Summary
Il protocollo viene illustrato l'utilizzo dell'esame istopatologico e immunohistochemistry al profilo il macrofago di folato recettore beta e il suo rapporto con il totale delle cellule immuni infiltrarsi in biopsie temporali dell'arteria in arteritis gigante delle cellule.
Abstract
Arteritis gigante delle cellule (GCA) è un'immuno-mediata malattia cronica delle arterie di dimensioni medio-grandi che colpisce gli adulti più anziani. GCA manifesti con artrite e occlusivi sintomi di mal di testa, colpo o perdita della vista. Macrofagi e linfociti T-helper infiltrano nella parete vascolare e producono una risposta pro-infiammatoria che conducono a danno del vaso e ischemia. Ad oggi, non c'è nessun biomarcatore di GCA che può controllare la malattia attività e guida risposta terapeutica.
Folato del recettore beta (FRB) è una proteina di glicosilfosfatidilinositolo che è ancorata sulle membrane cellulari e normalmente espressi nella stirpe myelomonocytic e nella maggior parte delle cellule di leucemia mieloide pure come nel tumore e macrofagi sinoviali reumatoidi, dove la sua espressione correla con la severità di malattia. La capacità di associare composti di folati, acido folico-coniugati e droghe antifolati FRB ha reso una destinazione trattabili in cancro e la malattia infiammatoria ricerca. Questo rapporto descrive i metodi istopatologici e immunohistochemical, utilizzati per valutare l'espressione e la distribuzione di FRB in relazione GCAimmunopathology.
Le biopsie dell'arteria temporale formalina-fisso e paraffina-incastonati da GCA e comandi normali erano macchiate con ematossilina ed eosina per rivedere l'istologia del tessuto e identificare caratteristiche patognomoniche. Immunohistochemistry è stato usato per rilevare l'espressione FRB, CD68 e CD3. Stata effettuata un'analisi microscopica per quantificare il numero di celle positivamente macchiate in 10 sezioni selezionate di high-power-campo e nelle rispettive posizioni nella parete arteriosa.
L'infiammazione lymphohistiocytic (LH) accompagnato da iperplasia intimale e perturbata lamina elastica è stata veduta nel GCA con nessuno trovato nei controlli. L'infiltrazione di LH era composta di circa il 60% di linfociti e il 40% di macrofagi. Espressione di FRB era limitata ai macrofagi, che comprende il 31% della popolazione di macrofagi CD68 + totale e localizzato ai media e avventizia. Nessun FRB è stato visto nei controlli.
Questo protocollo ha dimostrato un modello distinto di numerico e spaziale del macrofago FRB rispetto al microambiente immune vascolare nel GCA.
Introduction
Arteritis gigante delle cellule (GCA) è una malattia infiammatoria delle medio-grandi arterie, l'aorta ed i relativi rami di targeting e che interessa gli adulti più anziani. Si presenta con lievi a gravi complicanze ischemiche quali mal di testa, perdita della vista, dolore alla mascella, gangrene del colpo e del tessuto. La diagnosi è confermata dall'alti indicatori infiammatori come tasso di sedimentazione dell'eritrocito (ESR) e un modello istopatologico distinto sull'arteria temporale biopsia (scheda)1. GCA è la più comune vasculite adulta, e l'accessibilità dell'arteria temporale ottenuta per diagnosi presenta un vantaggio rispetto altre vasculopatie, così permettendo ad uno di studiare la relativa patogenesi più prontamente. I risultati tipici nella scheda includono un'infiltrazione dei macrofagi/istiociti e linfociti T trovati attraverso tutti gli strati vascolari della tonaca intima, media e avventizia con concomitante distruzione della lamina elastica che normalmente separa questi vani2. L'evidenza attuale dimostra che GCA comporta un antigene sconosciuto che attiva le cellule dendritiche nel adventitia vascolare, seguita dall'assunzione di helper cellule di T (Th), in particolare Th1 e Th17 sottotipi che secernono interleuchina-17 e interferone-gamma (IFG) rispettivamente. IFG poi recluta e attiva i macrofagi a produrre citochine e proteasi. Questi includono le citochine pro-infiammatorie; compreso IL-12, che reciprocamente si attiva le cellule Th1, fornendo così un ciclo di feedback positivo; fattore di necrosi tumorale e l'interleuchina-6, che causano artrite e febbri e metalloproteasi che danneggiare la lamina elastica. I glucocorticoidi (GC), che costituiscono la terapia cronica standard, controllano parzialmente le vie di citochina attenuando Th17/IL-17, ma non il braccio Th1/IFG di risposta immunitaria3,4. Purtroppo, l'interruzione del GC provoca in ricaduta di malattia. Come modalità alternativa, metotrexato è stato reimpiegato per trattamento di GCA, ma il desiderato endpoint clinici non sono stati raggiunti costantemente anche se biomarcatori più sensibili non sono stati utilizzati per il monitoraggio terapeutico5,6 . Nel 2017, il blocco di interleuchina 6, tocilizumab, è stato approvato per il trattamento del GCA quanto dimostrato efficacemente il controllo delle malattie e con parsimonia effetti7,8steroide.
Fin qui, non ci sono nessun buoni biomarcatori per GCA. Di conseguenza, è difficile monitorare l'attività di malattia e titolare di dosi di farmaci disponibili per evitare gli effetti negativi e ridurre l'onere del costo per la società. Pertanto, è imperativo per cercare un biomarcatore di candidato che correla con attività di malattia, fornire nuove conoscenze sulla patogenesi e l'aiuto nelle decisioni terapeutiche.
La disregolazione dell'attivazione macrofagica è un fattore critico nella patogenesi di GCA. Quindi, un mezzo efficace di trattare GCA può essere il targeting selettivo dei macrofagi attivati. La versione beta del recettore di folato (FRB) è una glicoproteina di glicosil fosfatidilinositolo che è ancorata sulla membrana cellulare espressa in cellule myelomonocytic normale, le cellule di leucemia mieloide e macrofagi attivati. Suo ligando, acido folico, è una vitamina essenziale nella sua forma ridotta, che consente la sintesi, la metilazione e la riparazione del DNA cellulare9. FRB espressione è indotta nella malattia autoimmune e durante la carcinogenesi. La sua espressione è limitata alla superficie dei monociti o pro-infiammatorie M1 macrofagi nell'artrite reumatoide, o a antinfiammatori M2 macrofagi in organo solido e neoplasie mieloidi10,11,12 , 13. oltre al suo ruolo potenziale come biomarcatore di macrofagi attivati, FRB può abilitare il trasporto del farmaco selettivo attraverso un processo a più fasi che inizia con l'associazione del recettore per l'acido folico, antifolici o folato-coniugati di droga dalla cella superficie, seguita da interiorizzazione, rilascio e consegna eventuale di farmaco desiderata per l'interno cella macchinari12,14,15,16. A differenza di FRB espressi su cellule tumorali e macrofagi attivati, FRB espresso in cellule emopoietiche normali è in grado di associare i folati assicurando che FRB/folato-ha mediato la consegna della droga è limitata a FRB-positiva infiammatoria o cellule tumorali.
Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato per la prima volta che FRB è espresso nei macrofagi GCA e sua espressione correlata con CD68 + ed endotelina macrofagi beta del recettore, che contribuiscono alla patogenesi di GCA17. In questo rapporto, descriviamo l'istopatologico e immunohistochemical metodi utilizzati per valutare il macrofago FRB e analizzato il totale dei linfociti e macrofago conta per guadagnare la comprensione nella posizione di FRB nel paesaggio vascolare GCA.
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Protocol
Tutti i metodi descritti sono stati approvati da Penn State Institutional Review Board.
1. istopatologico preparazione ed elaborazione previa biopsia dell'arteria temporale
Nota: La biopsia dell'arteria temporale (scheda) viene eseguita in anestesia locale e condizioni sterili di un chirurgo certificato. Dopo aver ottenuto chirurgicamente una sezione arteriosa di 3 cm dal lato più commovente, l'esemplare è fissato in formalina immediatamente per 24 h, diviso in sezioni da 3 a 4 mm e inclusi in paraffina, prestando molta attenzione all'allineamento corretto del tessuto nel blocco che allora è conservato a temperatura ambiente. Selezione del campione viene eseguita dopo aver verificato la documentazione medica. La diagnosi si basa sull'American College of Rheumatology 1990 criteri che richiede che i soggetti compiono 3 di 5 domini: età > 50 anni, nuova cefalea, tenerezza dell'arteria temporale, un tasso di sedimentazione dell'eritrocito > 50 mm/ora dal metodo Westergren e una scheda anormale. Per sicurezza, guanti di protezione devono essere indossati in ogni momento nel maneggiare i campioni, prodotti chimici e gli anticorpi.
- Dai blocchi incorporati, tagliare sezioni spesse 4-5 µm, utilizzando un microtomo. e macchia con ematossilina ed eosina (H & E). Utilizzare una sezione di controllo del tessuto normale selezionato per garantire la qualità.
- Galleggiante di tagliare sezioni su un bagno di acqua calda riscaldata a 40 ° C per rimuovere le grinze e pick up con una diapositiva microscopica di vetro rivestito. Posizionare i vetrini su una piastra calda in forno a 60 ° C per 60 minuti per facilitare l'asciugatura e l'aderenza della sezione alla diapositiva.
- Posizionare i vetrini su una piastra calda in forno a 60 ° C per 60 minuti per facilitare l'asciugatura e l'aderenza della sezione alla diapositiva.
- Montare 3 sezioni su vetrini da microscopio.
- Mettere i vetrini in un rack verticale e asciugare durante la notte a 37 ° C per 24 h.
- Mettere i vetrini in un contenitore e conservare a 4 ° C.
2. Immunohistochemical preparazione, deparaffinazione, ricupero dell'antigene e la macchiatura15,18,19,20
- Caricare diapositive in un portavetrini. Eseguire il rack attraverso piatti come segue: due volte in xilene 100% per 5 minuti con 10 secondi di agitazione delicata ogni 30 secondi, una volta in etanolo al 100% con agitazione di 10 secondi, una volta in etanolo al 90% con agitazione di 10 secondi, una volta in etanolo al 70% con agitazione di 10 secondi , e due volte nel doppio distillata H2O con agitazione di 10 secondi.
Nota: Gestione di acetone e xilene deve essere eseguita in cappucci ventilati per evitare l'inalazione e tossicità respiratoria. - Recuperare l'antigene trasferendo il rack in un contenitore di vetro con 200 mL di 10 mmol/L, tampone a pH 6.0 citrato preriscaldata a 95 ° C. Impostare il timer per 30 minuti a bagnomaria, poi raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti, poi sciacquare con acqua corrente per 5 minuti.
- Rimuovere attività perossidasica endogena incubando in 200 mL di perossido di idrogeno 3% per 10 minuti. Lavare i vetrini 3 volte in 200 µ l di soluzione salina tamponata (TBSS).
- Rimuovere le diapositive dal rack e tamponare ciascuno delicatamente per strofinare il tampone in eccesso. Per la colorazione, aggiungere 200 µ l dei seguenti anticorpi primari, aggiungere vetrini su vetrini e incubare in camera umida a temperatura ambiente per 1 ora:
Anticorpo anti-FRB diluito 1: 800
Monoclonale murino anti-umano CD68, diluizione 1: 200
Diluizione 1: 100 di policlonale di coniglio anti-CD3
Nota: Sezioni di paraffina-incastonato formalina-fisso della placenta sono stati anche trattati come descritto nella procedura 2.1 a 2,9 e incubate con anti-FRB18 e utilizzati come controllo positivo. Risultati della colorazione sono state ottenute trovando la concentrazione ottimale dell'anticorpo ed interpretata dalla titolazione l'anticorpo in diluizioni doppie (es. 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1:1600). - Rimuovere coprioggetto dopo incubazione e scartare. Sciacquare i vetrini 3 volte per 2 minuti ciascuno con TBSS, svuotare e pulire il tampone in eccesso.
- Aggiungere 200 µ l di soluzione di anticorpo secondario contenente anticorpo secondario biotinilato Anti-coniugato/Mouse per reagire con l'anticorpo primario non coniugata legata all'antigene del tessuto. Posizionare le lamelle su diapositive e incubare in camera umida per 45 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere coprioggetto dopo incubazione e scartare. Sciacquare i vetrini 3 volte per 2 minuti ciascuno con TBS, svuotare e pulire il tampone in eccesso.
- Aggiungere 200 µ l di diaminobenzidina (DAB) + tampone substrato (imidazolo HCl)-sistema cromogeno e incubare per 10 minuti per visualizzare il modello di macchiatura. Lavare con TBSS poi in acqua corrente per 10 minuti.
- Colorante di contrasto con ematossilina per 3 minuti.
- Montare le diapositive applicando 70 µ l di soluzione di montaggio sulla superficie del vetrino. Lentamente il suggerimento per il coprioggetto sul supporto di montaggio ed evitare la creazione di bolle e verso il basso in posizione. Attendere 24 ore per asciugare.
3. istopatologico e analisi immunoistochimica (IHC)
Esaminare la H & E e IHC macchiato sezioni da soggetti di GCA positivi e normale utilizzando un microscopio ottico.
-
Per la H & E sezioni colorate:
- Valutare l'architettura vascolare e identificare le cellule endoteliali in tonaca intima, cellule di muscolo liscio nel mezzi di tunica e fibroblasti e vasa vasorum della tunica avventizia21,22.
- Identificare le caratteristiche di GCA, che comprendono dei linfociti e l'infiltrazione del macrofago/del histiocyte, iperplasia cellulare e la degradazione di lamina elastica interna.
- Analizzare l'infiltrazione lymphohistiocytic per identificare e quantificare il numero di macrofagi rispetto i linfociti. Valutare l'entità della rottura della lamina elastica interna e iperplastiche nella cellule residenti e confrontare con i controlli.
-
Per l'IHC sezioni colorate:
- Esaminare il modello di macchiatura di FRB, prendendo atto della sua espressione di un determinato tipo o tipi di cellule e la sua distribuzione all'interno degli strati vascolari e la sua relazione per l'infiltrazione totale immune, l'indicatore del macrofago totale, anti-CD68 e la padella marcatore del linfocita anti CD3.
- Quantificare l'espressione delle cellule FRB, CD68 e CD3 contando le cellule marcate positivamente il 10 più campi selezionati in modo casuale ad alta potenza (hpf) e registrare i mezzi.
Nota: Identificazione di queste cellule normali e patologiche e le strutture sono state eseguite da un patologo cardiovascolare certificato (J.M.) e reumatologo (SAA) e i risultati sono stati registrati per tutti i casi. - Catturare immagini rappresentative utilizzando una fotocamera digitale.
Nota: Dopo questi passaggi, i restanti aliquote possono essere conservati a-80 ° C.
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Representative Results
Risultati istopatologici
La H & E macchie in anatomia arteriosa normale dimostrata di esemplari normali con le cellule endoteliali in tonaca intima, cellule di muscolo liscio nella tunica media, e una matrice di collagene eterogenea che fibroblasti e vasi dell'alimentatore sono chiamati vasa vasorum nel adventitia di tunica. Non c'è nessun infiltrato infiammatorio identificato. Arterie temporali positive GCA ha dimostrato da moderata a grave infiammazione con i complessi dei macrofagi/istiociti, linfociti, occasionali cellule di plasma e cellule giganti multinucleate. Lo stringimento luminal è stato notato e accompagnato da rottura intimal di ispessimento e il 90% della lamina elastica interna (Figura 1).
Risultati immunohistochemical
Linfociti CD3 + e macrofagi CD68 + erano presenti in tutti gli esemplari GCA + e dimostrato pattern di colorazione simile in tutte le biopsie. I linfociti hanno predominato sopra macrofagi con un rapporto di CD3/CD68 di 1.6. Macchiando per FRB era limitato ai macrofagi e cellule giganti multinucleate che preferenzialmente localizzato al adventitia e media (tabella 1 e Figura 2). Controllare gli esemplari ha mostrati la minimi leucociti (< 5 campo di cellule/high-power) e nessuna espressione di FRB.
Figura 1: H & E immagini delle arterie temporali. (A) rappresentante H & E immagine di un'arteria temporale normale con strati distinti il adventitia di tunica (t), la media e la biancheria intima dalla più esterna alla più interna/Luminal lato rispettivamente. Si noti la rete di collagene e vasa vasorum nel adventitia (frecce spesse), le cellule di muscolo liscio nei media (frecce sottili) e le cellule endoteliali nel intima (ingrandimento 10x). (B) un Micrografo allargato dell'interfaccia di intima-media è evidenziato dall'inserto rettangolare nella A ed è separato da lamina elastica interna (frecce) (20 ingrandimenti). Immagine (C) rappresentante H & E di un TA con il arteritis gigante delle cellule contrassegnato da un transmurale lymphohistiocytic si infiltra in (frecce spesse), iperplasia intimale e distruzione della lamina elastica interna (frecce) (ingrandimento 10x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: la macchiatura di Immunohistochemical delle arterie temporali con il arteritis gigante delle cellule. Immagini rappresentative (A) dimostrano un esteso infiltrato infiammatorio con CD68 positivi macrofagi e cellule giganti (frecce) trovato principalmente nei media e nel adventitia (ingrandimento 10x). (B) ricevitore beta folato (FRB) è stata espressa selettivamente in macrofagi attivati (frecce) (ingrandimento 10x). Immagine presa a livello di potenza ha dimostrato FRB macrofagi positivi in (C) e (D) i macrofagi positivi CD68 (ingrandimento 100 x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soggetti GCA (n = 5) | Media (± DS) |
| CD3 (% del sistema immunitario si infiltrano in) | 61,7 ± 4.1 |
| CD68 (% del sistema immunitario si infiltrano in) | 38,3 ± 4.1 |
| I histiocytes di CD68/macrofagi (cellule/hpf) | 34,8 ± 10,4 |
| FRB + macrofagi (cellule /. HPF) | 10.8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12,7 |
Tabella 1: Sintesi di espressione FRB, CD68 e CD3.
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Discussion
GCA è la vasculite più comune negli adulti, e relativo marchio di garanzia patologico esemplifica una potente combinazione di linfociti T helper e macrofagi che possono essere trovati anche in altre malattie granulomatose o vasculopatie come sarcoidosi attivati e granulomatosa polyangiitis2,3. Nel GCA, l'arteria temporale fornisce una buona rappresentazione di un'arteria di dimensione medio-grandi e la biopsia TA dà un esempio considerevole che possa essere memorizzato in blocchi di paraffina per anni, creando così opportunità di studiare i ruoli delle emergenti diagnostici e bersagli terapeutici come FRB nel microambiente vasculitic. Abbiamo preso il vantaggio presentato dal tessuto accessibile e immunopathologic standard metodi di chiedere se la FRB possono essere analizzati in modo affidabile attraverso IHC. I nostri risultati dimostrano che l'istopatologia e IHC possono servire come strumenti utili non solo a confermare la diagnosi e l'entità del danno vascolare, ma anche nella convalida il ruolo dei sottotipi differenti del macrofago nel GCA.
L'istopatologia ed i metodi IHC sono entrambi lavoro intensivo e richiede l'abilità del tecnico di istochimica, patologo e reumatologo, ma le tecniche sono state ben stabilite e possono servire come un trampolino di lancio per l'utilizzo di altri metodi come citometria a flusso e immunofluorescenza. Lo svantaggio di tali metodi, tuttavia, è la necessità di tessuto congelato fresco che richiede la raccolta di potenziale. IHC, insieme con l'esame istopatologico, è prezioso per presentare una prospettiva panoramica del microambiente immune vascolare che possa essere consultato e analizzato ripetutamente soprattutto con l'emergere di nuove proteine come la FRB. L'ematossilina ed eosina (H & E) colorazione permette di rivedere l'istologia del tessuto. Ematossilina macchie il nucleo e mette in evidenza i dettagli nucleari mentre eosina serve come un colorante di contrasto che aiuta a dimostrare le differenze tra le caratteristiche nucleari e citoplasmatiche. L'uso di una sezione di controllo del tessuto normale selezionato è essenziale per valutare la garanzia della qualità.
L'IHC rileva l'antigene di interesse in tessuti congelati o formalina-fisso e paraffina-incastonati attraverso l'uso di anticorpi multipli che vengono visualizzati da microscopia. Il protocollo descritto è stato adattato da van der Heijden et al.15, che ha dimostrato l'espressione FRB in macrofagi sinoviali nell'artrite reumatoide. Preparazione dei tessuti, deparaffinazione/Sparaffinatura, ricupero dell'antigene e la macchiatura23includono i passaggi essenziali di IHC. È essenziale per garantire che il tessuto rimosso dal paziente immediatamente è fissato in formalina e tessuto allineamento e l'orientamento meticolosamente conservato quando fissa in paraffina. Il tessuto è sottilmente sezionato con l'uso di un microtomo e subisce un passaggio di deparaffinazione che richiede diversi lavaggi in acqua, etanolo e xilene. Il passo successivo, chiamato ricupero dell'antigene, è necessaria per abbattere i legami metilene formati durante la fissazione in formalina e richiede un buffer basato su citrato e calore umido. Le diapositive sono trattate con perossido di idrogeno per bloccare gli enzimi perossidasi endogena che possono interferire con la rilevazione dell'antigene. La procedura di colorazione successiva viene eseguita incubando le diapositive con gli anticorpi primari diluiti che legano l'antigene di interesse seguita applicando un anticorpo secondario che rileverà la reazione antigene-anticorpo primario. Questo è seguito dall'etichettatura con un cromogeno DAB-substrato che forma un pigmento marrone che è visualizzato sotto il microscopio. Il passo finale è il montaggio accurato del tessuto con una soluzione permanente, assicurandosi che nessun sostanze interferenti come bolle si formano tra il vetrino coprioggetto e superficie. Il protocollo richiesto modifiche per accogliere l'uso del tessuto arterioso. Poiché lo studio era il primo per valutare FRB nel GCA, la concentrazione di anticorpi ottimale era sconosciuta e necessarie diluizioni multiple alle 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400 e 1: 800, 1:1, 600, 1:3200 con la migliore qualità al più basso rumore di fondo o segnale di colorazione realizzati a 1: 800.
Il FRB membrana-collegato in precedenza è stato convalidato da Ross et al.18,24 ed è stato trovato per essere espresso in cellule placentare normali, i neutrofili, gli scoppi leucemici nella leucemia mieloide cronica, leucemia promyelocytic, popolazioni di myeloblast di myelomonocytic ed erythroleukemias e variabile nella leucemia myelogenous acuta M1/M2. L'anticorpo policlonale di coniglio purificato per affinità specifica per FRB utilizzato in queste opere precedenti da allora sono state applicate agli studi di artrite reumatoide positivo macrofagi sinoviali e tumori solidi dell'organo. L'anticorpo di FRB utilizzata nel presente protocollo non è commercialmente disponibile e potrebbe impedire di vasta applicazione. In teoria, la metodologia descritta qui può funzionare anche per altri anticorpi FRB ma richiederà ottimizzazione individuale prima del suo utilizzo in un gran numero. Poiché FRB è espresso in modo significativo nella placenta, questo tessuto è stato più volte utilizzato come controllo positivo.
Il disegno dello studio è stato limitato da un campione di piccole dimensioni e richiede la convalida in un gran numero di schede idealmente ottenuti nella fase precoce e tardiva del GCA. Inoltre, poiché il macrofago FRB può servire come un potenziale bersaglio terapeutico e diagnostico con agenti coniugati folico e antifolici, i dati ottenuti qui sostiene la necessità di esaminare ulteriormente fenotipo FRB nel contesto del macrofago M1 e M2 polarizzazione. Per quanto riguarda altri sistemi diagnostici, questi risultati opportunità aperte per approcci di imaging non invasivo con acido folico FRB mirati coniugato SPECT di PET imaging agenti. Inoltre, dato che l'infiltrazione del macrofago è un segno distintivo di progressione di malattia e di attività nell'aterosclerosi, sclerodermia, sarcoidosi e l'artrite reumatoide, l'uso di questo protocollo può trovare applicazioni in queste condizioni.
Questo è il primo protocollo per esplorare l'espressione e la distribuzione di FRB nel GCA. L'IHC consentito una panoramica più visualizzazioni di TA e trasversali e permette di analizzare i rapporti numerici tra il sistema immunitario si infiltra in ed il microambiente arterioso. Il FRB comprende 30% dei macrofagi totali che infiltrato in tutti gli strati della parete vascolare, ma è interessante notare che, il FRB non è stato trovato nel intima e localizzato solo a adventitia e media. Questo modello di distribuzione può rivelare nuove conoscenze sul trofismo del macrofago FRB per la composizione di collagene differenziale trovata nei media e strati adventitial25. Il sistema immunitario si infiltra in è composta da circa 60% di linfociti (come misurato tramite il pan-linfocita marcatore anti-CD3) e 40% macrofagi (contrassegnati dal pan-macrofago indicatore anti-CD68). Un recente studio correlato CD3 con una maggiore sensibilità per la diagnosi del GCA, mentre un altro collegato attività malattia più alta espressione di CD68. Quindi, proponiamo che l'ambiente immune vascolare precoce di GCA inizia con un rapporto di 60: 40 dei linfociti: macrofagi con il 30% dei macrofagi essendo FRB positivo. Se questo vale per e costantemente dimostrato in pazienti con la malattia precoce dovrebbe essere ulteriormente validati in futuro e futuri esperimenti. Se questa distribuzione cellulare si infiltrano in tiene costantemente, quindi può servire come composito biomarcatore per attività di malattia di GCA.
In conclusione, questo protocollo ha dimostrato per la prima volta la presenza di infiltrazione di FRB nei media e avventizia delle arterie temporali nel GCA. Macrofagi FRB rappresentati circa un terzo della popolazione totale del macrofago in dei primi e microambiente di GCA attivo composto di macrofagi di linfociti e il 40% di 60%.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato reso possibile dal supporto del Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, il divisione di reumatologia/dipartimento di medicina e molecolare e istopatologici Core laboratorio, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
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