Summary
Протокол иллюстрирует использование гистопатологические осмотра и иммуногистохимии профиль макрофагов бета рецепторов фолиевой кислоты и ее отношения с общей иммунных клеток проникнуть в биопсии височной артерии в гигантоклеточная артериальный.
Abstract
Гигантоклеточная артериит (ГКА) является хронической болезнью, связанный иммунной опосредованного артерий среднего и большого размера, затрагивает пожилых людей. GCA манифесты с артритом и окклюзионной симптомы головной боли, инсульта или потери зрения. Макрофаги и лимфоциты Т-хелперами проникнуть сосудистой стенки и производят про воспалительной реакции, которые ведут к судну ущерб и ишемии. На сегодняшний день, есть нет ГЦА биомаркеров, который может контролировать болезнь деятельность и руководство лечебных ответ.
Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosylphosphatidylinositol белок, который является якорь на клеточные мембраны и обычно выражается в линии миеломоноцитная и в большинстве клеток миелоидной лейкемии как опухоли и ревматоидные синовиальной макрофагов, где его выражение коррелирует с тяжести заболевания. FRB возможность привязать фолиевой кислоты соединений, фолиевой кислоты конъюгатов и antifolate наркотиков сделала его druggable цель в рак и воспалительные болезни исследований. В настоящем докладе описываются гистопатологические и иммуногистохимических методов, используемых для оценки выражения и распределение FRB по отношению к GCAimmunopathology.
Формалин исправлена и парафин врезанных височной артерии биопсий ГКА и нормального управления окрашивали гематоксилином и эозином пересмотреть Гистология ткани и определить патогномоничных функции. Иммуногистохимия была использована для выявления FRB, CD68 и CD3 выражение. Микроскопический анализ проводился для количественного определения количество положительно окрашенных клеток на 10 выбранных секций высокой мощности поля и их местоположения в стенке артерий.
Воспаление Lymphohistiocytic (ЛГ) в сопровождении гиперплазия интимы и нарушается упругой пластинки был замечен в ЗКО с ничего не найдено в элементах управления. LH инфильтрат состоит из примерно 60% лимфоцитов и 40% макрофагов. FRB выражение ограничивался макрофагов, состоящий из 31% всего населения CD68 + макрофагов и локализованные для средств массовой информации и адвентиции. Не FRB был замечен в элементах управления.
Этот протокол продемонстрировал шаблон различных численных и пространственной FRB макрофага по отношению к сосудистой иммунной микроокружения в ЗКО.
Introduction
Гигантоклеточная артериит (ВКА) является воспалительным заболеванием средне крупных артерий, ориентация аорты и ее ветвей и затрагивает пожилых людей. Она представляет с умеренной до тяжелой ишемических осложнений, таких как головные боли, боли в челюсти, потеря зрения, инсульта и тканей гангрены. Диагноз подтверждается высоким воспалительные маркеры как скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и собственный гистопатологические картины на височной артерии биопсии (вкладка)1. ГКА является наиболее распространенным взрослых васкулит, и доступность височной артерии, полученные для диагностики представляет преимущество над другими специализирующемуся, таким образом позволяя один для изучения его патогенез более легко. Типичные результаты на закладке включают инфильтрата гистиоциты/макрофагов и Т-лимфоцитов, нашли на всех уровнях сосудистой интимы туника, СМИ и адвентиции с параллельной разрушения упругой пластинки, которая обычно отделяет эти 2отсеках. Текущий доказательства свидетельствуют, что ВКА включает неизвестный антиген, который активирует дендритные клетки в адвентиции сосудов, следуют найма помощника клетки T (Th), специально Th1 и Th17 подтипы, которые выделяют интерлейкина-17 и Интерферон гамма (МГС) соответственно. ИФГ затем новобранцев и активирует макрофаги производить цитокинов и протеаз. К ним относятся провоспалительных цитокинов; включая Ил-12, которая взаимно активирует клетки Th1, обеспечивая тем самым положительной обратной связью; фактор некроза опухоли и интерлейкина-6, вызывающие артрит и металлопротеаз и лихорадки, которые повреждают упругой пластинки. Глюкокортикоидов (GC), которые являются стандартной терапии хронической, частично управлять цитокина пути ослабления Th17/Ил-17, но не Th1/IFG руку иммунный ответ3,4. К сожалению прекращение GC приводит к рецидиву болезни. В качестве альтернативного механизма метотрексат был многоцелевых ГЦА лечения, но желаемого клинические конечные точки не были достигнуты последовательно, хотя более чувствительных биомаркеров не были использованы для терапевтического мониторинга5,6 . В 2017 году интерлейкин 6 окон, tocilizumab, был одобрен для лечения вка, как доказано эффективно болезнями и стероидных щадящие эффекты7,8.
На сегодняшний день, есть нет хороших biomarkers для ЗКО. В результате трудно контролировать активность заболевания и титровать дозы доступных препаратов, чтобы избежать неблагоприятных последствий и уменьшить бремя расходов для общества. Таким образом важно, чтобы искать кандидата биомаркеров, что коррелирует с активностью болезни, обеспечивают новые идеи по патогенезу и помощи в терапевтических решений.
Dysregulation активация макрофагов является решающим фактором в патогенезе ЗКО. Таким образом могут быть эффективным средством лечения вка, избирательного отношения к Активированные макрофаги. Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosyl фосфатидилинозитол гликопротеин, которая зиждется на клеточной мембране в нормальной миеломоноцитная клеток, клеток миелоидной лейкемии и активация макрофагов. Его лиганда, фолиевая кислота, является одним из важнейших витаминов в сокращенной форме, которая позволяет клеточной ДНК синтеза, метилирование и ремонт9. FRB выражение индуцируется в аутоиммунных заболеваний и канцерогенеза. Его выражение ограничен поверхности моноциты или про воспалительных M1 макрофагов в ревматоидный артрит, или противовоспалительные м2 макрофагов в твердые органов и миелоидных злокачественных10,11,12 , 13. в дополнение к своей потенциальной роли в качестве биомаркера активированных макрофагов, FRB можно включить селективного наркотиков транспорта через многоступенчатый процесс, который начинается с привязкой рецепторов фолиевой кислоты, антифолаты или фолиевой кислоты конъюгированных наркотиков в ячейке поверхности, следуют интернализации, выпуска и окончательной доставки желаемого наркотиков внутренних ячейки машин12,14,15,16. В отличие от FRB выражена в раковых клеток и активации макрофагов, FRB, выраженные в нормальные гемопоэтические клетки способны связывать фолатов, обеспечивая тем самым, что FRB/фолиевой кислоты опосредованной лекарств ограничен FRB-положительных воспалительных или раковые клетки.
В нашем предыдущем исследовании мы показали в первый раз, что FRB выражается в ЗКО макрофагов и его выражение коррелирует с CD68 + и эндотелина рецептора бета макрофаги, которые способствуют ГЦА патогенеза17. В настоящем докладе мы описываем гистопатологические и Иммуногистохимические методы используются для оценки FRB макрофагов и анализируется общая лимфоцитов и макрофагов рассчитывает получить представление о FRB позиции в ЗКО сосудистой ландшафт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные были утверждены Пенн государства институциональных Наблюдательный Совет.
1. гистопатологические подготовка и обработка после получения биопсии височной артерии
Примечание: Биопсии височной артерии (вкладка) проводится под местной анестезией и стерильных условиях сертифицированным хирургом. После хирургическим путем получения артериальной раздел 3 см на более пораженной стороне, образец фиксированной в формалин сразу за 24 ч, разделен на секции 3 до 4 мм и заливали в парафин, уделяя пристальное внимание надлежащему применению ткани в блоке который затем сохраняется при комнатной температуре. Выбор образца производится после проверки медицинских записей. Диагноз основывается на американского колледжа ревматологии 1990 критериев которой требует выполнения темы 3 5 доменов: возраст > 50 лет, Новая головная боль, нежность височной артерии, СОЭ > 50 мм/час Вестергрен методом и Аномальные вкладка. Для обеспечения безопасности, должны носить защитные перчатки во все времена при обработке образцов, химических веществ и антител.
- Из встроенных блоков вырежьте 4-5 микрон толщиной разделы, используя микротом. и пятно с гематоксилином и эозином (H & E). Используйте раздел управления отдельных нормальной ткани для обеспечения качества.
- Поплавок, сократить разделы на ванну теплой водой нагревается до 40 ° C до удаления морщин и забрать с покрытием стекла микроскопических слайдов. Место стекла слайды на теплой плите в 60 ° C духовке в течение 60 минут для облегчения сушки и присоединение секции к слайду.
- Место стекла слайды на теплой плите в 60 ° C духовке в течение 60 минут для облегчения сушки и присоединение секции к слайду.
- Закрепите 3 секции на скольжениях микроскопа.
- Место слайды в вертикальной стойке и сухой ночлег за 24 часа при 37 ° C.
- Место слайды в контейнер и хранить при 4 ° C.
2. иммуногистохимических подготовка, депарафинизации, антиген извлечения и пятнать15,18,19,20
- Загрузить слайды в стойку слайд. Запустить стойки через блюда следующим: дважды в 100% ксилола за 5 минут с 10 секунд нежной агитации каждые 30 секунд, один раз в 100% этанола с 10 секунд агитации, один раз в 90% этанола с 10 секунд агитации, один раз в 70% этанол с перемешиванием 10 секунд , и дважды в двойной дистиллированной H2O с 10 секунд агитации.
Примечание: Обработка и ацетон, ксилол должно быть сделано в вентилируемых вытяжки избегать вдыхания и дыхательной токсичности. - Извлечь антигена, передачи стойки в стеклянной посуде с 200 мл 10 ммоль/л, pH 6.0 цитрат буфера подогретую до 95 ° C. Установите таймер на 30 минут на водяной бане, а затем охладить при комнатной температуре для 20 минут, затем промыть проточной водой в течение 5 минут.
- Удалите активности эндогенной пероксидазы, инкубации в 200 мл 3% перекиси водорода на 10 минут. Вымойте слайды 3 раза в 200 мкл трис буфер солевой раствор (TBSS).
- Удалите слайды из стойки и промокните каждого из них аккуратно протрите избыточного буфера. Для окрашивания, добавьте 200 мкл следующих основных антител, добавить обложки скользит на слайдах и проинкубируйте 1 час при комнатной температуре во влажной камере:
Антитела анти-FRB разбавленный терапевтами
Моноклональные мыши античеловеческие CD68, разведение 1: 200
Кролика polyclonal анти CD3 разбавления 1: 100
Примечание: Формалин Исправлена парафин врезанных секции плаценты были также обрабатываются как указано в шаги 2,1 до 2,9 и инкубируют с анти FRB18 и используется в качестве позитивного элемента управления. Окрашивание результаты были получены путем нахождения оптимального антитела концентрации и была выполнена путем титрования антител в двойной разведений (например, 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, терапевтами, 1:1600). - Удалите крышку выскальзования после инкубации и отменить. Промойте слайды 3 раза в течение 2 минут с TBSS, слейте воду и протрите избыточного буфера.
- 200 мкл вторичное антитело раствора, содержащего биотинилированным Rabbit/мыши вторичное антитело реагировать с неконъюгированной основное антитело, привязан к ткани антигена. Место coverslips на слайдах и проинкубируйте 45 минут при комнатной температуре во влажной камере.
- Удалите крышку выскальзования после инкубации и отменить. Промойте слайды 3 раза по 2 минуты с TBS, слейте воду и протрите избыточного буфера.
- Добавить 200 мкл Диаминобензидин (DAB) + субстрат буфера (имидазол HCl)-хромогена системы и инкубировать на 10 минут, чтобы визуализировать пятнать шаблон. Затем промыть TBSS в проточной водопроводной воды за 10 минут.
- Изображение с применением окрасок гематоксилин за 3 минуты.
- Смонтируйте слайды, применяя 70 мкл средних монтажа на поверхности слайда. Медленно наконечник coverslip на носитель монтажа и избегать создания пузырьков, как вы опустите его на место. Подождите 24 часа для просушки.
3. гистопатологические и иммуногистохимическое (IHC) анализ
Изучите H & E и IHC окрашенных разделы из вка позитивные и обычных предметов с использованием световой микроскоп.
-
Для H & E окрашенных секций:
- Оценки сосудистой архитектуры и выявления эндотелиальных клеток в туника интима, гладкомышечные клетки туника СМИ и фибробластов и свое Васа в адвентиции туника,21,,22.
- Идентифицировать ГЦА функций, которые включают лимфоцитов и макрофагов/histiocyte инфильтрации, клеточной гиперплазии и деградации внутренних упругой пластинки.
- Анализ lymphohistiocytic инфильтрата путем выявления и количественного определения количества макрофагов относительно лимфоцитов. Оценить степень нарушения внутреннего упругой пластинки и гиперпластические изменения в клетках резидентов и сравнить с элементами управления.
-
Для IHC окрашенных секций:
- Изучить окрашивание шаблон FRB, принимая к сведению его выражения определенного типа или типов клеток и его распределения в рамках сосудистых слоях и ее отношения общей иммунной инфильтрата, маркер всего макрофагов, анти CD68 и Пан лимфоцитов маркер анти CD3.
- Определить выражение FRB, CD68 и CD3 клеток путем подсчета положительно окрашенных клеток на 10 несколько полей случайно выбранных высокой мощности (hpf) и запишите средства.
Примечание: Выявление этих нормальных и патологических клеток и структуры были исполнены патологоанатом сертифицированных сердечно-сосудистой системы (J.M.) и ревматолог (С.А.А) и результаты были записаны для всех случаев. - Захват представитель изображения с помощью цифровой камеры.
Примечание: После этих шагов оставаясь аликвоты может храниться при температуре-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гистопатологические выводы
H & E пятна в нормальные образцы показали нормальная анатомия артерий с эндотелиальных клеток интимы туника, гладких мышечных клеток в СМИ туника, и разнородные коллагеновой матрицы, которые включают фибробластов и фидерные суда под названием Васа свое в adventitia туника. Существует нет воспалительного инфильтрата определены. GCA позитивные височной артерии продемонстрировал умеренной до тяжелой воспаление с агрегатами макрофагов/гистиоциты, лимфоцитов, случайные клетки плазмы и многоядерные гигантские клетки. Люминал сужение было отмечено и сопровождается интимы утолщение и 90% нарушения внутренней упругой пластинки (рис. 1).
Результаты иммуногистохимии
CD3 + лимфоцитов и макрофагов CD68 + присутствовали во всех ГЦА + образцах и продемонстрировали аналогичные окрашивания моделей в все биопсии. Лимфоциты преобладали над макрофагов с коэффициентом CD3/CD68 1.6. Пятнать для FRB был ограничен макрофагов и многоядерные гигантские клетки, которые преимущественно локализованы в адвентиции и СМИ (таблицы 1 и 2). Контроль образцов показал минимальный лейкоцитов (< 5 клеток/высоким-мощности поле) и выражение не FRB.
Рисунок 1: H & E изображения височной артерии. (A) представитель H & E изображение нормальной височной артерии с различных слоев адвентиции Туника (t), средств массовой информации и интима от внешних к внутренним/Люминал стороне соответственно. Обратите внимание на сеть коллагена и Васа свое в адвентиции (толщиной стрелки) и гладкомышечные клетки в средствах массовой информации (тонкие стрелки), эндотелиальные клетки в интима (10 крат). (B) расширенного Микрофотография интима медиа интерфейса выделен прямоугольной вставкой в A и разделенных внутренним упругой пластинки (стрелок) (20 x увеличение). (C) представитель H & E изображение TA с гигантоклеточная артериит, отмечен Трансмуральное lymphohistiocytic инфильтрат (толщиной стрелки), гиперплазия интимы и уничтожение внутренней упругой пластинки (стрелок) (10 крат). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: иммуногистохимическое окрашивание височной артерии с гигантоклеточная артериальный. (A) представитель изображения показывают обширные воспалительного инфильтрата CD68 позитивные макрофагов и гигантских клеток (стрелки) в основном в средствах массовой информации и адвентиции (10 крат). (B) бета рецепторов фолиевой кислоты (FRB) избирательно была выражена в активированных макрофагов (стрелы) (10 крат). Изображение снято на высокой мощности продемонстрировал позитивные макрофаги FRB в (C) и CD68 позитивные макрофагов в (D) (100 крат). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| GCA предметы (n = 5) | Среднее (болезни) |
| CD3 (% иммунной инфильтрат) | 61.7 ± 4.1 |
| CD68 (% иммунной инфильтрат) | 38.3 ± 4.1 |
| CD68 гистиоциты/макрофагов (клетки/ФВЧ) | 34.8 ± 10.4 |
| FRB + макрофагов (клетки/.hpf) | 10,8 ± 4,4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12.7 |
Таблица 1: Резюме FRB, CD68 и CD3 выражения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ГКА является наиболее распространенным васкулит у взрослых, и его патологического hallmark является примером мощное сочетание вспомогательные Т-лимфоцитов и активации макрофагов, которые также могут быть найдены в других гранулематозный заболевания или специализирующемуся как саркоидоз и гранулематозный полиангиит2,3. В ЗКО, височной артерии дает хорошее представление о среднего и большого размера артерии и TA биопсии дает значительные образца, который может храниться в парафиновые блоки для лет, создавая тем самым возможности для изучения роли новых диагностических и терапевтических целей как FRB в васкулитный микроокружения. Мы воспользовались представлены доступные ткани и методы стандартных immunopathologic спросить ли FRB можно надежно проанализированы через IHC. Наши результаты показывают, что гистопатология и IHC могут служить ценным инструментом не только для подтверждения диагноза и степень повреждения сосудов, но и в подтверждении роли различных макрофагов подтипы в ЗКО.
Гистопатология и методы IHC являются оба трудоемким и требует навыков гистохимические техник, патологоанатом и ревматолог, но методы были созданы хорошо и может служить в качестве плацдарма для использования других методов, таких как иммунофлюоресценции и потока цитометрии. Недостатком таких методов, однако, является необходимость свежий замороженные ткани, которая требует перспективные коллекции. IHC, вместе с гистопатологические экспертизы, имеет неоценимое значение в представлении панорамным перспективы сосудистой иммунной микроокружения, которые могут быть неоднократно доступны и проанализированы особенно с появлением новых белков как FRB. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание позволяет проанализировать Гистология ткани. Гематоксилином пятна ядро и подчеркивает ядерный детали пока эозина служит изображение, которое помогает в демонстрации различий между ядерные и цитоплазматические функции. Использование раздела управления выбранного нормальной ткани имеет важное значение для оценки качества.
IHC распознает антиген интереса в замороженных или формалина исправлена и парафин врезанных тканей за счет использования нескольких антитела, которые визуализируются при микроскопии. Протокол, в описанный был адаптирован от Ван дер Хейден et al.15, который продемонстрировал FRB выражение в синовиальной макрофагов в ревматоидном артрите. Основные шаги IHC включают подготовку тканей, депарафинизации/депарафинизации, антиген поиска и пятнать23. Важно обеспечить, чтобы ткани удалены от пациента немедленно фиксируется в тканей формалином и выравнивание и ориентацию, тщательно сохраняются при фиксированной в парафин. Ткани тонко секционного с использованием микротом и подвергается депарафинизации шаг, который требует нескольких стирок в ксилоле, этанол и вода. Следующий шаг, названный антигена поиска, нужно сломать метиленовой связей, сформированные во время фиксации формалином и требует буфера на основе цитрата и влажного тепла. Слайды, рассматриваются с перекисью водорода для блокирования эндогенной пероксидазы ферменты, которые могут мешать обнаружения антигена. Окрашивание процедура выполняется следующая инкубировать слайды с разбавленным первичного антитела, которые свяжут антигена интереса после применения вторичное антитело, которое определит основной антиген антитело реакции. Это сопровождается маркировки с хромогена DAB-субстрат, который образует коричневый пигмент, который визуализируется под микроскопом. Последним шагом является тщательный монтаж ткани с помощью постоянного решения, убедившись, что не мешая веществ как пузырьки образуются между крышку выскальзования и поверхности. Протокол требует изменения для учета использования артериальной ткани. Поскольку исследование было первым, чтобы оценить FRB в ЗКО, оптимальный антитела концентрации был неизвестен и требуется несколько разведений в 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, терапевтами, 1:1, 600, 1:3200 с лучшими окрашивания качества на низкий фоновый шум или сигнал достигнуто на терапевтами.
Связанный мембранами FRB был ранее одобрен Росс et al.18,24 и был найден выражаться в нормальные клетки плаценты, нейтрофилы, лейкозных взрывов в хроническая миелогенная лейкемия, лейкоз promyelocytic, миелобластный популяций миеломоноцитная и erythroleukemias и переменно в острый миелобластный лейкоз M1/M2. Сродство очищенная кролик поликлональных антител специфических для FRB, используемых в этих более ранних работах с тех пор были применены к исследования ревматоидный артрит позитивные синовиальной макрофагов и твердых органа опухоли. FRB антитела, используемые в настоящем Протоколе не коммерчески доступен и может препятствовать широкое применение. Предположительно по методике, описанной здесь могут также работать для других FRB антител, но потребует отдельных оптимизации перед его использованием в больших количествах. Так как FRB значительно выражается в плаценту, эта ткань неоднократно использовались как позитивный элемент управления.
Дизайн исследования был ограничен небольшой размер выборки и требует проверки в большем количестве вкладок, идеально полученные на ранних и поздних стадиях ЗКО. Кроме того поскольку FRB Макрофаг может служить в качестве потенциальных диагностических и терапевтических цели с фолиевой проспряганных агентов и антифолаты, полученные здесь данные поддерживает необходимость дальнейшего изучения FRB фенотип в контексте макрофагов М1 и м2 поляризация. В отношении других диагностики эти результаты открытые возможности для неинвазивной визуализации подходов FRB целевых фолиевой кислотой конъюгированных ОФЭКТ PET изображений агентов. Кроме того учитывая, что проникновение макрофагов является признаком прогрессирования заболевания и активности в атеросклероз, склеродермия, саркоидоз и ревматоидный артрит, использование этого протокола может найти применение в этих условиях.
Это первый протокол к исследовать на выражение и распространение FRB в ЗКО. IHC разрешено панорамный поперечного сечения и несколько представлений TA и позволяет анализ числовых отношений между иммунной инфильтрата и артериальной микроокружения. FRB составляют 30% общей макрофагов, которые проникли на все слои сосудистой стенки, но интересно, FRB не была найдена в интима и локализованы только в адвентиции и СМИ. Эта закономерность распределения может выявить новые идеи на FRB макрофагов тропизм для композиции дифференциальных коллагена в средствах массовой информации и adventitial слои25. Иммунные инфильтрат состоит из около 60% лимфоцитов (как измеряется Пан лимфоцит маркер анти CD3) и 40% макрофагов (отмечен Пан макрофагального маркер анти CD68). Недавнее исследование коррелирует CD3 с более высокой чувствительностью для диагностики вка, в то время как другой связанный CD68 выражение высшей болезни деятельности. Таким образом мы предлагаем, что раннего ГЦА сосудистой иммунной окружение начинается с соотношении переработке лимфоцитов: макрофагов с 30% макрофагов, будучи FRB положительный. Ли это верно для и неизменно демонстрировал в больных с ранних заболеваний следует далее в будущем проверенных и перспективных экспериментов. Если это распределение клеточного инфильтрата выполняются последовательно, он затем может служить как биомаркер композит для деятельности вка болезни.
В заключение этот протокол продемонстрировал в первый раз присутствие FRB инфильтрации в средствах массовой информации и адвентиции височной артерии в ЗКО. FRB макрофаги представлены около одной трети населения всего макрофагов в раннем и активных ГЦА микроокружения, состоящая из 60% лимфоцитов и 40% макрофагов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа стала возможной благодаря поддержке д-р Дуглас лестницы, Марианна Klinger, Энн Бенко, Отдел ревматологии/Департамента медицины и молекулярной и гистопатологические Core лаборатории, Пенн государственного университета колледж медицины, Херши PA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
