Summary
Het protocol illustreert het gebruik van histopathologische onderzoek en immunohistochemistry aan profiel de folaat receptor bèta macrophage en de relatie met de totale immuun cel in de temporele slagader biopsieën in gigantische cel arteritis infiltreren.
Abstract
Reuze cel arteritis (GCA) is een chronische immuun-gemedieerde ziekte van middelgrote tot grote formaat slagaders die oudere volwassenen treft. GCA manifesten met artritis en occlusieve symptomen van hoofdpijn, beroerte of visie van verlies. Macrofagen en lymfocyten van T-helper infiltreren de vasculaire muur en produceren van een pro-inflammatoire respons die leiden tot beschadiging van het schip en ischemie. Tot op heden is er geen GCA biomerker dat ziekte activiteit en gids therapeutische respons kan controleren.
Folaat receptor bèta (FRB) is een glycosylphosphatidylinositol eiwit dat is verankerd op celmembranen en normaal gesproken uitgedrukt in de bloedlijn MyeloMonocytaire en in de meeste myeloïde leukemie cellen zo goed zoals in de tumor en reumatoïde synoviale macrofagen, waar haar expressie correleert met de ernst van de ziekte. Het vermogen van FRB binden folaat verbindingen, foliumzuur-geconjugeerde en antifolate drugs heeft gemaakt een druggable doel in kanker en ontstekingsziekte onderzoek. Dit verslag beschrijft de methoden van het histopathologische en immunohistochemische gebruikt om te evalueren van de expressie en de verspreiding van FRB ten opzichte van GCAimmunopathology.
Formaline-vaste en paraffine-ingebedde temporele slagader Biopten van GCA en normale besturingselementen werden gekleurd met haematoxyline en eosine te herzien Weefsel histologie en Pathognomonisch omgaan. Immunohistochemistry werd gebruikt voor het detecteren van FRB CD68 en CD3 expressie. Een microscopische analyse werd uitgevoerd om te kwantificeren van het aantal positief gekleurde cellen op 10 geselecteerde hoog-power-veldsecties en hun respectieve plaatsen in de arteriële muur.
Lymphohistiocytic (LH) ontsteking gepaard met intima hyperplasie en verstoorde elastische lamina werd gezien in de GCA met geen gevonden in besturingselementen. De LH infiltreren bestond uit ongeveer 60% lymfocyten en 40% macrofagen. FRB expressie was beperkt tot macrofagen, bestaande uit 31% van de totale CD68 + macrofaag bevolking en gelokaliseerd aan de media en de adventitia. Geen FRB werd gezien in besturingselementen.
Dit protocol blijk gegeven van een afzonderlijke numerieke en ruimtelijke patroon van de macrofaag FRB ten opzichte van de vasculaire immuun communicatie in GCA.
Introduction
Reuze cel arteritis (GCA) is een ontstekingsziekte van middelgrote tot grote slagaders, gericht op de aorta en haar bijkantoren en beïnvloeden van oudere volwassenen. Het presenteert met een milde tot ernstige ischemische complicaties, zoals hoofdpijn, kaak pijn, verlies van de visie, beroerte en weefsel gangreen. De diagnose wordt bevestigd door hoge inflammatoire merkers zoals bezinkingssnelheid (ESR) en een aparte histopathologische patroon op de temporele slagader biopsie (tabblad)1. GCA is de meest voorkomende volwassen vasculitis, en de toegankelijkheid van de temporele slagader verkregen voor diagnose presenteert een voordeel ten opzichte van andere vasculopathies, waardoor een te bestuderen zijn pathogenese gemakkelijker. De typische bevindingen op tabblad omvatten een infiltreren van macrofagen/histiocytes en T-lymfocyten aangetroffen in alle vasculaire lagen van de tunica intima, media en adventitia met gelijktijdige vernietiging van de elastische lamina die normaal deze scheidt compartimenten2. Het huidige bewijs toont aan dat de GCA impliceert een onbekende antigeen dat dendritische cellen in de vasculaire adventitia activeert, gevolgd door de indienstneming van helper (Th) T cellen, specifiek Th1 en Th17 subtypen die afscheiden van Interleukine-17 en interferon-gamma (IFG) respectievelijk. IFG dan werft en activeert de macrofagen voor de productie van cytokines en proteasen. Deze omvatten pro-inflammatoire cytokines; met inbegrip van IL-12, die samengebouwd activeert Th1 cellen waardoor een positieve feedback loop; Tumornecrosefactor en Interleukine-6, met als gevolg van artritis en koortsen en metalloproteinasen die schade de elastische lamina. Glucocorticoïden (GC), die de standaard chronische therapie vormen, bepalen gedeeltelijk de cytokine trajecten door verzachtende de Th17/IL-17 maar niet de Th1/IFG-arm van de immuunrespons3,4. Helaas, stopzetting van GC resulteert in ziekte herval. Als een alternatieve modaliteit, methotrexaat heeft geweest voorzien voor GCA behandeling, maar de gewenste klinische eindpunten waren niet consequent bereikt hoewel gevoeliger biomarkers niet voor therapeutische toezicht5,6 gebruikt hebben . In 2017, werd de Interleukine 6 blocker, tocilizumab, goedgekeurd voor de behandeling van de GCA zoals effectief blijkt ziektebestrijding en steroïde sparend effecten7,8.
Tot op heden zijn er geen goede biomarkers voor GCA. Dientengevolge, kan het moeilijk zijn om te controleren van de activiteit van de ziekte en titreer doses van beschikbare drugs voorkoming van negatieve effecten te verminderen van de last van de kosten voor de samenleving. Het is dus absoluut noodzakelijk om te zoeken naar een biomarker van de kandidaat-lidstaten dat correlaten met ziekte-activiteit, nieuwe inzichten over de pathogenese en therapeutische besluiten steun verstrekken.
De disregulatie van macrofaag activering is een cruciale factor in de pathogenese van de GCA. Dus, een effectieve middelen voor de behandeling van de GCA kan worden de selectieve doelgerichtheid van geactiveerde macrofagen. De folaat receptor beta (FRB) is een glycosyl-phosphatidylinositol glycoproteïne die is verankerd op de celmembraan uitgedrukt in normale MyeloMonocytaire cellen, myeloïde leukemie cellen en macrofagen geactiveerd. De ligand, foliumzuur, is een essentieel vitamine in zijn gereduceerde vorm, waarmee cellulaire DNA synthese, methylation en reparatie9. FRB expressie wordt in auto-immune ziekte en tijdens carcinogenese geïnduceerd. Haar expressie is beperkt tot het oppervlak van de monocyten of pro-inflammatoire M1 macrofagen bij reumatoïde artritis, of anti-inflammatoire M2 macrofagen in solide orgel en myeloïde maligniteiten10,11,12 , 13. Naast zijn potentiële rol als een biomarker van geactiveerde macrofagen, de FRB selectieve drug vervoer door middel van een multi stap proces dat met de receptor binden aan foliumzuur, antifolates of folaat-geconjugeerde drugs bij de cel begint kunt inschakelen oppervlakte, gevolgd door internalisering, de introductie en de uiteindelijke levering van gewenste drug aan de interne cel machines12,14,15,16. In tegenstelling tot FRB uitgedrukt in kankercellen en macrofagen geactiveerd, uitgedrukt in normale hematopoietische cellen FRB is niet in staat om te folates, waardoor ervoor wordt gezorgd dat FRB/folaat-gemedieerde drug delivery beperkt tot FRB-positieve inflammatoire of kankercellen is binden.
In onze eerdere studie, we laten zien voor de eerste keer dat FRB wordt uitgedrukt in GCA macrofagen en haar expressie gecorreleerd met CD68 + en endothelin receptor bèta macrofagen, die tot de GCA pathogenese17 bijdragen. In dit verslag, beschrijven we de histopathologische immunohistochemische methoden gebruikt voor het beoordelen van de FRB macrophage en de totale lymfocyt geanalyseerd en macrofaag telt om inzicht in de de FRB positie in het GCA vasculaire landschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die worden beschreven zijn door de Penn State institutionele Review Board goedgekeurd.
1. histopathologisch voorbereiding en verwerking na het verkrijgen van de temporele slagader biopsie
Opmerking: De temporele slagader biopsie (TAB) wordt uitgevoerd onder plaatselijke verdoving en steriele omstandigheden door een gecertificeerde chirurg. Na het chirurgisch verkrijgen een arteriële sectie van 3 cm aan de meer aangedane zijde, het model is vastgesteld in formaline onmiddellijk gedurende 24 uur, verdeeld in 3 tot 4 mm secties, en ingebed in paraffine, zorgvuldig aandacht te besteden aan de juiste uitlijning van weefsel in het blok dat wordt vervolgens opgeslagen op kamertemperatuur. Model selectie wordt uitgevoerd na het verifiëren van de medische dossiers. De diagnose is gebaseerd op de American College of Reumatologie 1990 criteria die vereist dat onderwerpen voldoen aan 3 van de 5 domeinen: leeftijd > 50 jaar nieuwe hoofdpijn, temporele slagader tederheid, een bezinkingssnelheid van > 50 mm/uur door Westergren methode en een abnormale TAB. Voor de veiligheid, beschermende handschoenen moeten worden gedragen te allen tijde bij de behandeling van de monsters, chemicaliën en antilichamen.
- Snijd van de ingesloten blokken, 4-5 µm dik secties gebruikend microtome. en vlek met haematoxyline en eosine (H & E). Gebruik een sectie van de controle van geselecteerde normale weefsel voor kwaliteitsborging.
- Float gesneden secties op een warm waterbad verwarmd tot 40 ° C rimpels te verwijderen en ophalen met een gecoate microscopische glasplaatje. Plaats het glas dia's op een warme plaat in een oven van 60 ° C gedurende 60 minuten drogen en hechting van de sectie naar de dia te vergemakkelijken.
- Plaats het glas dia's op een warme plaat in een oven van 60 ° C gedurende 60 minuten drogen en hechting van de sectie naar de dia te vergemakkelijken.
- 3 secties op Microscoop-dia's koppelen.
- Dia's in een verticale rack en droge overnachting bij 37 ° C gedurende 24 uur plaats.
- Plaatsen van dia's in een container en bewaren bij 4 ° C.
2. immunohistochemische voorbereiding, Wasuitsmeltovens, antigeen ophalen en kleuring15,18,19,20
- Dia's in een rack dia laden. Het rek door gerechten als volgt uitgevoerd: tweemaal in 100% xyleen gedurende 5 minuten met 10 seconden van zachte agitatie elke 30 seconden, eenmaal in 100% ethanol met 10 seconden agitatie, eenmaal in de 90% ethanol met 10 seconden agitatie, eenmaal in 70% ethanol met 10 seconden agitatie , en tweemaal in dubbel gedestilleerd H2O met 10 seconden agitatie.
Opmerking: Behandeling van xyleen en aceton moet gebeuren in geventileerde afzuigkappen inademing en respiratoire toxiciteit te voorkomen. - Ophalen van het antigeen door de overdracht van het rek in een glazen fles met 200 mL 10 mmol/L, pH 6.0 citraat buffer voorverwarmde tot 95 ° C. Instellen van de timer voor 30 minuten in het waterbad, dan koel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten dan spoelen met stromend water gedurende 5 minuten.
- Endogene peroxidase activiteit verwijderen door het broeden in 200 mL waterstofperoxide 3% gedurende 10 minuten. Wassen dia's 3 keer in 200 µL van Tris-gebufferde zoutoplossing (TBSS).
- De dia's te verwijderen uit het rek en schar elkaar om voorzichtig af te vegen van overtollige buffer. Voor vlekken, voeg 200 µL van de volgende primaire antilichamen, cover slips op dia's toevoegen en Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer:
Anti-FRB antilichaam verdund 1:800
Monoclonal muis anti-menselijke CD68, 1:200 verdunning
Polyclonal konijn anti-CD3 1:100 verdunning
Opmerking: Formaline-vaste paraffine-ingebedde secties van placenta waren ook verwerkt zoals beschreven in stappen 2.1 2.9 en bebroede met anti-FRB18 en gebruikt als positieve controle. Kleuring resultaten werden verkregen door het vinden van de optimale antilichaam concentratie en werd uitgevoerd door het titrating van het antilichaam in dubbele verdunningen (1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). - Verwijder de cover slip na incubatie en negeren. Spoelen van de dia's 3 keer voor elke 2 minuten met TBSS, afvoer en veeg overtollige buffer.
- Voeg 200 µL van secundair antilichaam oplossing met biotinyleerd Anti-Rabbit/muis secundair antilichaam om te reageren met unconjugated primair antilichaam gebonden aan weefsel antigeen. Coverslips plaats op de dia's en incubeer in een vochtige kamer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de cover slip na incubatie en negeren. Spoelen van de dia's 3 keer voor elke 2 minuten met TBS, afvoer en veeg overtollige buffer.
- Voeg 200 µL van diaminobenzidine (DAB) + substraat buffer (imidazol HCl)-chromogeen systeem en incubeer gedurende 10 minuten bij het visualiseren kleuring patroon. Wassen met TBSS dan in stromend kraantjeswater voor 10 minuten.
- Counterstain met haematoxyline gedurende 3 minuten.
- Monteer de dia's door 70 µL van montage medium toe te passen op het oppervlak van de dia. Langzaam tip het dekglaasje aan op de montage-medium en voorkomen dat er bubbels als u het vastklikt verlaagt. Wacht 24 uur om te drogen.
3. histopathologische en analyse van Immunohistochemical (IHC)
De H & E en IHC gekleurd secties van de GCA positieve en normale onderwerpen met behulp van een lichte microscoop onderzocht.
-
Voor de H & E gekleurd secties:
- Beoordelen van de vasculaire architectuur en identificeren van endotheliale cellen in de tunica intima, zachte spiercellen in de tunica media, en de fibroblasten en vasa vasorum in de tunica adventitia21,22.
- Omgaan met functies van de GCA, waaronder lymfocyt en macrofaag/histiocyte infiltratie, cellulaire hyperplasie en interne elastische lamina afbraak.
- Analyseer de lymphohistiocytic infiltreren door het identificeren en kwantificeren van het aantal macrofagen ten opzichte van de lymfocyten. Beoordelen in welke mate van verstoring van de interne elastische lamina en hyperplastische veranderingen in resident cellen en vergelijk met besturingselementen.
-
Voor de IHC gekleurd secties:
- Onderzoeken van de kleuring patroon van FRB, neemt nota van de expressie van een bepaald type of soorten cellen en de spreiding in de vasculaire lagen en haar relatie tot de totale immuun infiltreren, de totale macrofaag-marker, anti-CD68 en de pan lymfocyt marker anti-CD3.
- Kwantificeren van de expressie van FRB CD68 en CD3 cellen door het tellen van de positief gekleurde cellen op 10 meerdere willekeurig geselecteerde hoogvermogen velden (hpf) en opnemen van de middelen.
Opmerking: Identificatie van deze normale en pathologische cellen en structuren werden uitgevoerd door een gecertificeerde cardiovasculaire patholoog (JM) en reumatoloog (SAO) en de resultaten werden geregistreerd voor alle gevallen. - Representatieve opnamen met behulp van een digitale camera.
Opmerking: Na deze stappen, kan resterende aliquots worden opgeslagen bij-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histopathologische bevindingen
De H & E vlekken in normale exemplaren aangetoonde normale arteriële anatomie met endotheliale cellen in de tunica intima, zachte spiercellen in de tunica media, en een heterogeen collageen-matrix die fibroblasten en feeder vaartuigen omvatten genoemd Wasa vasorum in de tunica adventitia. Er is geen inflammatoire infiltreren geïdentificeerd. GCA positieve temporele slagaders aangetoond dat matige tot ernstige ontsteking met aggregaten van macrofagen/histiocytes, lymfocyten en plasmacellen occasionele multinucleaire reus cellen. Luminal vernauwing was opgemerkt en begeleid door intima verdikking en 90% verstoring van de interne elastische lamina (Figuur 1).
Immunohistochemische bevindingen
CD3 + lymfocyten en macrofagen CD68 + waren aanwezig in alle GCA + specimens en aangetoond vergelijkbare kleuring patronen in alle biopsies. De lymfocyten overheersten over macrofagen met een CD3/CD68 ratio van 1.6. Kleuring voor FRB was beperkt tot macrofagen en multinucleaire reus cellen die bij voorkeur gelokaliseerd aan de adventitia en de media (tabel 1 en Figuur 2). Controle van specimens toonde minimale leukocyten (< 5 cellen/hoog-power veld) en geen FRB uitdrukking.
Figuur 1: H & E beelden van temporele slagaders. (A) vertegenwoordiger H & E afbeelding van een normale temporele slagader met verschillende lagen van de tunica (t) adventitia, media en intima van de buitenste naar de binnenste/Luminal kant respectievelijk. Opmerking het netwerk van collageen en vasa vasorum in de adventitia (dikke pijlen), de zachte spiercellen in de media (dunne pijlen) en de endotheliale cellen in de intima (10 x vergroting). (B) een uitgebreide opname van de intima-media interface is gemarkeerd door de rechthoekige inzet in A en wordt gescheiden door de interne elastische lamina (pijlpunten) (20 x vergroting). (C) vertegenwoordiger H & E afbeelding van een TA met gigantische cel arteritis gekenmerkt door een Transmurale lymphohistiocytic infiltreren (dikke pijlen), de intima hyperplasie en de vernietiging van de interne elastische lamina (pijlpunten) (10 x vergroting). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: immunohistochemische kleuring van temporele slagaders met gigantische cel arteritis. (A) representatieve beelden tonen een uitgebreide inflammatoire infiltreren met CD68 positieve macrofagen en gigantische cellen (pijlen) gevonden voornamelijk in de media en adventitia (10 x vergroting). (B) folaat receptor bèta (FRB) werd selectief uitgedrukt in geactiveerde macrofagen (pijlen) (10 x vergroting). Foto genomen op hogere macht aangetoond FRB positieve macrofagen in (C) en de positieve macrofagen CD68 in (D) (100 x vergroting). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| GCA onderwerpen (n = 5) | Mean (±SD) |
| CD3 (% van immuun infiltreren) | 61.7 ± 4.1 |
| CD68 (% van immuun infiltreren) | 38.3 ± 4.1 |
| CD68 histiocytes/macrofagen (cellen/hpf) | 34.8 ± 10.4 |
| FRB + macrofagen (cellen/.hpf) | 10.8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12,7 |
Tabel 1: Overzicht van FRB CD68 en CD3 expressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GCA is de meest voorkomende vasculitis bij volwassenen, en haar pathologische hallmark is een voorbeeld van een krachtige combinatie van T-helper-lymfocyten en macrofagen die kunnen ook worden gevonden in andere granulomateuze ziekten of vasculopathies zoals sarcoïdose geactiveerd en Granulomatous polyangiitis2,3. GCA, de temporele slagader biedt een goede vertegenwoordiging van een middelgrote tot grote formaat slagader en de TA biopsie geeft een omvangrijke steekproef die kan worden opgeslagen in paraffineblokken van jarenlang, waardoor kansen om te studeren van de rollen van de opkomende diagnostische en therapeutische doelen zoals FRB in de ziekte communicatie. We namen het voordeel gepresenteerd door toegankelijk weefsel en standaard immunopathologic methoden om te vragen of de FRB op betrouwbare wijze kan worden geanalyseerd door middel van IHC. Onze bevindingen tonen aan dat histopathologie en IHC als waardevolle hulpmiddelen niet alleen dienen kan bij de bevestiging van de diagnose en de omvang van vasculaire schade, maar ook bij het valideren van de rol van verschillende macrofaag subtypen in GCA.
De histopathologie en IHC methoden zijn zowel intensieve arbeid en de vaardigheden van de histochemische technicus, patholoog en reumatoloog vereisen, maar de technieken goed zijn vastgesteld en kunnen dienen als een lanceerplatform voor het gebruik van andere methoden zoals immunofluorescentie en stroom cytometry. Het nadeel van dergelijke methoden is echter de behoefte aan vers bevroren weefsel waarvoor toekomstige collectie. Het IHC, samen met histopathologische onderzoek, is van onschatbare waarde bij de indiening van een panoramisch perspectief van de vasculaire immuun communicatie die herhaaldelijk kan worden benaderd en geanalyseerd vooral met de opkomst van nieuwe eiwitten zoals de FRB. De Haematoxyline en eosine (H & E) kleuring kan men bekijken Weefsel histologie. Haematoxyline vlekken van de kern en de nucleaire details markeert terwijl eosine als een counterstain die helpt fungeert bij het aantonen van de verschillen tussen de nucleaire en cytoplasmatische functies. Het gebruik van een sectie van de controle van geselecteerde normaal weefsel is essentieel om te evalueren voor kwaliteitsborging.
Het IHC detecteert het antigeen van belang in bevroren of formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefsels door het gebruik van meerdere antilichamen die worden gevisualiseerd door microscopie. Het protocol beschreven werd aangepast van van der Heijden et al.15, die aangetoond FRB expressie in synoviale macrofagen bij reumatoïde artritis. De essentiële stappen van de IHC omvatten weefsel voorbereiding, Wasuitsmeltovens/deparaffinization, antigeen ophalen en kleuring van23. Het is essentieel om ervoor te zorgen dat het weefsel van de patiënt verwijderd wordt onmiddellijk bevestigd in formaline en weefsel uitlijning en stand zorgvuldig behouden wanneer opgelost in paraffine. Het weefsel is dun gesegmenteerd met het gebruik van een microtoom en ondergaat een dewaxing stap waarvoor meerdere wasbeurten in xyleen, ethanol en water. De volgende stap, genaamd antigeen ophalen, nodig is voor het uitsplitsen van de methyleen verbanden gevormd tijdens formaline fixatie en vereist een citraat gebaseerde buffer en vochtige warmte. De dia's worden behandeld met waterstofperoxide voor het blokkeren van endogene peroxidase-enzymen die met de opsporing van antigeen interfereren kunnen. De kleuring procedure wordt vervolgens uitgevoerd door het broeden van de dia's met verdunde primaire antilichamen die bindend zullen zijn voor het antigeen van belang gevolgd door een secundair antilichaam dat de primaire antigeen-antilichaam-reactie detecteert toe te passen. Dit wordt gevolgd door het labelen met een chromogeen DAB-substraat dat vormt een bruin pigment dat onder de Microscoop is gevisualiseerd. De laatste stap is de zorgvuldige montage van het weefsel met een permanente oplossing om ervoor te zorgen dat er geen storende stoffen zoals bubbels worden gevormd tussen de slip van de cover en het oppervlakte. De wijzigingen van het protocol vereist om het gebruik van arteriële weefsel. Omdat de studie was de eerste om te evalueren van FRB in GCA, de optimale antilichaam concentratie was onbekend en meerdere verdunningen nodig bij 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1, 600, 1:3200 met de beste kwaliteit tegen de laagste achtergrondruis of signalen kleuring verwezenlijkt 1:800.
De membraan-geassocieerde FRB werd eerder gevalideerd door Ross et al.18,24 en bleek te worden uitgedrukt in normale cellen van de placenta, neutrofielen en leukemische ontploffingen in chronische myeloïde leukemie, promyelocytic leukemie, Myeloblast populaties van MyeloMonocytaire, en erythroleukemias en variabel in M1/M2 acute myeloïde leukemie. De affiniteit-gezuiverd konijn polyclonal antilichaam specifiek voor FRB gebruikt in deze eerdere werken sindsdien op studies van reumatoïde artritis positieve synoviale macrofagen en solide organ-tumoren zijn toegepast. Het antilichaam van de FRB gebruikt in dit protocol is niet commercieel beschikbaar en brede toepassing kan belemmeren. Denkbaar, de hier beschreven methode kan ook werken voor andere FRB antilichamen maar vergt een individuele optimalisatie voor het gebruik in grotere aantallen. Aangezien FRB aanzienlijk in de placenta wordt uitgedrukt, is herhaaldelijk dit weefsel gebruikt als positieve controle.
Het ontwerp van het onderzoek werd beperkt door de grootte van een kleine steekproef en vereist validatie in grotere aantallen tabbladen ideaal verkregen in vroege en late stadia van GCA. Aangezien de FRB macrofaag als een potentieel doelwit voor diagnostische en therapeutische met folic geconjugeerd agenten en antifolates dienen kan, ondersteunt de gegevens hier verkregen bovendien de noodzaak om verder te onderzoeken FRB fenotype in het kader van M1 en M2 macrofaag polarisatie. Met betrekking tot andere diagnostische tests, deze resultaten geopende opportunities voor niet-invasieve beeldvormende benaderingen met FRB gericht foliumzuur geconjugeerd SPECT van PET imaging agenten. Bovendien, gezien het feit dat macrofaag infiltratie een kenmerk van de progressie van de ziekte en de activiteit in atherosclerose, sclerodermie, sarcoïdose en reumatoïde artritis is, vindt het gebruik van dit protocol toepassingen in deze voorwaarden.
Dit is het eerste protocol bij het verkennen van de expressie en de distributie van de FRB in GCA. Het IHC toegestaan een panoramisch transversale en meerdere weergaven van de TA en analyse van de numerieke verhoudingen tussen de immuun infiltreren en de arteriële communicatie maakt het mogelijk. De FRB bestond uit 30% van de totale macrofagen die alle lagen van de vasculaire muur geïnfiltreerd, maar interessant, de FRB werd niet gevonden in de intima en gelokaliseerde alleen voor de adventitia en de media. Dit patroon van distributie kan onthullen nieuwe inzichten op FRB macrofaag tropisme voor de samenstelling van de differentiële collageen gevonden in de media en de adventitial lagen25. De immuun infiltreren bestond uit ongeveer 60% lymfocyten (zoals gemeten door de pan-lymfocyt marker anti-CD3) en 40% macrofagen (gekenmerkt door pan-macrofaag marker anti-CD68). Een recente studie gecorreleerd CD3 met een hogere gevoeligheid voor GCA diagnose, terwijl een ander gekoppeld CD68 expressie hogere ziekte-activiteit. Daarom stellen wij voor dat de vroege GCA vasculaire immuun milieu begint met een verhouding van de 60:40 van lymfocyten: macrofagen met 30% van de macrofagen FRB positief wordt. Of dit geldt voor en consequent aangetoond bij patiënten met een beginstadium van de ziekte moeten verder worden voortaan gevalideerde en toekomstige experimenten. Als deze cellulaire infiltreren verdeling consequent houdt, kan het dan dienen als biomerker vierkleurendruk voor GCA ziekte activiteit.
Kortom, dit protocol blijk gegeven voor de eerste keer de aanwezigheid van FRB infiltratie in de media en adventitia van temporele slagaders in GCA. FRB macrofagen vertegenwoordigd ongeveer eenderde van de bevolking van de totale macrophage in een vroege en actieve GCA communicatie samengesteld uit 60% lymfocyten en 40% macrofagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd mogelijk gemaakt door de steun van Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, de divisie voor Reumatologie/Vakgroep Geneeskunde en moleculaire en histopathologische Core laboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
