Summary
Protokollet illustrerar användningen av histopatologisk undersökning och immunohistokemi till Profil folat receptor beta makrofag och dess förhållande till den totala immunceller infiltrera i temporala artären biopsier i jätte cell arterit.
Abstract
Jätte cell arterit (GCA) är en kronisk immunmedierad sjukdom av medelstora till stora medelstora artärer som drabbar äldre vuxna. GCA godsspecifikationer med artrit och ocklusiva symptom på huvudvärk, stroke eller synförlust. Makrofager och T-hjälparceller lymfocyter infiltrera kärlväggen och producerar proinflammatoriska svar som leder till kärlskada och ischemi. Hittills finns det ingen GCA biomarkör som kan övervaka sjukdomen aktivitet och guide terapeutiskt svar.
Folat receptor beta (FRB) är ett glycosylphosphatidylinositol protein som är förankrade på cellmembran och normalt uttryckt i myelomonocytär härstamning och majoriteten av myeloisk leukemiceller samt i tumören och reumatoid synovial makrofager, där dess uttryck korrelerar med sjukdomens svårighetsgrad. FRB förmåga att binda folat föreningar, folsyra-konjugat och antifolate droger har gjort det ett druggable mål i cancer och inflammatorisk Sjukdomforskning. Rapporten beskriver de histopatologiska och immunohistokemiska metoder att bedöma uttryck och distribution av FRB i förhållande till GCAimmunopathology.
Formalin-fasta och paraffin-inbäddat temporala artären biopsier från GCA och normala kontroller var färgas med Hematoxylin och Eosin att granska vävnad histologi och identifiera patognomona funktioner. Immunohistokemi användes för att upptäcka FRB, CD68 och CD3 uttryck. En mikroskopisk analys utfördes för att kvantifiera antalet positivt färgade celler på 10 markerade hög-High-Power-fältet avsnitt och sina respektive platser i kärlväggen.
Lymphohistiocytic (LH) inflammation åtföljs av intimans hyperplasi och störd elastisk lamina sågs i GCA med ingen hittades i kontroller. Den LH infiltrera bestod av cirka 60% lymfocyter och 40% makrofager. FRB uttrycket var begränsad till makrofager, bestående av 31% av den totala CD68 + makrofag befolkningen och lokaliserad till media och adventitia. Ingen FRB sågs hos kontrollerna.
Detta protokoll visat ett distinkt numeriskt och rumsliga mönster av FRB makrofager i förhållande till den vaskulära immun närmiljön i GCA.
Introduction
Jätte cell arterit (GCA) är en inflammatorisk sjukdom av medelstora till stora artärer, inriktning aorta och dess grenar och påverkar äldre vuxna. Den presenterar med mild till svår ischemisk komplikationer såsom stroke och vävnad kallbrand, synförlust, käken smärta, huvudvärk. Diagnosen bekräftas av höga inflammatoriska markörer som erytrocyt sänkan (ESR) och en distinkt histopatologiska mönstret på tidsmässiga artär biopsi (fliken)1. GCA är den vanligaste vuxen vaskulit och tillgängligheten i den temporala artären som erhållits för diagnos presenterar en fördel över andra vasculopathies, vilket möjliggör att studera dess patogenes lättare. De typiska fynd på fliken omfatta ett infiltrat av makrofager/histiocyter och T-lymfocyter finns över alla vaskulär lager av tunica intima, media och adventitia med samtidiga förstörelse av den elastiska lamina som normalt skiljer dessa fack2. De aktuella beläggen visar att GCA innebär okända antigen som aktiverar dendritiska celler i vaskulär adventitia, följt av rekrytering av helper T (Th) celler, särskilt Th1 och Th17 undertyper som utsöndra interleukin-17 och interferon-gamma (IFG) respektive. IFG sedan rekryterar och aktiverar makrofager att producera cytokiner och proteaser. Dessa inkluderar pro-inflammatoriska cytokiner; inklusive IL-12, som reciprocally aktiverar Th1 celler vilket ger en positiv feedbackloop; tumörnekrosfaktor och interleukin-6, som orsakar artrit och feber och metalloproteaser som skada den elastiska lamina. Glukokortikoider (GC), som utgör den kroniska standardbehandling, styra delvis cytokin vägar genom förmildrande av Th17/IL-17 men inte Th1/IFG armen av immunsvar3,4. Tyvärr, utsättande av GC resulterar i återfall. Som en alternativ modalitet, metotrexat har varit repurposed för GCA behandling, men de önska kliniska effektmåtten uppnåddes inte konsekvent trots mer känsliga biomarkörer inte har använts för terapeutiskt övervakning5,6 . 2017 godkändes av interleukin-6 blockerare, tocilizumab, för behandling av GCA framgår det effektivt sjukdomskontroll och steroid sparing effekter7,8.
Hittills finns det inga bra biomarkörer för GCA. Som ett resultat, är det svårt att följa sjukdomens aktivitet och titrera doser av tillgängliga läkemedel för att undvika negativa effekter och minska bördan av kostnad för samhället. Därför är det absolut nödvändigt att leta efter en kandidat biomarkör att korrelerar med sjukdomsaktivitet, ger nya insikter om patogenes och stöd i terapeutiska beslut.
Dysreglering av makrofag aktiveringen är en kritisk faktor i GCA patogenes. Ett effektivt sätt att behandla GCA kan således vara selektiv inriktning av aktiverade makrofager. Folat receptor beta (FRB) är en glycosyl-fosfatidylinositol glykoprotein som är förankrad på cellmembranet uttrycks i normala myelomonocytär celler, myeloisk leukemiceller och aktiverade makrofager. Dess ligand, folsyra, är en viktig vitamin i dess reducerade form, vilket möjliggör cellulär DNA syntesen, metylering och reparation9. FRB uttryck induceras i autoimmun sjukdom och under carcinogenes. Dess uttryck är begränsad till ytan av monocyter eller pro-inflammatoriska M1 makrofager i reumatoid artrit eller antiinflammatoriska M2 makrofager i solida organ och myeloida maligniteter10,11,12 , 13. Utöver dess potentiella roll som en biomarkör av aktiverade makrofager, FRB kan aktivera selektiv läkemedelstransport thru en flerstegsprocess som börjar med receptorbindning folsyra, antifolates eller folat-konjugerad droger på cellen yta, följt av internalisering, release och eventuell leverans av önskad drog till inre cell maskiner12,14,15,16. I kontrast till FRB uttryckt i cancerceller och aktiveras makrofager, FRB uttrycks i normala hematopoetiska celler är inte binda folater därigenom säkerställa att FRB/folat-medierad drogen leverans är begränsad till FRB-positiv inflammatorisk eller cancerceller.
I vår tidigare studie, vi visade för första gången som FRB uttrycks i GCA makrofager och dess uttryck korrelerade med CD68 + och endotelin receptor beta makrofager, som bidrar till GCA patogenes17. I den här rapporten beskriver vi den histopatologiska och immunohistokemiska metoder används för att bedöma FRB makrofag och analyseras det totala lymfocyt och makrofag räknas för att få en inblick i den FRB'S position i GCA vaskulär landskapet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder beskrivs godkändes av Penn State institutionella i styrelsen.
1. histopatologiska förberedelse och bearbetning efter att erhålla tidsmässiga artär biopsi
Obs: Tidsmässiga artär biopsi (fliken) utförs under lokalbedövning och sterila förhållanden av en certifierad kirurg. Efter kirurgiskt erhålla ett 3 cm arteriell avsnitt på den mer drabbade sidan, preparatet är fast i formalin omedelbart under 24 h, indelad i 3 till 4 mm sektioner och inbäddade i paraffin, noga med att uppmärksamma korrekt uppriktning av vävnad i blocket som lagras sedan i rumstemperatur. Preparatet urval sker efter att ha kontrollerat journaler. Diagnosen baseras på American College of Rheumatology 1990 kriterier som kräver att ämnen uppfylla 3 av 5 domäner: ålder > 50 år, nya huvudvärk, temporala artären ömhet, en erytrocyt sänkan > 50 mm/timme av Westergren-metoden och en onormal flik. För säkerhet, skyddshandskar måste bäras hela tiden vid hantering av prover, kemikalier och antikroppar.
- Från de inbäddade block, skär 4-5 µm tjocka sektioner med en mikrotom. och fläckar med Hematoxylin och Eosin (H & E). Använd ett kontrollavsnitt valda normal vävnad för kvalitetssäkring.
- Float skära sektioner på ett varmt vattenbad uppvärmd till 40 ° C och ta bort rynkor och plocka upp med ett belagt glas mikroskopisk bild. Placera glas glasen på en varm platta i en 60 ° C ugn i 60 minuter för att underlätta torkning och följsamhet i avsnitt till bild.
- Placera glas glasen på en varm platta i en 60 ° C ugn i 60 minuter för att underlätta torkning och följsamhet i avsnitt till bild.
- Montera 3 sektioner på objektglas.
- Placera bilder i en vertikal rack och torka över natten vid 37 ° C under 24 h.
- Placera bilder i en behållare och förvaras vid 4 ° C.
2. immunhistokemisk förberedelse, Dewaxing, Antigen Retrieval och färgning15,18,19,20
- Läsa in bilder i en objektglashållaren. Kör racket genom rätter enligt följande: två gånger i 100% xylen i 5 minuter med 10 sekunder av försiktig skakning varje 30 sekunder, en gång i 100% etanol med 10 sekunder agitation, en gång i 90% etanol med 10 sekunder agitation, en gång i 70% etanol med 10 sekunder agitation , och två gånger i dubbel destillerat H2O med 10 sekunder agitation.
Obs: Hantering av xylen och aceton bör göras i ventilerade huvar att undvika inandning och respiratoriska toxicitet. - Hämta antigen genom att överföra racket i en glasflaska med 200 mL 10 mmol/l, pH 6,0 citratbuffert föruppvärmd till 95 ° C. Ställ in timern för 30 minuter i vattenbad och sedan svalna i rumstemperatur i 20 minuter sedan skölj med rinnande vatten i 5 minuter.
- Ta bort endogena peroxidasaktiviteten genom ruvning i 200 mL 3% väteperoxid i 10 minuter. Tvätta diabilder 3 gånger i 200 µL Tris-buffrad koksaltlösning (TBSS).
- Ta bort bilderna från racket och badda varje en försiktigt för att torka överflödigt buffert. För färgning, tillsätt 200 µL följande primära antikroppar, lägga till täckglas på bilder och inkubera i en fuktig kammare i 1 timme vid rumstemperatur:
Anti-FRB antikropp utspädd 1:800
Anti-human monoklonal mus CD68, 1: 200 utspädning
Polyklonala kanin anti-CD3 1: 100 utspädning
Obs: Formalin-fast paraffin-inbäddat delar av moderkakan var också behandlas som beskrivs i steg 2.1 till 2,9 och inkuberas med anti-FRB18 och används som positiv kontroll. Färgning resultat erhölls genom att hitta den optimala antikroppkoncentrationen och utfördes av titreringen antikroppen i dubbla utspädningar (1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600). - Ta bort täckglaset efter inkubation och kassera. Skölj diabilder 3 gånger i 2 minuter vardera med TBSS, Töm och torka överflödigt buffert.
- Tillsätt 200 µL av sekundär antikropp lösning innehållande biotinylerade Anti-Rabbit/mus sekundära antikroppar för att reagera med okonjugerat primär antikropp bunden till en vävnad antigen. Placera coverslips på diabilder och inkubera i en fuktig kammare i 45 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort täckglaset efter inkubation och kassera. Skölj diabilder 3 gånger i 2 minuter vardera med TBS, Töm och torka överflödigt buffert.
- Tillsätt 200 µL av Diaminobenzidin (DAB) + substratbuffert (Imidazol HCl)-kromogen system och inkubera i 10 minuter för att visualisera färgningsmönster. Tvätta med TBSS sedan i rinnande vatten i 10 minuter.
- Motfärg med hematoxylin i 3 minuter.
- Montera bilder genom att tillämpa 70 µL av monteringsmedium på ytan av bilden. Långsamt spets täckglaset på monteringsmedium och undvika att skapa bubblor som du sänka den på plats. Vänta 24 timmar att torka.
3. histopatologiska och immunhistokemisk (IHC) analys
Undersöka H & E och IHC färgade sektioner från GCA positiva och normala försökspersoner med ett ljusmikroskop.
-
För H & E färgade sektioner:
- Bedöma den vaskulära arkitekturen och identifiera endotelceller i tunica intima, glatta muskelceller i tunica media, och fibroblaster och vasa vasorum i tunica adventitia21,22.
- Identifiera GCA funktioner, som omfattar lymfocyter och makrofager/histiocyte infiltration, cellulära hyperplasi och intern elastisk lamina nedbrytning.
- Analysera de lymphohistiocytic infiltrera genom att identifiera och kvantifiera antalet makrofager i förhållande till lymfocyter. Bedöma omfattningen av intern elastisk lamina störningar och hyperplastiska förändringar i bosatt celler och jämför med kontroller.
-
För den IHC färgade sektioner:
- Granska mönstret för färgning av FRB, med beaktande av dess uttryck av en viss typ eller typer av celler och dess fördelning inom vaskulär lager och dess förhållande till den totala immun infiltrera, den totala makrofag markören, anti-CD68 och pannan lymfocyter markör anti CD3.
- Kvantifiera uttryck för FRB, CD68 och CD3 celler genom att räkna de positivt färgade cellerna på 10 flera slumpmässigt utvalda hög effekt fält (hpf) och spela in medel.
Obs: Identifiering av dessa normal och patologisk celler och strukturer utfördes av en certifierad kardiovaskulära patolog (J.M.) och reumatolog (S.A.A.) och resultaten rapporterades i alla fall. - Fånga representativa bilder med en digitalkamera.
Obs: Efter dessa steg, kan återstående alikvoter förvaras vid-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histopatologiska fynd
H & E fläckar i normala prover visat normal arteriell anatomi med endotelceller i tunica intima, glatta muskelceller i tunica media, och en heterogen kollagenmatrisen som inkluderar fibroblaster och feeder fartyg kallas vasa vasorum i tunica adventitia. Det finns ingen inflammatoriska infiltrat som identifierats. GCA positiva temporala artärer visat måttlig till svår inflammation med aggregat av makrofager/histiocyter, lymfocyter, enstaka plasmaceller och Multinucleära jätteceller. Luminala förträngning var noterade och åtföljas av intimans förtjockning och 90% störningar av den interna elastisk lamina (figur 1).
Immunhistokemiska fynd
CD3 + lymfocyter och CD68 + makrofager var närvarande i alla GCA + exemplar och visat liknande färgning mönster i alla biopsier. Lymfocyterna dominerade över makrofager med CD3/CD68 förhållande av 1.6. Färgning för FRB begränsades till makrofager och Multinucleära jätteceller som företrädesvis lokaliserad till adventitia och media (tabell 1 och figur 2). Styra exemplar visade minimal leukocyter (< 5 celler/hög-High-Power fält) och inget FRB uttryck.
Figur 1: H & E bilder av temporala artärer. (A) representant H & E bild av en normal temporala artären med distinkta lager av tunica (t) adventitia, media och intima från den yttersta till den innersta/Luminal sida respektive. Observera nätverket av kollagen och vasa vasorum i adventitia (tjocka pilar), glatta muskelceller i media (tunna pilar) och endotelceller i intima (10 x förstoring). (B) en utvidgad Mikrograf av gränssnittet intima-media markeras av den rektangulära infällt i A och skiljs åt av den interna elastisk lamina (pilspetsar) (20 x förstoring). (C) representant H & E bilden av en TA med jätte cell arterit präglas av en transmural lymphohistiocytic infiltrera (tjocka pilar), intimans hyperplasi och förstörelsen av den interna elastisk lamina (pilspetsar) (10 x förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: immunhistokemisk färgning av temporala artärer med jätte cell arterit. (A) representativa bilder visar ett omfattande inflammatoriska infiltrat med CD68 positiva makrofager och jätteceller (pilar) återfinns mestadels i media och adventitia (10 x förstoring). (B) folat receptor beta (FRB) uttrycktes selektivt i aktiverade makrofager (pilar) (10 x förstoring). Bild tagen på högre makt visade FRB positiva makrofager i (C) och CD68 positiva makrofager i (D) (100 x förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| GCA försökspersoner (n = 5) | Medelvärdet (±SD) |
| CD3 (% av immun infiltrera) | 61,7 ± 4,1 |
| CD68 (% av immun infiltrera) | 38,3 ± 4,1 |
| CD68 histiocyter/makrofager (celler/hpf) | 34,8 ± 10,4 |
| FRB + makrofager (celler/.hpf) | 10,8 ± 4,4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12,7 |
Tabell 1: Sammanfattning av FRB, CD68 och CD3 uttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GCA är den vanligaste vaskulit hos vuxna, och dess patologiska hallmark exemplifierar en potent kombination av T-hjälparceller lymfocyter och aktiveras makrofager som kan också hittas i andra granulomatös sjukdomar eller vasculopathies som sarkoidos och granulomatös polyangit2,3. I GCA, den temporala artären ger en bra representation av ett medium till stora storlek artär och TA biopsi ger ett betydande prov som kan lagras i paraffinblock i år, vilket skapar möjligheter att studera rollerna av nya diagnostiska och terapeutiska mål som FRB i den vasculitic mikromiljö. Vi tog den fördel som presenteras av tillgängliga vävnad och standard immunopathologic metoder att be om FRB kan analyseras på ett tillförlitligt sätt genom IHC. Våra resultat visar att histopatologi och IHC kan fungera som värdefulla verktyg inte bara för att bekräfta diagnos och omfattningen av kärlskador utan också validera rollen av olika makrofag undertyper i GCA.
De histopatologi och IHC metoder är båda labor intensiv och kräver kompetens av histochemical tekniker, patolog och reumatolog, men teknikerna har varit väl etablerade och kan fungera som ett startskott för med andra metoder såsom immunofluorescens och flöde flödescytometri. Nackdelen med sådana metoder är dock behovet av färsk fryst vävnad som kräver blivande samling. IHC, tillsammans med histopatologisk undersökning, är ovärderlig presentera en panoramautsikt perspektiv av den vaskulära immun närmiljön som upprepade gånger kan nås och analyseras särskilt med uppkomsten av nya proteiner som FRB. Hematoxylin och Eosin (H & E) färgningen kan man granska vävnad histologi. Hematoxylin fläckar kärnan och belyser de nukleära detaljerna medan eosin fungerar som en motfärg som hjälpmedel visar skillnaderna mellan kärnvapen och cytoplasmiska funktioner. Användning av ett kontrollavsnitt valda normal vävnad är viktigt att utvärdera för kvalitetssäkring.
IHC upptäcker antigenet sevärdheter i fryst eller formalin-fast och paraffin-inbäddat vävnader med hjälp av flera antikroppar som visualiseras av mikroskopi. Protokollet beskrivs anpassades från van der Heijden et al.15, som demonstrerade FRB uttryck i synovial makrofager i reumatoid artrit. Väsentliga IHC stegen omfattar vävnad förberedelse, dewaxing/avparaffinering, antigen retrieval och färgning23. Det är viktigt att säkerställa att vävnaden bort från patienten omedelbart åtgärdas i formalin och vävnad justering och orientering minutiöst bevarat när fast i paraffin. Vävnaden är tunt sektioneras med användning av en mikrotom och genomgår ett dewaxing steg som kräver flera tvättar i xylen, etanol och vatten. Nästa steg kallas antigen retrieval, behövs för att bryta ner metylen kopplingarna bildas under formalin fixering och kräver en citrat-baserad buffert och fuktig värme. Glasen behandlas med väteperoxid att blockera endogena peroxidas enzymer som kan störa antigen detection. Färgningsproceduren utförs nästa genom ruvning i bilderna med utspädda primära antikroppar som binder antigen av intresse följt genom att tillämpa en sekundär antikropp som kommer att upptäcka den primära antigen-antikroppsreaktion. Detta följs av märkning med en kromogen DAB-substrat som bildar ett brunt pigment som visualiseras under mikroskopet. Det sista steget är noggrann montering av vävnaden med en permanent lösning att göra säker på att inga störande ämnen som bubblor bildas mellan täckglas och yta. Protokollet krävs ändringar att rymma användningen av arteriell vävnad. Eftersom studien var först att utvärdera FRB i GCA, den optimala antikroppkoncentrationen var okänd och behövs flera spädningar på 1: 100, 1: 400, 1: 200, 1:50, 1:800, 1:1, 600, 1:3200 med de bästa färgning kvalitet på lägsta bakgrundsljud eller signal uppnås på 1:800.
Den membran-associerade FRB var tidigare validerats av Ross et al.18,24 och hittades uttrycks i normala moderkakan celler, neutrofiler, leukemiska Blaster i kronisk myeloisk leukemi, promyeloisk leukemi, myeloblast populationer av myelomonocytisk och erythroleukemias och steglöst i M1/M2 akut myeloisk leukemi. Den affinitet-renat Kanin polyklonal antikroppen som är specifik för FRB används i dessa tidigare verk har sedan dess tillämpats till studier av reumatoid artrit positiva synovial makrofager och solida organ tumörer. FRB antikroppen används i detta protokoll är inte kommersiellt tillgängliga och kan hämma bred tillämpning. Möjligen den metod som beskrivs här kan även fungera för andra FRB antikroppar men kräver individuell optimering innan dess användning i större antal. Eftersom FRB uttrycks betydligt i moderkakan, har denna vävnad upprepade gånger används som positiv kontroll.
Studiedesign begränsades av en liten provstorlek och kräver validering i större antal flikar idealiskt erhålls i tidiga och sena skeden av GCA. Dessutom, eftersom FRB makrofag kan fungera som ett potentiellt diagnostiska och terapeutiska mål med folsyra konjugerade agenter och antifolates, stöder uppgifterna här behovet av att ytterligare undersöka FRB fenotyp i samband med M1 och M2 makrofag polarisering. När det gäller andra diagnostik konjugerade dessa resultat öppna affärsmöjligheter för icke-invasiv bildgivande metoder med FRB riktade folsyra SPECT av PET imaging agenter. Dessutom makrofag infiltration är ett signum för sjukdomsprogression och aktivitet i åderförkalkning, sklerodermi, sarkoidos och ledgångsreumatism, kan användning av detta protokoll hitta program i dessa villkor.
Detta är det första protokollet att utforska uttryck och fördelningen av FRB i GCA. IHC tillåts en panoramautsikt över tvärsnittsdata och flera vyer av TA och tillåter analys av numeriska relationerna mellan den immun infiltrera och de arteriella mikromiljö. FRB består 30% av den totala makrofager som infiltrerat alla lager av kärlväggen, men intressant, FRB inte hittades i intima och lokaliserad endast till den adventitia och media. Detta mönster av distribution kan avslöja nya insikter på FRB makrofag tropism för differentiell kollagen sammansättning finns i media och adventitial lager25. Den immun infiltrera bestod av ca 60% lymfocyter (mätt som pan-lymfocyter markör anti-CD3) och 40% makrofager (markerad med pan-makrofag markör anti-CD68). En nyligen genomförd studie korrelerade CD3 med en högre känslighet för GCA diagnos medan en annan kopplad CD68 uttryck högre sjukdomsaktivitet. Vi föreslår således att den tidiga GCA vaskulär immun milieu börjar med en 60: 40 förhållandet av lymfocyter: makrofager med 30% av makrofager som FRB positiva. Om detta gäller för och konsekvent visades hos patienter med tidig sjukdom bör ytterligare validerade i framtiden och blivande experiment. Om denna cellulära infiltrera distribution håller konsekvent, kan det sedan tjäna som biomarkör komposit för GCA sjukdomens aktivitet.
Sammanfattningsvis visade detta protokoll för första gången förekomsten av FRB infiltration i media och adventitia av temporala artärer i GCA. FRB makrofager representerade ungefär en tredjedel av den totala makrofag befolkningen i en tidig och aktiv GCA närmiljön består av 60% lymfocyter och 40% makrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete har gjorts möjlig genom stöd av Dr Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, avdelningen för Reumatologi/Institutionen för medicin och molekylär och histopatologiska Core laboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
