Summary
Protokollen illustrerer brugen af histopatologisk undersøgelse og Immunhistokemi til folat receptor beta makrofag og dens forhold til den samlede immun celle infiltrere i tidsmæssige arterie biopsier i kæmpe celle arteritis-profil.
Abstract
Kæmpe celle arteritis (GCA) er en kronisk immun-medieret sygdom af mellemstore til store mellemstore arterier, der påvirker ældre voksne. GCA manifester med gigt og okklusiv symptomer af hovedpine, slagtilfælde eller vision tab. Makrofager og T-hjælper lymfocytter infiltrere vaskulære væggen og producere en pro-inflammatoriske respons, der fører til fartøj skade og iskæmi. Til dato, er der ingen GCA biomarkør, der kan overvåge sygdom aktivitet og guide terapeutisk respons.
Folat receptor beta (FRB) er et glycosylphosphatidylinositol protein, der er forankret på cellemembraner og normalt udtrykt i myelomonocytic afstamning og i fleste myeloid leukæmiceller så godt som i tumor og reumatoid synovial makrofager, hvor dens udtryk korrelerer med sygdommens sværhedsgrad. FRB evne til at binde folat forbindelser, folinsyre-konjugater og antifolate narkotika har gjort det et druggable mål i kræft og inflammatorisk sygdom forskning. Denne rapport beskriver de histopatologiske og immunhistokemiske metoder anvendt til at vurdere udtryk og distribution af FRB i forhold til GCAimmunopathology.
Formalin-fast og paraffin-embedded tidsmæssige arterie biopsier fra GCA og normal kontrol var plettet med hæmatoxylin og Eosin gennemgå væv histologi og identificere patognomoniske funktioner. Immunhistokemi blev brugt til at registrere FRB, CD68 og CD3 udtryk. En mikroskopisk analyse blev udført for at kvantificere antallet af positivt farvede celler på 10 udvalgte høj-power-felt sektioner og deres respektive placeringer i arterievæggen.
Lymphohistiocytic (LH) inflammation ledsaget af intima hyperplasi og forstyrret elastisk lamina blev set i GCA med ingen fundet i kontrolelementer. LH infiltrere var sammensat af ca 60% lymfocytter og 40% makrofager. FRB udtryk var begrænset til makrofager, bestående af 31% af den samlede CD68 + makrofag befolkning og lokaliseret til de medier og adventitia. Ingen FRB blev set i kontrolelementer.
Denne protokol viste en tydelig numeriske og rumlige mønster af FRB makrofag i forhold til de vaskulære immun mikromiljø i GCA.
Introduction
Kæmpe celle arteritis (GCA) er en inflammatorisk sygdom i mellemstore til store arterier, målretning aorta og dens grene og påvirker ældre voksne. Det præsenterer med mild til svær iskæmiske komplikationer såsom hovedpine, kæbesmerter, synstab, slagtilfælde og væv koldbrand. Diagnosen er bekræftet af høje inflammatoriske markører som blodsænkning (ESR) og en særskilt histopatologisk mønster på den tidsmæssige arterie biopsi (FANE)1. GCA er den mest almindelige voksne vaskulitis, og tilgængeligheden af den tidsmæssige arterie opnået for diagnose præsenterer en fordel over andre vasculopathies, således at en til at studere dens patogenese lettere. De typiske fund på fanen omfatte en infiltrere makrofager/histiocytes og T-lymfocytter, der findes på tværs af alle vaskulære lag af tunica intima, media og adventitia med samtidige ødelæggelse af det elastiske lamina, der normalt adskiller disse rum2. Den nuværende dokumentation viser, GCA indebærer en ukendt antigen, der aktiverer dendritiske celler i det vaskulære adventitia, efterfulgt af ansættelse af hjælper T (Th) celler, specielt Th1 og Th17 undertyper, som udskiller interleukin-17 og interferon-gamma (IFG) henholdsvis. IFG så rekrutter og aktiverer makrofager at producere cytokiner og proteaser. Disse omfatter pro-inflammatoriske cytokiner; herunder IL-12, som gensidigt aktiverer Th1 celler giver dermed en positiv feedback loop; tumor nekrose faktor og interleukin-6, som forårsager gigt og feber og metalloproteases, der skader den elastiske lamina. Glukokortikoider (GC), som udgør den standard kronisk terapi, styre delvist cytokin veje af formildende Th17/IL-17 men ikke Th1/IFG armen af immunrespons3,4. Desværre, seponering af GC resulterer i sygdom tilbagefald. Som en alternativ modalitet, methotrexat har været repurposed GCA behandling, men de ønskede kliniske endepunkter var ikke konsekvent opnået selv om mere følsomme biomarkører ikke har blevet udnyttet for terapeutisk overvågning5,6 . I 2017, blev interleukin 6 blocker, tocilizumab, godkendt til behandling af GCA som det effektivt demonstreret sygdomsbekæmpelse og steroid besparende effekter7,8.
Til dato, er der ingen gode biomarkører for GCA. Som følge heraf er det vanskeligt at overvåge sygdomsaktivitet og titreres doser af tilgængelige lægemidler til at undgå negative virkninger og mindske byrden af omkostninger for samfundet. Det er således bydende nødvendigt at lede efter en kandidat biomarkør, korrelerer med sygdomsaktivitet, giver nye indsigter om patogenese og støtte i terapeutiske beslutninger.
Dysregulering af makrofag aktivering er en kritisk faktor i GCA patogenese. Et effektivt middel til behandling af GCA kan således selektiv målretning af aktiverede makrofager. Folat receptor beta (FRB) er en glycosyl-phosphatidylinositol glykoprotein, der er forankret på cellemembranen udtrykt i normal myelomonocytic celler, myeloid leukæmiceller og aktiverede makrofager. Dets ligand, folinsyre, er et vigtigt vitamin i sin reduceret form, som giver cellulære DNA syntese, methylering og reparation9. FRB udtryk er induceret i autoimmun sygdom og under carcinogenese. Dens udtryk er begrænset til overfladen af monocytter eller pro-inflammatoriske M1 makrofager i reumatoid artritis, eller til anti-inflammatoriske M2 makrofager i solid orgel og myeloide maligniteter10,11,12 , 13. ud over dens potentielle rolle som en biomarkør for aktiverede makrofager, FRB kan aktivere selektive stof transport gennem en multi-trins proces, der starter med receptor binding til folinsyre, antifolates eller folat-konjugeret narkotika på cellen overflade, efterfulgt af internalisering, udgivelse og eventuel levering af ønskede stof til de indre celle maskiner12,14,15,16. I modsætning til FRB udtrykt i kræftceller og aktiverede makrofager, FRB udtrykt i normal hæmatopoietisk celler er i stand til at binde folater, hvorved det sikres, at FRB/folat-medieret medicinafgivelse er begrænset til FRB-positive inflammatoriske eller kræftceller.
I vores tidligere undersøgelse, vi viste for første gang, at FRB udtrykkes i GCA makrofager og sit udtryk korreleret med CD68 + og endothelin receptor beta makrofager, som bidrager til GCA patogenese17. I denne betænkning, vi beskrive den histopatologiske og immunhistokemiske metoder anvendt til at vurdere FRB makrofag, og analyseret den samlede lymfocytter og makrofager tæller for at få indsigt i FRB'S position i GCA vaskulære landskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet blev godkendt af Penn State institutionelle Review Board.
1. histopatologiske forberedelse og behandling efter at have indhentet tidsmæssige arterie biopsi
Bemærk: Den tidsmæssige arterie biopsi (FANE) er udført under lokalbedøvelse og sterile forhold af en certificeret kirurg. Efter kirurgisk opnå en 3 cm arteriel sektion på den mere ramte side, modellen er fastsat i formalin straks for 24 h, opdelt i 3-4 mm sektioner, og indlejret i paraffin, omhyggelig opmærksomhed på den korrekt justering af væv i blokken som derefter opbevares ved stuetemperatur. Modellen udvalg udføres efter kontrol af de medicinske journaler. Diagnosen er baseret på American College of Rheumatology 1990 kriterier, hvilket kræver, at emner opfylde 3 af 5 domæner: alder > 50 år, nye hovedpine, tidsmæssige arterie ømhed, en blodsænkning > 50 mm/time af Westergren metode og en unormal FANE. For sikkerhed, beskyttende handsker skal bæres hele tiden når håndtering af prøver, kemikalier og antistoffer.
- Fra de integrerede blokke, skåret 4-5 µm tykt sektioner ved hjælp af en mikrotom. og plet med hæmatoxylin og Eosin (H & E). Bruge et kontrolafsnit valgte normale væv for kvalitetssikring.
- Float skær sektioner på et bad med varmt vand opvarmet til 40 ° C til at fjerne rynker og afhente med et coatede glas mikroskopiske dias. Placer glas dias på en varm tallerken i en 60 ° C ovnen i 60 minutter for at lette tørring og overholdelse af afsnit af diaset.
- Placer glas dias på en varm tallerken i en 60 ° C ovnen i 60 minutter for at lette tørring og overholdelse af afsnit af diaset.
- Montere 3 sektioner på objektglas.
- Sted dias i en lodret rack og tørre natten over ved 37 ° C i 24 timer.
- Placer dias i en beholder og opbevares ved 4 ° C.
2. immunhistokemiske forberedelse, Dewaxing, Antigen hentning og farvning15,18,19,20
- Indlæse dias i et dias rack. Køre rack gennem retter som følger: to gange i 100% xylen i 5 minutter med 10 sekunders blid agitation hver 30 sekunder, en gang i 100% ethanol med 10 sekunder agitation, engang i 90% ethanol med 10 sekunder agitation, en gang i 70% ethanol med 10 sekunder agitation , og to gange i dobbelt destilleret H2O med 10 sekunder agitation.
Bemærk: Håndtering af xylen og acetone bør ske i ventilerede hætter at undgå indånding og respiratoriske toksicitet. - Hente antigenet ved at overføre rack i en glasbeholder med 200 mL 10 mmol/l, pH 6.0 citratbuffer forvarmet til 95 ° C. Indstil timer til 30 minutter i et vandbad, så cool i stuetemperatur i 20 minutter og derefter skylle med rindende vand i 5 minutter.
- Fjerne endogene peroxidase aktivitet ved at inkubere i 200 mL af 3% brintoverilte i 10 minutter. Vask dias 3 gange i 200 µL af Tris-buffered saltopløsning (TBSS).
- Fjern dias fra rack og ising hver enkelt forsigtigt at tørre overskydende buffer. Til farvning, tilføje 200 µL af de følgende primære antistoffer, tilføje dæksel glider på dias og Inkuber i et fugtkammer i 1 time ved stuetemperatur:
Anti-FRB antistof fortyndet 1:800
Monoklonale mus-anti-humant CD68, 1:200 fortynding
Polyklonale kanin anti-CD3 1: 100 fortynding
Bemærk: Formalin-fast paraffin indstøbte dele af moderkagen blev også behandles som beskrevet i trin 2.1 til 2.9 og rugede med anti-FRB18 og anvendes som positiv kontrol. Farvning resultater blev opnået ved at finde den optimale antistof koncentration og blev udført af tilsætningen antistof i dobbelt fortyndinger (f.eks. 1:50, 1: 100, 1:200, 1: 400, 1:800, 1:1600). - Fjern dækslet slip efter inkubation og kassér. Skyl dias 3 gange for hver 2 minutter med TBSS, afløb og tør overskydende buffer.
- Tilføje 200 µL af sekundær antistof løsning indeholdende biotinylated Rabbit/mus sekundær antistof til at reagere med ukonjugeret primære antistof bundet til væv antigen. Placer coverslips på dias og Inkuber i et fugtkammer i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern dækslet slip efter inkubation og kassér. Skyl dias 3 gange for hver 2 minutter med TBS, afløb og tør overskydende buffer.
- Tilføje 200 µL diaminobenzidine (DAB) + substratbuffer (imidazol HCl)-kromogen system og inkuberes i 10 minutter til at visualisere farvning mønster. Vask med TBSS derefter i rindende vand i 10 minutter.
- Kontrastfarve med hæmatoxylin i 3 minutter.
- Montere diasene ved at anvende 70 µL af montering medium til overfladen af diaset. Langsomt tip coverslip på montering medium og undgå at skabe bobler, som du sænke det på plads. Vent 24 timer at tørre.
3. histopatologisk og immunhistokemiske (IHC) analyse
Undersøge H & E og IHC farvede sektioner fra GCA positive og normal emner ved hjælp af et lysmikroskop.
-
For H & E farves sektioner:
- Vurdere den vaskulære arkitektur og identificere endotelceller i tunica intima, glatte muskelceller i tunica media, og fibroblaster og vasa vasorum i tunica adventitia21,22.
- Identificere GCA funktioner, som omfatter lymfocytter og makrofager/histiocyte infiltration, cellulære hyperplasi og indre elastisk lamina nedbrydning.
- Analysere lymphohistiocytic infiltrere ved at identificere og kvantificere antallet af makrofager i forhold til lymfocytter. Vurdere omfanget af interne elastisk lamina forstyrrelser og hyperplastiske ændringer i bopæl celler og sammenligne med kontrol.
-
IHC farvede sektioner:
- Undersøge farvning mønster af FRB, tager sit udtryk af en bestemt type eller typer af celler og dens fordeling i de vaskulære lag og dens forhold til den samlede immun infiltrere, samlede makrofag markør, anti-CD68 og pan lymfocyt markør anti-CD3.
- Kvantificere udtryk for FRB, CD68 og CD3 celler ved at tælle de positivt farvede celler på 10 flere tilfældigt udvalgte høj effekt felter (hpf) og optage middel.
Bemærk: Identifikation af disse normale og patologiske celler og strukturer blev udført af et certificeret kardiovaskulære patolog (J.M.) og reumatolog (S.A.A.), og resultaterne blev registreret for alle tilfælde. - Fange repræsentative billeder ved hjælp af et digitalt kamera.
Bemærk: Efter disse trin opbevares resterende delprøver ved-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histopatologiske fund
H & E pletter i normale prøver demonstreret normal arteriel anatomi med endotelceller i tunica intima, glatte muskelceller i tunica media, og en heterogene kollagen matrix, der omfatter fibroblaster og feeder fartøjer kaldet vasa vasorum i tunica adventitia. Der er ikke inflammatoriske infiltrere identificeret. GCA positive tidsmæssige arterier viste moderat til svær betændelse med aggregater af makrofager/histiocytes, lymfocytter, lejlighedsvis plasmaceller og multinucleated kæmpe celler. Luminale indsnævring blev noteret og ledsaget af intima fortykkelse og 90% forstyrrelser af de indre elastisk lamina (figur 1).
Immunhistokemiske resultater
CD3 + lymfocytter og makrofager CD68 + var til stede i alle GCA + enheder og viste lignende farvning mønstre i alle biopsier. Lymfocytter dominerede over makrofager med CD3/CD68 forholdet 1,6. Farvning for FRB var begrænset til makrofager og multinucleated kæmpe celler, som fortrinsvis lokaliseret til adventitia og medier (tabel 1 og figur 2). Kontrollere prøver viste minimal leukocytter (< 5 celler/høj-power felt) og ingen FRB udtryk.
Figur 1: H & E billeder af tidsmæssige arterier. (A) repræsentant H & E billede af en normal tidsmæssige arterie med forskellige lag af tunica (t) adventitia, medier og intima fra den yderste til inderste/Luminal side hhv. Bemærk netværket af kollagen og vasa vasorum i adventitia (tykke pile), de glatte muskelceller i medierne (tynd pil) og i endothelial celler i intima (10 x forstørrelse). (B) en udvidet Mikrograf af intima-media interface er fremhævet af den rektangulære indsatser i A og er adskilt af den indre elastisk lamina (pilespidser) (20 x forstørrelse). (C) repræsentant H & E billede af en TA med kæmpe celle arteritis præget af en transmural lymphohistiocytic Infiltrer (tykke pile), intima hyperplasi og ødelæggelse af den interne elastisk lamina (pilespidser) (10 x forstørrelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: immunhistokemisk farvning af tidsmæssige arterier med kæmpe celle arteritis. (A) repræsentative billeder viser en omfattende inflammatoriske infiltrere med CD68 positive makrofager og kæmpe celler (pile) findes for det meste i medier og adventitia (10 x forstørrelse). (B) folat receptor beta (FRB) blev selektivt udtrykt i aktiverede makrofager (pile) (10 x forstørrelse). Billede taget på højere magt demonstrerede FRB positive makrofager i (C) og CD68 positive makrofager i (D) (100 x forstørrelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| GCA fag (n = 5) | Middelværdi (±SD) |
| CD3 (% af immun infiltrere) | 61,7 ± 4.1 |
| CD68 (% af immun infiltrere) | 38.3 ± 4.1 |
| CD68 histiocytes/makrofager (celler/hpf) | 34,8 ± 10.4 |
| FRB + makrofager (celler/.hpf) | 10,8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12,7 |
Tabel 1: Oversigt over FRB, CD68 og CD3 udtryk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GCA er den mest almindelige vaskulitis hos voksne, og dens patologiske hallmark eksemplificerer en potent kombination af T helper lymfocytter og aktiveret makrofager, der kan også findes i andre granulomatøs sygdomme eller vasculopathies som sarcoidose og granulomatøs polyangiitis2,3. I GCA, den tidsmæssige arterie giver en god repræsentation af en medium til large størrelse arterie og TA biopsi giver en betragtelig stikprøve, der kan gemmes i paraffinblokke for år, således at der skabes muligheder for at studere de roller af nye diagnostiske og terapeutiske mål som FRB i den vaskulitisk mikromiljø. Vi benyttede, præsenteret af tilgængeligt væv og standard immunopathologic metoder til at spørge om FRB pålideligt kan analyseres via IHC. Vores resultater viser, at histopatologi og IHC kan tjene som værdifulde værktøjer ikke kun bekræfte diagnosen og omfanget af vaskulære skader, men også i validering af forskellige makrofag undertyper i GCA rolle.
Histopatologisk undersøgelse og IHC metoder er begge arbejde intensivt og kræver færdigheder histokemiske tekniker, patolog og reumatolog, men teknikkerne har været veletablerede og kan tjene som affyringsrampe for at bruge andre metoder såsom immunfluorescens og flow flowcytometri. Ulempen ved disse metoder er imidlertid behovet for frisk frosset væv, som kræver en prospektiv indsamling. IHC, sammen med histopatologisk undersøgelse, er uvurderlig i præsenterer et panorama perspektiv af det vaskulære immun mikromiljø, der gentagne gange kan tilgås og analyseret specielt med fremkomsten af nye proteiner som FRB. Hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning gør det muligt for en at gennemgå væv histologi. Hæmatoxylin pletter kernen og fremhæver de nukleare detaljer mens eosin fungerer som en kontrastfarve, som hjælper ved at påvise forskellene mellem de nukleare og cytoplasmatisk funktioner. Brugen af et kontrolafsnit valgte normale væv er væsentligt at evaluere for kvalitetssikring.
IHC registrerer antigen af interesse i frossen eller formalin-fast og paraffin-embedded væv ved hjælp af flere antistoffer, der er visualiseret ved mikroskopi. Protokollen beskrev blev tilpasset fra van der Heijden et al.15, som demonstrerede FRB udtryk i synovial makrofager i reumatoid arthritis. De væsentlige IHC skridt omfatter væv forberedelse, dewaxing/deparaffinization, antigen hentning og farvning23. Det er vigtigt at sikre, at væv fjernes fra patienten umiddelbart faste i formalin og væv justering og retning omhyggeligt bevaret når fast i paraffin. Vævet er tyndt snit med brug af en mikrotom og gennemgår en dewaxing skridt, der kræver flere vasker i xylen, ethanol og vand. Det næste skridt, kaldet antigen hentning, er nødvendig for at nedbryde methylen forbindelser der dannes under formalin fiksering og kræver en citrat-baseret buffer og fugtig varme. Diasene er behandlet med brintoverilte til at blokere endogent peroxidase enzymer, der kan forstyrre antigen påvisning. Farvning proceduren udføres næste ved at inkubere dias med fortyndet primære antistoffer, der binder antigen af interesse fulgt ved at anvende en sekundær antistof, som vil afsløre primær antigen-antistof-reaktion. Dette er efterfulgt af mærkning med en kromogen DAB-substrat, som danner en brun pigment, der er visualiseret under mikroskop. Det sidste trin er omhyggelig med montering af væv med en permanent løsning, og sørg for, at ingen interfererende stoffer som bobler er dannet mellem cover slip og overflade. Protokollen kræver ændringer til at rumme brugen af arteriel væv. Da undersøgelsen var først til at evaluere FRB i GCA, optimal antistof koncentration var ukendt og behov for flere fortyndinger på 1:50 1: 100, 1:200, 1: 400, 1:800, 1:1, 600, 1:3200 med de bedste farvning kvalitet ved den laveste baggrundsstøj eller signal opnået på 1:800.
Membran-associerede FRB var tidligere godkendt af Ross et al.18,24 og fandtes at være udtrykt i normal placenta celler, neutrofiler, leukemic eksplosionerne i kronisk myeloid leukæmi, promyelocyt leukæmi, myeloblast populationer af myelomonocytic og erythroleukemias og trinløst i M1/M2 akut myeloid leukæmi. Affinitet-renset kanin polyklonale antistoffer specifikke for FRB bruges i disse tidligere værker er siden blevet anvendt til undersøgelser af leddegigt positive synovial makrofager og solid orgel tumorer. FRB antistof bruges i denne protokol er ikke kommercielt tilgængelig og kan hindre bred anvendelse. Tænkes, den metode der beskrives her kan også arbejde for andre FRB antistoffer men vil kræve individuelle optimering før dets anvendelse i større tal. Eftersom FRB udtrykkes betydeligt i moderkagen, der dette væv gentagne gange blevet brugt som en positiv kontrol.
Undersøgelse design var begrænset af en lille stikprøvestørrelse og kræver validering i større antal faner ideelt indhentet på tidlige og sene stadier af GCA. Derudover da FRB makrofag kan tjene som et potentielt diagnostiske og terapeutiske mål med folinsyre konjugeret agenter og antifolates, støtter oplysninger indhentet her behovet for yderligere at undersøge FRB fænotype i forbindelse med M1 og M2 makrofag polarisering. Med hensyn til andre diagnostik konjugeret disse resultater åbne muligheder for non-invasiv billeddiagnostik tilgange med FRB rettet folsyre SPECT af PET imaging agenter. Derudover makrofag infiltration er kendetegnende for sygdomsprogression og aktivitet i åreforkalkning, sklerodermi, sarcoidose og reumatoid arthritis, kan anvendelse af denne protokol finde programmer i disse betingelser.
Dette er den første protokol til at udforske de udtryk og distribution af FRB i GCA. IHC tilladt en panoramisk tværsnits- og flere visninger af TA og giver mulighed for analyse af de numeriske relationer mellem den immun infiltrere og den arterielle mikromiljø. FRB bestod af 30% af de samlede makrofager, at infiltreret alle lag af vaskulære væggen, men interessant, FRB blev ikke fundet i intima og lokaliseret kun til adventitia og medier. Dette mønster af distribution kan afsløre nye indsigter på FRB makrofag tropisme for differentierede kollagen sammensætning fundet i medier og adventitial lag25. Den immun infiltrere bestod af ca. 60% lymfocytter (som målt ved pan-lymfocyt markør anti-CD3) og 40% makrofager (markeret med pan-makrofag markør anti-CD68). En nylig undersøgelse korreleret CD3 med en højere følsomhed for GCA diagnose, mens en anden i forbindelse med CD68 udtrykket højere sygdomsaktivitet. Således foreslår vi, at den tidlige GCA vaskulære immun milieu starter med forholdet 60: 40 af lymfocytter: makrofager med 30% af makrofager bliver FRB positive. Hvorvidt dette gælder for og konsekvent påvist hos patienter med tidlig sygdom bør yderligere valideret i fremtiden og fremtidige eksperimenter. Hvis denne cellulære infiltrere distribution holder konsekvent, kan det så tjene som biomarkør sammensat for GCA sygdomsaktivitet.
Afslutningsvis demonstrerede denne protokol for første gang tilstedeværelsen af FRB infiltration i medierne og adventitia af tidsmæssige arterier i GCA. FRB makrofager repræsenteret omkring en tredjedel af den samlede makrofag befolkning i en tidlig og aktiv GCA mikromiljø består af 60% lymfocytter og 40% makrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev muliggjort med støtte fra Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, Division for reumatologi/Institut for medicin og molekylær og histopatologisk Core laboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
