30 נמטודות לכל גרם של השורש.

אתגר אחד עבור הקרנת גנוטיפים כותנה עבור R. התנגדות reniformis היא וריאציה פוטנציאלית שיכולה להתרחש בתוך ובין ניסויים. כדי להעריך ולהתאים עבור וריאציה זו, גנוטיפים כותנה עמידים ורגישים נכללים כפקדים ומשוכפלים בכל ניסוי. טבלה 1 מציגה נתונים עבור שני הגנוטיפים המשמשים כפקדים בשני ניסויים נפרדים באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. The גנוטיפים שוכפל 10 פעמים מחוסן 7 ימים לאחר שתילת עם 1,000 תוספתן נמטודות, ואז מערכות השורש נקצרו 28 ימים לאחר החיסון לספור נמטודות מחובר השורשים. מכיוון שהניסויים נערכו בזמנים שונים, מקור הנמטודות ששימש לחיסונים היה שונה; אחרת, כל הפרמטרים האחרים היו דומים. נתונים אלה מדגימים את הווריאציה שניתן לצפות בה בהערכות נמטודות. ספירות הנשים ומשקולות השורש היו גבוהות יותר בניסוי 1 עבור שני הפקדים בהשוואה לניסוי 2, וכתוצאה מכך מספרים גבוהים יותר של נקבות לכל גרם בסיס לניסוי 1. בגלל שספירות הנשים היו גבוהות במידה ניכרת לניסוי 1, העליות במשקולות השורש לא הורידו את מספר הנקבות לגרם של שורש לרמות שנצפו לניסוי 2. וריאציה ניכרת בין שכפולים של גנוטיפים בודדים נצפתה גם. עם זאת, Gעמיד. גנוטיפ מסוג ip 615699 PI הראה לעתים קרובות משמעותית הנקבה נמוך ספירות ומספר נמוך של נקבות לכל גרם של השורש מאשר Gרגיש. שעירות -גנוטיפ PI 529251. ה-גנוטיפים יכולים להיות מסווגים בקלות כעמידים או רגישים כאשר אמצעים אלה משמשים להשוואה. הגנוטיפים מסווגים כעמידים כאשר מספרם של הנקבות לגרם השורש הוא כ -10% מכלל השליטה החשופה.

קבוצת משנה של נתונים מאוכלוסיה פנקסי F2 שחושבה באמצעות הפרוטוקול מוצגת בטבלה 2. האוכלוסייה כללה 300 F2 צמחים, ונתונים עבור 50 צמחים המייצגים את הטווח בווריאציה מוצגים. עבור האוכלוסייה של 300 צמחים, מספר נמטודות נצפתה מדביק את מערכות השורש נע בין 0 אל 50, עם ממוצע של 9.4. משקולות השורש נע בין 0.01-1.22 g, עם ממוצע של 0.38 g. נקבה מנודות לכל גרם של השורש נע בין 0-400, עם ממוצע של 33.6. . ההורים הוכפלו בהערכה ההורה עמיד (PI 417895) הראה ממוצע של 5.8 הנקבות לגרם של השורש, עם משקל השורש הממוצע של 0.8 g; לעומת זאת, ההורה הרגיש (PI 529729) הראה ממוצע של 40.8 נקבות לכל גרם של השורש, עם משקל ממוצע של הממוצע של 0.35 g. 20 צמחים לא הראה זיהום נמטודות והוגדרו כעמידים, אבל זה עשוי לייצג בריחה. שני צמחים וצמחים אלה עם צמיחה שורש עני מוסרים בדרך כלל מניתוח נתונים. טווח זה בווריאציה עבור צמיחת השורש וזיהום נמטודות של מערכות השורש הם נצפו בדרך כלל עבור הערכות נמטודות; כך, את היכולת להקרין מספר גדול של צמחים בניסוי אחד יכול למזער את הווריאציה ולאפשר להעריך במדויק את הגנטיקה של התנגדות. האוכלוסייה הראתה וריאציה כמותית לזיהום נמטודות, וצמחים סווגו כעמידים בהתבסס על הנתונים של ההורה רגיש, אשר הציע כי ההתנגדות העניקו שני גנים רצטיים עבור אוכלוסיה זו. בנוסף, פרוטוקול הפצת וגטטיבי המתואר לעיל היה בשימוש בהצלחה כדי לשחזר את הצמחים מאוכלוסיה זו. הדירוג של הצאצאים של F3 הנגזרים מצמחים בודדים f2 התכתב לעתים קרובות לדירוג של מפעל f2 .

Figure 1
איור 1: Rotylenchulus reniformis מזוהם דגימות שורש. דגימת השורש מתוך גנוטיפ כותנה עמיד (השמאלית התחתונה) מראה נמטודות נקבה אחת מחוברת לשורש, בעוד גנוטיפ רגישים (הימנית העליונה) מראה נקבות מרובות המצורפת השורש. הסרגל השחור מייצג סולם 0.1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : וריאציה שנצפו בצמיחת השורש עבור שני גנוטיפים כותנה. מערכות השורש עבור שתי מנות מסוג המערכת העמידה בפני העצים מוצגים כדי להמחיש את הווריאציה שניתן לצפות בה לצמיחת השורש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Table 1
טבלה 1: וריאציה שנצפתה בתגובה הזיהום reniform נמטודות עבור שני גנוטיפים כותנה כלולים פקדים. נתונים אלה מדגימים את הווריאציה שיכולה להתרחש בתוך ובין ניסויים עבור הרגישים g. הירשטום ה529251 PI ועמיד g. גנוטיפ של כרום העצים PI 615699; עם זאת, אמצעי הנתונים היו שונים באופן משמעותי, מה שמאפשר לגנוטיפים להיות מסווגים בקלות כעמידים או רגישים.

ייעוד גנוטיפ נקבות משקל שורש (גר') נשים/g בסיס סיווג
88 0 0.67 0.0 עמידים
156 0 0.10 0.0 עמידים
75 2 1.05 1.9 עמידים
298 2 0.58 3.4 עמידים
259 3 0.77 3.9 עמידים
208 1 0.21 4.8 עמידים
322 4 0.82 4.9 עמידים
189 2 0.35 5.7 עמידים
147 6 0.94 6.4 עמידים
267 2 0.18 11.1 עמיד במתינות
198 מיכל 5 0.43 11.6 עמיד במתינות
251 2 0.17 11.8 עמיד במתינות
95 6 0.46 13.0 עמיד במתינות
248 3 0.23 13.0 עמיד במתינות
79 11 0.84 13.1 עמיד במתינות
340 4 0.29 13.8 עמיד במתינות
114 9 0.64 14.1 עמיד במתינות
168 6 0.40 15.0 עמיד במתינות
117 7 0.44 15.9 עמיד במתינות
77 10 0.57 17.5 עמיד במתינות
277 9 0.44 20.5 עמיד במתינות
47 8 0.34 23.5 רגיש במתינות
96 20 0.85 23.5 רגיש במתינות
139 15 0.60 25.0 רגיש במתינות
253 2 0.08 25.0 רגיש במתינות
247 15 0.53 28.3 רגיש במתינות
308 8 0.28 28.6 רגיש במתינות
152 9 0.31 29.0 רגיש במתינות
123 8 0.26 30.8 רגיש במתינות
296 18 0.58 31.0 רגיש במתינות
138 10 0.31 32.3 רגיש במתינות
151 מיכל 5 0.15 33.3 רגיש במתינות
102 31 0.77 40.3 רגיש במתינות
67 מיכל 5 0.12 41.7 רגישים
51 18 0.43 41.9 רגישים
311 21 0.48 43.8 רגישים
334 4 0.09 44.4 רגישים
266 33 0.74 44.6 רגישים
260 7 0.14 50.0 רגישים
49 16 0.32 50.0 רגישים
149 20 0.39 51.3 רגישים
104 22 0.34 64.7 רגישים
238 39 0.57 68.4 רגישים
144 24 0.33 72.7 רגישים
225 24 0.30 80.0 רגישים
87 38 0.43 88.4 רגישים
126 50 0.51 98.0 רגישים
272 3 0.03 100.0 רגישים
154 24 0.12 200.0 רגישים
286 3 0.01 300.0 רגישים

שולחן 2: התגובה זיהום נמטודות הבחין בקבוצת משנה של 50 גנוטיפים מ האוכלוסייה היחידה 2 . נתונים אלה מדגימים את טווח הווריאציה שניתן לצפות בהם עבור אוכלוסיות פנקסי. משקולות השורש, ספירות נמטודות, ומספר הנקבות לכל גרם של השורש מוצגים עבור כל גנוטיפ, עם צמחים מסווגים עמידים, עמידים במתינות, רגישים למדי, או רגישים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול סינון אפקטיבי נדרש עבור 1) זיהוי של R. reniformis כותנה עמידים הכותנה כדי להעריך את הגנטיקה של התנגדות 2) הרבייה של זנים עמידים. רוב הפרוטוקולים להעריך R. reniformis צפיפות אוכלוסין או שיעורי רבייה על ידי חילוץ תוספתן נמטודות או ביצים מן המערכת שורש כותנה או אדמת השתילה8,11,12,14,15 . גישות אלה לעתים קרובות יותר גוזלת זמן, ואת התוצאות נוטים להיות מגוונת יותר בתוך ובין ניסויים. בנוסף, גנוטיפים כותנה עשויים להיות בתדירות גבוהה יותר מסווג בניסויים שאינם משוכפלים החממה באמצעות פרוטוקולים אלה11. עם זאת, תוצאות דומות ניתן להשיג עבור הפרוטוקולים השונים או פרמטרים שוערכו9,13.

פרוטוקול הקרנה חלופי מוצג שבו הקרנת של גנוטיפים כותנה מתנהל על ידי הערכת מספר של הנשי reniform נמטודות פרזיטיטיזציה מערכת השורש. גנוטיפים עמידים בפני כותנה עשויים להראות בתחילה מספר דומה של נמטודות נקבה חודר מערכות השורש בתוך 16 שעות לאחר החיסון, אבל בתוך 36 שעות, גנוטיפים עמידים להתחיל להראות משמעותית פחות מצורף נקבה התפתחות ופיתוח נמטודות מעכבת9. לפיכך, זה פרוטוקול ההקרנה מספק מידה ישירה יותר של זיהום נמטודות של מערכת השורש כותנה לעומת פרוטוקולים המסתמכים על החילוץ של נמטודות או ביצים ממערכת השורש או קרקע השתילה. השיטה של שתיל כותנה החיסון מסוג נמטודות הוא דומה בין הגישות. החיסונים מתנהלים בדרך כלל 7 עד 14 ימים לאחר נטיעת, אבל העיתוי של החיסונים הוא פחות קריטי, כמו זרעים ניתן גם לשתול ישירות לתוך הקרקע שורץ nematode. החיסונים מתנהלים באמצעות 1,000 תוספתן נמטודות אבל הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להגדיל או להקטין את המספר המשמש לחיסון, או שני חיסונים ניתן לנהל ב 7 ו 14 ימים לאחר נטיעת כדי להבטיח נמטודות נשית מספיק הם תנה להידבקות בשורש. ב סויה, מספר הנטודות המשמשים לחיסונים לא היתה השפעה משמעותית על דירוגי ביצה 21 ימים לאחר נטיעת; למרות, דירוגים גבוהים נצפו בדרך כלל בצפיפות האוכלוסייה נמטודות גבוה22. ניתן למטב את הפרוטוקול כדי לקבוע את צפיפות ה-נמטודות המינימלית לחיסון.

זיהום nematode של מערכת השורש מוערך 28 ימים לאחר החיסון עבור פרוטוקול זה, אשר בדרך כלל מוקדם יותר מאשר בפרוטוקולים אחרים. זהו צעד קריטי בפרוטוקול, כאשר הערכות מתבצעות לפני הפתח ביצה. עיכוב משמעותי בדגימות השורש יכול לגרום לסיבוב שני של זיהום. עם זאת, הערכה קודמת זו מהווה את היתרון של תפוקה גוברת. עבור הפרוטוקול המוצג, גנוטיפים כותנה נטועים תערובת של חול ואדמה, אשר הוא קריטי להסרה פשוטה ומהירה של מערכת השורש מן הסיר. השימוש במערכת השקיה אוטומטית הוא חיוני בעת שימוש בסירים קטנים עם חול ותערובת הקרקע כדי למנוע את הסירים מייבוש. צביעה מאכל אדום משמש כדי להכתים את נמטודות המצורפת למערכת השורש, שהיא שיטה פשוטה ובטוחה17. כאשר מערכות השורש מוכתמות, ניתן לאחסנו במי ברז ב-4 ° c לפני ספירת מספר הנמטודות המצורפים למערכת השורש; כך, מספר גדול יותר של גנוטיפים כותנה ניתן להעריך בניסוי אחד, כי אין עיבוד נוסף של דגימות נדרש לפני הערכה של ספירות נמטודות. כמו כן, זה יתרון לאחסן את דגימות השורש מים ברז במשך מספר ימים, אשר מאפשר שורשים דה כתם, מה שהופך את הספירה קל.

הפרוטוקול המתואר מאפשר הקרנת אוכלוסיות גדולות יותר כדי להפחית את הווריאציה הסביבתית שתתרחש בין ניסויים. באמצעות 900 m2 הצמח בחדר הצמיחה מצויד במערכת השקיה אוטומטית, אוכלוסיות של 480 צמחים בודדים ניתן להעריך. הפרוטוקול נעשה שימוש בהצלחה כדי להעריך אוכלוסיות פנקסי של 300 או יותר אנשים כדי לאפיין את הגנטיקה של התנגדות10,18. אוכלוסיות אלה הראו כי וריאציה כמותית של זיהום נמטודות והתנגדות G. עצים עשויים להיות משויכים לעתים קרובות יותר עם גנים רצחים מרובים; לפיכך, אוכלוסיות גדולות יותר נדרשות למחקרים גנטיים. בנוסף, וריאציה כמותית היא נצפתה אוכלוסיות פנקסי, ללא קשר לפרוטוקול המועסקים, כדי להעריך את תגובת זיהום נמטודות.

מארח-צמח התנגדות כותנה יכול לעכב את היכולת של נמטודות להדביק את מערכת השורש ולהקים אתר האכלה, אבל זה יכול גם להשפיע על יכולת הרבייה של נמטודות. פרוטוקול ההקרנה תיאר מעריך את מספר נמטודות כי הם מסוגלים להקים אתר האכלה על מערכת שורש כותנה. רבייה nematode כפי שנמדד על ידי ייצור ביצים לא הוערך בפרוטוקול זה, שהוא מגבלה חשובה. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לאסוף סוג זה של נתונים. לחילופין, מתודולוגיה אחרת ניתן להשתמש כדי לאסוף נתונים אלה לאחר גנוטיפים עמידים זוהו, אשר מפחית את הצורך למסך מספר רב של אנשים.

נתונים מהערכות נמטודות של גנוטיפים בודדים יכולים להיות משתנה בתוך ובין ניסויים, שהיא בעיה נפוצה עם כל פרוטוקולי ההקרנה המשמשים להערכת R. התנגדות . השימוש בעיצוב ניסיוני עם כפילויות מרובות עבור הקרנת המכשיר של גראמפלמטר יסייע בהערכת וריאציה זו לזיהוי גנוטיפים עמידים. בנוסף, כולל גנוטיפים בקרה עמידים ורגישים בין ניסויים מועיל בהערכת וריאציה זו והשוואת תוצאות של ניסויים מרובים. בקרים אלה משמשים גם כדי לפקח על ההצלחה של נמטודות החיסון. בנוסף, משמעות הנתונים מפקדים אלה משמשת לסיווג הגנוטיפים כעמידים בפני10,16. גנוטיפים כותנה מסווגים בדרך כלל עמידים אם הם מראים פחות מ 10% הזיהום נצפתה על בקרת רגישים16,23. צמיחת השורש היא גורם נוסף התורם לווריאציה שנצפתה בנתונים באמצעות הפרוטוקול, מכיוון שלצמחים שיש שורש ברז עם פחות שורשים לרוחב מציעים פחות אתרים להידבקות, דבר שעלול לגרום לפחות נמטודות לכל גרם של שורש.

הקושי בפיתוח זנים מכותנה חדשה באמצעות מיני כותנה אחרים כמקור של גנים ההתנגדות דורש פרוטוקול התפשטות וגטטיבי כדי לקדם את קווי הרבייה לדור הבא לבחירה נוספת או נוספת רבייה. פרוטוקול פשוט הפצת וגטטיבי כפי שמתואר פותחה כדי לשחזר את הצמחים לאחר הערכה נמטודות. הפרוטוקול שימש בהצלחה לשחזור צמחים מאוכלוסיות גדולות18. בדרך כלל, מערכת השורש הוא התאושש בתוך 30 ימים לאחר לירות וגטטיבי נשתל. תעריפי ההישרדות גדולים בתדירות גבוהה מ-95%. צמחים המציגים מרץ יכול לאיבוד בעת הפצת מספר רב של צמחים. באופן כללי, פחות מ 1% של הצמחים נכשל הצגת השורש או לירות צמיחה. ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות ולהשתמש בו עם פרוטוקולי סינון נמטודות אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, שירות המחקר החקלאי. ציון שמות המסחר והמוצרים המסחריים במאמר זה נועדו אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינם משתמע המלצות או הצהרות על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית. משרד החקלאות הוא ספק הזדמנויות שווה ומעסיק. למחברים אין ניגוד אינטרסים להכריז. הסיוע הטכני סופק על ידי קריסטי ג'ורדן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ray Leach Cone-tainer Stuewe and Sons Inc. SC10U
Cone-tainer tray Stuewe and Sons Inc. RL98
Sand various
Cotton balls various
Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) Pylon Platics L-4-W Any brand or vendor is acceptible.
4 oz. specimen containers Fisher Scientific 16-320-731 Any brand or vendor is acceptible.
Red food coloring McCormick & Co., Inc.
1 mL Pipet tips various
10 L container various Inexpensive buckets work well.
6 L pots Nursery Supplies Inc. Poly-Tainer-Can No2A Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used
Potting media Sun Gro Horticulture Metro-Mix 360 Any brand or vendor is acceptible.
Fertilizer Everris NA Inc. Osmocote Plus Any brand or vendor is acceptible.
Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) Rubbermaid 3O29  Any brand or vendor is acceptible.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
  2. Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
  3. Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
  4. Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
  5. Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
  6. Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
  7. Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
  8. Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
  9. Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
  10. Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
  11. Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
  12. Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
  13. Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
  14. Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
  15. Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
  16. Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
  17. Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
  18. Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
  19. Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
  20. Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
  21. Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
  22. Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
  23. Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).

Tags

גנטיקה סוגיה 147 כותנה germפלסטיות Gossypium העצים מארח התנגדות צמח הקרנת נמטודות reniform נמטודות התנגדות הרבייה Rotylenchulus reniformis וגטטיבי התפשטות
הקרנת כותנה גנוטיפים לעמידות בפני ההתנגדות של רנפורם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erpelding, J. E., Stetina, S. R.… More

Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance. J. Vis. Exp. (147), e58577, doi:10.3791/58577 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter