Summary
ويوضح البروتوكول استخدام فحص الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري للشخصية بلعم بيتا مستقبلات حمض الفوليك وعلاقته بالخلايا المناعية مجموع التسلل في خزعات الشريان الزمانية في الخلية العملاقة الدموية.
Abstract
خلية عملاقة الدموية (الائتلاف) مرض مزمن المناعي بوساطة الشرايين متوسطة إلى كبيرة الحجم التي تؤثر على كبار السن. بيانات الائتلاف مع أعراض الانسداد من الصداع، التهاب المفاصل والسكتة الدماغية أو فقدان الرؤية. الضامة، والخلايا الليمفاوية T-مساعد اختراق جدار الأوعية الدموية وإنتاج استجابة برو تحريضية التي تؤدي إلى الضرر اللاحق بالسفينة والاسكيميه. وحتى الآن، هناك لا الائتلاف العلامات البيولوجية التي يمكن أن ترصد المرض النشاط ودليل الاستجابة العلاجية.
حمض الفوليك مستقبلات بيتا (FRB) هو بروتين جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول التي ترتكز على أغشية الخلايا وعادة التعبير عنها في النسب حيدي وفي معظم خلايا سرطان الدم النقوي كذلك كما هو الحال في الأورام والمفاصل الضامة الزلالي، حيث يرتبط التعبير مع شدة المرض. قدرة FRB لربط مركبات حمض الفوليك، وحمض الفوليك-يصرف والمخدرات أنتيفولاتي جعلت هدفا دروجابل في مرض السرطان ومرض التهاب البحوث. ويصف هذا التقرير الأنسجة والمناعي الأساليب المستخدمة في تقييم التعبير وتوزيع FRB بالنسبة جكايمونوباثولوجي.
كانت ملطخة الشريان الزمانية الثابتة الفورمالين وجزءاً لا يتجزأ من البارافين خزعات من الائتلاف والضوابط العادية توضع وويوزين باستعراض علم الأنسجة: الأنسجة وتحديد ملامح أصم. إيمونوهيستوتشيميستري استخدمت للكشف عن التعبير FRB و CD68 و CD3. وأجرى تحليل المجهري لتحديد عدد الخلايا الملون إيجابيا على 10 أبواب عالية الطاقة-الحقل المحدد ومواقعها في الجدار الشرياني.
التهاب ليمفوهيستيوسيتيك (LH) مصحوبا بتضخم إينتيمال وتعطلت الصفيحة المرنة كان ينظر في الائتلاف مع أي الموجودة في عناصر التحكم. ارتشاح LH يتكون من 60% من الضامة اللمفاويات و 40 في المائة. التعبير FRB مقصور على الضامة، تتألف من 31 في المائة من مجموع بلعم السكان CD68 + والمترجمة لوسائط الإعلام، والغلالة. واعتبر لا FRB في عناصر التحكم.
هذا البروتوكول أظهرت نمطاً العددية والمكانية متميزة من بلعم FRB بالنسبة إلى المكروية مأمن الأوعية الدموية في الائتلاف.
Introduction
خلية عملاقة الدموية (الائتلاف) مرض التهاب الشرايين المتوسطة إلى الكبيرة، استهداف الشريان الاورطي وفروعه والتي تؤثر على كبار السن. ويقدم خفيفة إلى المضاعفات الدماغية حادة مثل الصداع، ألم الفك، وفقدان الرؤية، والسكتة الدماغية والأنسجة والغرغرينا. ويؤكد التشخيص علامات التهابات عالية مثل كرات الدم الحمراء معدل الترسيب (ESR) ونمط الأنسجة متميزة على الشريان الزمانية خزعة (علامة التبويب)1. الائتلاف الأوعية الكبار الأكثر شيوعاً، وإمكانية الوصول إلى الشريان الزمانية التي تم الحصول عليها للتشخيص ويعرض ميزة على غيرها فاسكولوباثيس، مما مكن واحد دراسة الآلية المرضية سهولة أكبر. وتشمل النتائج النموذجية في علامة التبويب التغلغل الضامة/النسيجية والخلايا اللمفية تي وجدت في كافة طبقات الأوعية الدموية الغلالة البطانية، ووسائط الإعلام، والغلالة مع تدمير المتزامنة الصفيحة المرنة التي عادة ما يفصل بين هذه 2من المقصورات. وتثبت الأدلة الحالية أن الائتلاف ينطوي مستضد غير معروف أنه ينشط الخلايا الجذعية في الغلالة الوعائية، متبوعاً بتوظيف مساعد خلايا T (Th)، على وجه التحديد Th1 و Th17 الأنواع الفرعية التي تفرز انترلوكين-17 و انترفيرون-غاما (IFG) على التوالي. IFG ثم المجندين وينشط الضامة لإنتاج السيتوكينات والبروتياز. وتشمل هذه السيتوكينات الموالية التحريضية؛ بما في ذلك إيل-12، الذي شكل متبادل ينشط خلايا Th1 وبالتالي توفير حلقة التغذية مرتدة إيجابية؛ عامل نخر الورم وانترلوكين-6، الذي يسبب التهاب المفاصل والحمى وميتالوبروتيسيس التي تلف الصفيحة المرنة. الكورتيزون (GC)، التي تشكل العلاج المزمن القياسية، التحكم جزئيا مسارات سيتوكين بتخفيف Th17/إيل-17 ولكن لا ذراع Th1/IFG3،الاستجابة المناعية4. ولسوء الحظ، يؤدي وقف GC انتكاس المرض. كطريقة بديلة، قد تم أغراض أخرى الميثوتريكسات لعلاج الائتلاف، ولكن النهاية السريرية المرجوة لم تتحقق دائماً على الرغم من أن لم تستخدم المؤشرات الحيوية أكثر حساسية للعلاج الرصد5،6 . في عام 2017، ومانع انترلوكين 6، توسيليزوماب، أقر للمعالجة للائتلاف كما أنه أظهر فعالية مكافحة الأمراض والستيرويد تجنيب الآثار7،8.
وحتى الآن، هناك لا المؤشرات الحيوية جيدة للائتلاف. كنتيجة لذلك، من الصعب رصد نشاط المرض وتيتراتي جرعات من الأدوية المتاحة تجنب الآثار الضارة وتخفيف عبء التكلفة للمجتمع. وبالتالي، من الضروري البحث عن العلامات البيولوجية مرشح أن يرتبط بنشاط المرض، وتقديم رؤى جديدة عن المرضية والمساعدة في اتخاذ القرارات العلاجية.
التقلبات بلعم التنشيط عامل حاسم في الائتلاف المرضية. وهكذا، قد يكون وسيلة فعالة لعلاج الائتلاف الاستهداف الانتقائي لتفعيل الضامة. بيتا مستقبلات حمض الفوليك (FRB) هو بروتين سكري جليكوسيل-فوسفاتيديلينوسيتول أن يرتكز على غشاء الخلية المعرب عنها في الخلايا العادية حيدي، خلايا سرطان الدم النقوي وتنشيط الضامة. أن يجند، حمض الفوليك، وهو فيتامين أساسي في شكله مخفضة، التي تمكن الخلوية التوليف ومثلايشن وإصلاح الحمض النووي9. هو فعل التعبير FRB في أمراض المناعة الذاتية وخلال التسرطن. التعبير عن المقيد لسطح وحيدات أو برو-التهابات الضامة M1 في التهاب المفاصل أو الالتهابات M2 الضامة في الجهاز الصلبة والأورام الخبيثة النقوي10،،من1112 , 13-بالإضافة إلى دورها المحتمل كالعلامات البيولوجية لتنشيط الضامة، يمكن تمكين FRB نقل المخدرات انتقائية من خلال عملية متعددة الخطوات تبدأ بربط مستقبلات حمض الفوليك أو أنتيفولاتيس أو المخدرات مترافق الفولات في الخلية السطح، تليها التدخيل والإفراج عنها وتسليم المخدرات المرجوة في نهاية المطاف إلى الخلية الداخلية إليه12،14،،من1516. وعلى نقيض FRB المعرب عنها في الخلايا السرطانية، وتنشيط الضامة، FRB التي أعرب عنها في الخلايا المكونة للدم العادي غير قادر على ربط فلتس مما يضمن أن تسليم المخدرات FRB/حمض الفوليك-بوساطة يقتصر على FRB المصابات بالتهاب أو الخلايا السرطانية.
وفي دراستنا السابقة، أثبتنا للمرة الأولى أن يتم التعبير عن FRB في الائتلاف الضامة والتعبير يرتبط مع CD68 + و endothelin مستقبلات بيتا الضامة، التي تسهم في الائتلاف المرضية17. في هذا التقرير، يصف لنا نسيجية والمناعي الأساليب المستخدمة في تقييم بلعم FRB، وحلل اللمفاويات مجموع وبلعم التهم إلى التبصر في الموقف FRB على الساحة الأوعية الدموية الائتلاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق "مجلس استعراض مؤسسي الدولة بن" جميع الأساليب المذكورة.
1-نسيجية إعداد وتجهيز بعد الحصول على خزعة الشريان الزمانية
ملاحظة: تحت التخدير الموضعي وظروف معقمة يؤديها طبيب جراح مصدقة خزعة الشريان الزمنية (علامة التبويب). بعد الحصول على مقطع الشرايين 3 سم على الجهة المتضررة أكثر جراحيا، ثابتة في الفورمالين فورا ح 24 العينة، مقسمة إلى أقسام 3 إلى 4 مم وجزءاً لا يتجزأ من البارافين، مع إيلاء اهتمام دقيق للتوافق السليم للأنسجة في الكتلة التي ويتم حينئذ تخزين في درجة حرارة الغرفة. ويتم اختيار العينة بعد التحقق من السجلات الطبية. يستند التشخيص على الكلية الأمريكية لمعايير 1990 الروماتيزم الذي يتطلب أن مواضيع الوفاء 3 من 5 المجالات: العمر > 50 عاماً، الحنان الشريان الزمانية بكرات الدم الحمراء معدل ترسيب، صداع جديد > 50 مم/ساعة بأسلوب ويستيرجرين و علامة تبويب غير طبيعي. يجب ارتداء قفازات واقية للسلامة في جميع الأوقات عند التعامل مع العينات والمواد الكيميائية والأجسام المضادة.
- من كتل مضمن، قطع 4-5 ميكرومتر سميكة الأقسام باستخدام مبضع. ووصمة عار والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E). استخدام عنصر تحكم مقطع من أنسجة طبيعية مختارة لضمان الجودة.
- تعويم قطع المقاطع في حمام ماء دافئ ساخنة إلى 40 درجة مئوية إزالة التجاعيد وتلتقط مع شريحة مجهرية المغلفة زجاج. ضع الشرائح الزجاجية على طبق دافئ في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة تيسيرا للتجفيف والانضمام للقسم إلى الشريحة.
- ضع الشرائح الزجاجية على طبق دافئ في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة تيسيرا للتجفيف والانضمام للقسم إلى الشريحة.
- جبل 3 أقسام على شرائح المجهر.
- ضع الشرائح في الرف العمودي والجافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ح 24.
- ضع الشرائح في حاوية ومخزن في 4 درجات مئوية.
2-المناعي إعداد، ديواكسينج، استرجاع مستضد وتلطيخ15،18،،من1920
- تحميل الشرائح في حامل شريحة. تشغيل الحامل من خلال الأطباق على النحو التالي: مرتين في زيلين نفط 100% لمدة 5 دقائق مع 10 ثوان الانفعالات لطيف كل 30 ثانية، مرة واحدة في الإيثانول 100% مع الانفعالات 10 ثوان، مرة واحدة في الإيثانول 90% مع الانفعالات 10 ثوان، مرة واحدة في الإيثانول 70% مع الانفعالات 10 ثوان ، ومزدوجة مرتين في المقطر H2O مع الانفعالات 10 ثوان.
ملاحظة: ينبغي أن يتم التعامل مع زيلين نفط والاسيتون في أغطية التهوية لتجنب استنشاق وسمية الجهاز التنفسي. - استرداد antigen بنقل الحامل إلى حاوية زجاج مع 200 مل من 10 ملمول/لتر، المخزن المؤقت سترات 6.0 درجة الحموضة بريوارميد إلى 95 درجة مئوية. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 30 دقيقة في حوض ماء، ثم تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم يشطف بالماء الجاري لمدة 5 دقائق.
- إزالة نشاط البيروكسيديز الذاتية التي تفرخ في 200 مل بيروكسيد الهيدروجين 3% لمدة 10 دقائق. تغسل شرائح 3 مرات في 200 ميليلتر من المحلول الملحي مخزنة تريس (تبس).
- إزالة الشرائح من الرف وربت كل واحد برفق مسح المخزن المؤقت الزائدة. لتلوين، إضافة 200 ميليلتر الأجسام الأولية التالية، إضافة كشوف الغطاء على الشرائح واحتضان في غرفة رطبة لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة:
1:800 الأجسام المضادة-FRB المخفف
[مونوكلونل] الماوس المضادة الإنسان CD68، تمييع 1: 200
أرنب [بولكلونل] المضادة CD3 تمييع 1: 100
ملاحظة: الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين أقسام المشيمة كانت أيضا معالجتها كما هو مبين في 2.1 الخطوات إلى 2.9 والمحتضنة مع مكافحة--FRB18 وتستخدم كمراقبة إيجابية. نتائج المصبوغة تم الحصول عليها عن طريق إيجاد تركيز الضد الأمثل وكان يؤديها المعايرة الجسم في تخفيف مزدوج (مثلاً 01:50، 1: 100، 1: 200, 1: 400، 1:800، 1:1600). - إزالة كشف الغطاء بعد الاحتضان وتجاهل. شطف الشرائح 3 مرات لمدة دقيقتين مع تبس واستنزاف ومسح المخزن المؤقت الزائدة.
- إضافة 200 ميليلتر من حل جسم الثانوية التي تحتوي على بيوتينيلاتيد مكافحة Rabbit/الماوس جسم الثانوية تتفاعل مع جسم الابتدائي unconjugated منضمة إلى مستضد الأنسجة. ضع كوفيرسليبس على الشرائح واحتضان في غرفة رطبة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة كشف الغطاء بعد الاحتضان وتجاهل. شطف الشرائح 3 مرات لمدة دقيقتين مع TBS واستنزاف ومسح المخزن المؤقت الزائدة.
- إضافة 200 ميليلتر من ديامينوبينزيديني (DAB) + الركازة المخزن المؤقت (HCl ايميدازول)-نظام تشروموجين واحتضان لمدة 10 دقائق لتصور تلطيخ النمط. يغسل مع تبس ثم في إدارة مياه الحنفية لمدة 10 دقائق.
- كونتيرستين مع توضع لمدة 3 دقائق.
- تحميل الشرائح بتطبيق ميليلتر 70 من تصاعد المتوسطة على سطح الشريحة. ببطء نصيحة ساترة على المتوسط المتصاعد وتجنب خلق فقاعات كما كنت أقل أنها في مكانها. انتظر 24 ساعة لتجف.
3-الأنسجة والتحليل المناعي (المدينة)
دراسة ح & ه والمدينة أقسام من الائتلاف مواضيع إيجابية وطبيعية باستخدام مجهر ضوء الملون.
-
لح & ه الملون المقاطع:
- تقييم بنية الأوعية الدموية وتحديد خلايا بطانية في الغلالة البطانية، خلايا العضلات الملساء في وسائط الإعلام، والغلالة والليفية و vasa vasorum في الغلالة الغلالة،من2122.
- التعرف على ميزات الائتلاف، التي تشمل اللمفاويات وتسلل بلعم/histiocyte، فرط الخلوية، وتدهور الصفيحة المرنة الداخلية.
- تحليل ارتشاح ليمفوهيستيوسيتيك بتحديد وقياس عدد الضامة بالنسبة الخلايا الليمفاوية. تقييم مدى اضطراب الصفيحة المرنة الداخلية والتغيرات (hyperplastic) في الخلايا المقيمين ومقارنة مع عناصر التحكم.
-
للمدينة الملون المقاطع:
- دراسة نمط المصبوغة FRB، إذ تحيط علما بالتعبير عن طريق نوع معين أو أنواع من الخلايا وتوزيعها داخل طبقات الأوعية الدموية وعلاقته ارتشاح المناعي مجموع وعلامة مجموع بلعم ومكافحة CD68 وعموم علامة اللمفاويات المضادة CD3.
- قياس التعبير عن خلايا FRB و CD68 و CD3 طريق عد الخلايا الملون إيجابيا على 10 حقول متعددة تم اختيارها عشوائياً من الطاقة العالية (hpf) وتسجيل الوسائل.
ملاحظة: تحديد هذه الخلايا العادية وباثولوجي وهياكل كان يؤديها أخصائي أمراض القلب والأوعية الدموية معتمدة (ج. م.) وسجلت الأمراض الرئوية (الشعيبة) والنتائج لجميع الحالات. - التقاط الصور التمثيلية باستخدام كاميرا رقمية.
ملاحظة: وبعد هذه الخطوات، تبقى مختبرين قد تكون مخزنة في-80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائج الأنسجة
ح & ه بقع في العينات الطبيعية أظهر التشريح الشرياني الطبيعي مع خلايا البطانية في الغلالة البطانية، خلايا العضلات الملساء في وسائط الإعلام، والغلالة ومصفوفة الكولاجين ايربان التي تشمل سفن التغذية والليفية تسمى vasa vasorum في الغلالة الغلالة. لا يوجد أي ارتشاح التهابي المحددة. أظهرت الشرايين الزمنية الإيجابية الائتلاف المعتدل إلى التهاب حاد مع المجاميع من الضامة/النسيجية والخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما عرضية والخلايا العملاقة مولتينوكليتيد. تضييق لومينال لاحظت ومصحوبة باضطراب intimal 90% وسماكة الصفيحة المرنة الداخلية (الشكل 1).
النتائج المناعي
كانوا موجودين في جميع العينات الائتلاف + CD3 + لمفاوية و CD68 + الضامة أظهرت أنماط المصبوغة مماثلة في جميع خزعات. الخلايا الليمفاوية سادت عبر الضامة بنسبة 1.6 CD3/CD68. تلوين ل FRB مقصور على الضامة، والخلايا العملاقة مولتينوكليتيد التي تفضيلي مترجمة إلى والبرانية ووسائط الإعلام (الجدول 1 و الشكل 2). التحكم في العينات أظهرت الكريات البيضاء الحد الأدنى (< الحقل 5 خلايا-الطاقة العالية) وليس التعبير FRB.
رقم 1: صور ح & ه الشرايين الزمانية. الصورة (أ) ممثل ح & ه الشريان الزمني العادي مع طبقات متميزة من الغلالة الغلالة (t)، ووسائط الإعلام، والبطانية من الأبعد إلى الأقرب/لومينال الجانب على التوالي. لاحظ الشبكة من الكولاجين و vasa vasorum في الغلالة (الأسهم سميكة)، خلايا العضلات الملساء في وسائط الإعلام (أسهم رقيقة)، والخلايا البطانية في البطانية (10 x التكبير). (ب) صورة مجهرية موسع من واجهة البطانية--وسائل الإعلام هو أبرز اقحم مستطيلة في A ويتم فصل بواسطة الصفيحة المرنة الداخلية (رؤوس) (20 x التكبير). (ج) ممثل ح & ه صورة تا مع الدموية الخلية العملاقة التي تميزت التغلغل ليمفوهيستيوسيتيك ترانسمورال (الأسهم سميكة) وتضخم إينتيمال وتدمير الصفيحة المرنة الداخلية (رؤوس) (10 x التكبير). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: المناعي تلطيخ الشرايين الزمانية مع خلية عملاقة الدموية. إظهار الصور التمثيلية (A) ارتشاح تحريضية واسعة النطاق مع CD68 إيجابية الضامة، والخلايا العملاقة (الأسهم) وجد معظمهم في وسائل الإعلام والغلالة (10 x التكبير). (ب) حمض الفوليك مستقبلات بيتا (FRB) أعرب بشكل انتقائي في تنشيط الضامة (الأسهم) (10 x التكبير). الصورة التي اتخذت في السلطة العليا أثبت FRB الضامة إيجابية في (ج) والضامة الإيجابية CD68 في (د) (التكبير 100 x). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مواضيع الائتلاف (n = 5) | يعني (±SD) |
| CD3 (% من ارتشاح المناعي) | 61.7 ± 4.1 |
| CD68 (% من ارتشاح المناعي) | 38.3 ± 4.1 |
| CD68 النسيجية/الضامة (خلايا/هبف) | 34.8 ± 10.4 |
| FRB + الضامة (خلايا/.hpf) | 10.8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12.7 |
الجدول 1: ملخص التعبير FRB و CD68 و CD3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الائتلاف هو التهاب الأوعية الأكثر شيوعاً في البالغين، ولها سمة مرضية تجسد مجموعة قوية من لمفاوية مساعد تي وتنشيط الضامة التي ترد أيضا في سائر الأمراض الحبيبية أو فاسكولوباثيس مثل ساركويد و 2،بوليانجييتيس الحبيبي3. في الائتلاف، يوفر الشريان الزماني تمثيل جيد الشريان متوسطة إلى كبيرة الحجم وخزعة تا يعطي عينة كبيرة الحجم التي يمكن تخزينها في كتل البارافين لسنوات، وبالتالي خلق فرص لدراسة أدوار الناشئة التشخيص و الأهداف العلاجية مثل FRB في المكروية فاسكوليتيك. وقد اتخذنا الميزة التي قدمها الأنسجة موجوداً والأساليب القياسية إيمونوباثولوجيك أن اسأل ما إذا كان يمكن تحليلها FRB موثوق بها عن طريق المدينة. وتبين النتائج التي توصلنا إليها أن التشريح المرضى والمدينة يمكن أن تخدم كأدوات قيمة ليس فقط في تأكيد التشخيص ومدى الضرر والأوعية الدموية ولكن أيضا في التحقق من صحة دور بلعم مختلفة الأنواع الفرعية في الائتلاف.
التشريح المرضى وطرق المدينة هي كل العمالة المكثفة، وتتطلب مهارات فني histochemical، أخصائي في علم الأمراض والأمراض الرئوية، ولكن التقنيات التي أنشئت أيضا ويمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق لاستخدام أساليب أخرى مثل الفلورة والتدفق الخلوي. عيب مثل هذه الأساليب، غير أن الحاجة إلى الأنسجة المجمدة الطازجة التي تتطلب جمع المحتملين. المدينة، إلى جانب فحص الأنسجة، لا تقدر بثمن في تقديم منظور بانورامية من المكروية مأمن الأوعية الدموية التي يمكن الوصول إليها مرارا وتكرارا وتحليلها خاصة مع ظهور رواية البروتينات مثل FRB. توضع وويوزين (H & E) تلطيخ تمكن واحد لاستعراض الأنسجة الأنسجة. توضع بقع النواة، ويسلط الضوء على التفاصيل النووية بينما ويوزين بمثابة كونتيرستين الذي يساعد في إظهار الاختلافات بين الميزات النووية وحشوية. استخدام عنصر تحكم مقطع من أنسجة طبيعية مختارة ضروري لتقييم لضمان الجودة.
المدينة بالكشف عن مستضد الاهتمام في الأنسجة المجمدة أو الفورمالين--الثابتة وجزءاً لا يتجزأ من البارافين من خلال استخدام أجسام مضادة متعددة وهي تصور بالفحص المجهري. كان البروتوكول وصف مقتبسة من فإن دير هيجدين et al.15، الذين أظهروا التعبير FRB في الضامة الزليلي في التهاب المفاصل. وتشمل الخطوات الأساسية المدينة إعداد الأنسجة، ديواكسينج/ديبارافينيزيشن، واسترجاع مستضد وتلطيخ23. من الضروري التأكد من أن الأنسجة إزالة من المريض يتم إصلاحها فورا في محاذاة الفورمالين والأنسجة واتجاه الاحتفاظ بدقة في حالة ثابتة في البارافين. هو مقطوع رقيقة باستخدام مبضع الأنسجة ويخضع خطوة ديواكسينج يتطلب يغسل متعددة في زيلين نفط، الإيثانول والماء. الخطوة التالية، يسمى مستضد استرجاعها، هناك حاجة إلى كسر الروابط الميثيلين شكلت أثناء التثبيت الفورمالين ويتطلب المخزن المؤقت المستند إلى سترات والحرارة الرطبة. يتم التعامل مع الشرائح مع بيروكسيد الهيدروجين لمنع إنزيمات البيروكسيديز الذاتية التي يمكن أن تتداخل مع الكشف عن مستضد. القادم هو تنفيذ الإجراء المصبوغة التي تفرخ الشرائح مع المخفف من الأجسام المضادة الأولية التي سيتم ربط مستضد الاهتمام تليها تطبيق جسم ثانوية التي سيتم الكشف عن رد فعل ضد مستضد الأولية. هذا هو متبوعة العلامات مع chromogen الدأب-الركيزة التي تشكل صبغة بني هو تصور تحت المجهر. والخطوة الأخيرة هي تصاعد حذراً من الأنسجة مع حل دائم مع التأكد من أن لا مواد التدخل مثل الفقاعات تتشكل بين كشف الغطاء وسطح. تعديلات البروتوكول المطلوبة لاستيعاب استخدام أنسجة الشرايين. نظراً للدراسة الأولى لتقييم FRB في الائتلاف، تركيز جسم المثلى غير معروف والحاجة إلى تخفيف متعددة في 01:50، 1: 100، 1: 200, 1: 400، 1:800، 1:1، 600، 1:3200 مع أفضل تلطيخ الجودة في أدنى ضجيج الخلفية أو إشارة إليه في 1:800.
قبل التحقق من صحة FRB المرتبطة بالغشاء بروس 18،et al.24 ووجد أن يتم التعبير عنها في خلايا المشيمة طبيعية، العَدلات، ليوكيميك الانفجارات في سرطان الدم النقوي المزمن، promyelocytic سرطان الدم، السكان مييلوبلاست حيدي، واريثروليوكيمياس، ومغايرة في سرطان الدم النقوي الحاد M1/M2. منذ ذلك الحين تم تطبيقها الجسم [بولكلونل] أرنب تنقية النسب المحددة ل FRB المستخدمة في هذه الأعمال السابقة على الدراسات الضامة الزليلي إيجابية التهاب المفاصل وأورام الجهاز الصلبة. لا يتوفر تجارياً جسم FRB المستخدمة في هذا البروتوكول وقد تعرقل تطبيق واسع النطاق. ومن المتصور المنهجية الموصوفة هنا قد تعمل أيضا لسائر الأجسام المضادة FRB لكن سوف تتطلب التحسين الفردية قبل استخدامها في إعداد أكبر. منذ FRB معبر عنها إلى حد كبير في المشيمة، هذا النسيج قد استخدمت مرارا وتكرارا كعنصر إيجابي.
تصميم الدراسة محدود بحجم عينة صغير ويتطلب التحقق من الصحة في إعداد أكبر من علامات التبويب التي تم الحصول عليها من الناحية المثالية في المراحل المبكرة والمتأخرة من الائتلاف. وبالإضافة إلى ذلك، منذ بلعم FRB يمكن اعتبارها هدفا محتملاً التشخيصية والعلاجية مع وكلاء مترافق الفوليك وأنتيفولاتيس، يدعم البيانات التي تم الحصول عليها هنا الحاجة إلى مواصلة دراسة النمط الظاهري FRB في سياق بلعم M1 و M2 الاستقطاب. فيما يتعلق بتشخيص أخرى، مترافق هذه الفرص مفتوحة النتائج للنهج التصوير غير الغازية مع حمض الفوليك FRB استهدفت SPECT الحيوانات الأليفة التصوير وكلاء. بالإضافة إلى ذلك، تسلل بلعم سمة مميزة لتطور المرض والنشاط في تصلب الشرايين، وتصلب الجلد، ساركويد، والتهاب المفاصل، فإن استخدام هذا البروتوكول يمكن العثور على التطبيقات في مثل هذه الظروف.
وهذا البروتوكول الأول لاستكشاف في التعبير وتوزيع FRB في الائتلاف. يسمح المدينة بانورامية مستعرضة ووجهات نظر متعددة من المساعدة الفنية ويسمح تحليل العلاقات العددية بين ارتشاح محصنة والمكرويه الشرياني. FRB تضم 30% الضامة الإجمالية التي تسللت إلى كل طبقات جدار الأوعية الدموية، ولكن من المثير للاهتمام، FRB لا عثر في البطانية والمترجمة فقط إلى والبرانية ووسائل الإعلام. هذا النمط من التوزيع قد تكشف عن رؤى جديدة على انتحاء بلعم FRB لتكوين الكولاجين التفاضلية الموجودة في وسائل الإعلام وطبقات أدفينتيتيال25. ارتشاح مأمن يتألف من حوالي 60% لمفاوية (مقاسا بعموم-اللمفاويات ماركر المضادة-CD3) والضامة 40% (تميزت بلعم عموم ماركر مكافحة--CD68). دراسة حديثة يرتبط CD3 مع حساسية أعلى لتشخيص الائتلاف في حين آخر مرتبط CD68 التعبير نشاط المرض أعلى. وهكذا، فإننا نقترح أن يبدأ الوسط مأمن الأوعية الدموية المبكرة في الائتلاف مع نسبة كبيرة من لمفاوية: الضامة مع 30% الضامة يجري FRB إيجابية. ما إذا كان هذا ينطبق على وأظهرت استمرار في المرضى الذين يعانون من المرض المبكر ينبغي أن تكون كذلك تجارب المصادق عليها في المستقبل والمحتملين. إذا كان هذا التوزيع ارتشاح خلوي يحمل دائماً، فإنه قد ثم مثابة مركب العلامات البيولوجية لنشاط المرض الائتلاف.
وفي الختام، أثبت هذا البروتوكول للمرة الأولى وجود تسلل FRB في وسائط الإعلام، والغلالة من الشرايين الزمانية في الائتلاف. FRB الضامة تمثل حوالي ثلث السكان بلعم المجموع في وقت مبكر ونشط المكروية الائتلاف يتكون من الضامة اللمفاويات و 40% 60%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأمكن هذا العمل بالدعم من الدكتور دوغلاس السلالم، ماريان كلينغر، بينكو Ann، شعبة أمراض الروماتيزم/قسم الطب والجزيئية و "الأنسجة الأساسية المختبرية"، و "بنسلفانيا الدولة كلية الطب في جامعة"، هيرشي بنسلفانيا
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
