Summary
El protocolo muestra el uso de la examinación histopatológica e inmunohistoquímica al perfil el macrófago de beta del receptor de folato y su relación con el total de la célula inmune infiltran en las biopsias de arteria temporal en la arteritis de células gigantes.
Abstract
Arteritis de células gigantes (ACG) es una mediada inmune enfermedad crónica de las arterias de tamaño mediano a grande que afecta a los adultos mayores. GCA se manifiesta con síntomas oclusivos de dolores de cabeza y artritis, movimiento o pérdida de la visión. Linfocitos T-helper y macrófagos infiltran la pared vascular y producen una respuesta pro-inflamatorias que conducen a daño a los vasos e isquemia. Hasta la fecha, no hay ningún biomarcador GCA que puede monitorear la respuesta terapéutica guía y actividad de la enfermedad.
Beta del receptor de folato (FRB) es una proteína glicosilfosfatidilinositol anclada en las membranas celulares y normalmente se expresa en la estirpe mielomonocítica y en la mayoría de las células de la leucemia mieloide, así como en el tumor y los macrófagos sinoviales reumatoides, donde su expresión se correlaciona con la severidad de la enfermedad. La capacidad de FRB compuestos de ácido fólico, ácido fólico-conjugados y fármacos antifolatos ha hecho un blanco druggable en cáncer y la investigación de la enfermedad inflamatoria. Este informe describe los métodos histopatológicos e immunohistochemical para evaluar la expresión y distribución de FRB en lo referente a GCAimmunopathology.
Las biopsias de arteria temporal fijados con formol y embebido en parafina de ACG y controles normales fueron teñidas con hematoxilina y eosina para revisar la histología del tejido e identificar características patognomónicas. Immunohistochemistry fue utilizado para detectar expresión de FRB, CD68 y CD3. Se realizó un análisis microscópico para cuantificar el número de células teñidas positivamente en 10 secciones de campo de alta potencia seleccionadas y sus respectivas ubicaciones en la pared arterial.
Inflamación lymphohistiocytic (LH) acompañada de hiperplasia intimal y lámina elástica interrumpido fue visto en GCA con ninguno en los controles. El infiltrado de LH fue compuesto de aproximadamente 60% linfocitos y 40% macrófagos. Expresión de FRB se restringió a los macrófagos, que comprende el 31% de la población de macrófagos CD68 + total y localizada a la media y adventicia. No FRB se observó en los controles.
Este protocolo demostró un patrón numérico y espacial distinto del macrófago FRB en relación con el microambiente inmunológico vascular en ACG.
Introduction
Arteritis de células gigantes (ACG) es una enfermedad inflamatoria de las arterias medianas a grandes, dirigidos a la aorta y sus ramas y que afectan a los adultos mayores. Presenta leves a severas complicaciones isquémicas tales como dolores de cabeza, dolor de mandíbula, pérdida de la visión, movimiento y tejidos gangrena. La diagnosis es confirmada por altos marcadores inflamatorios como tarifa de sedimentación de eritrocito (ESR) y un patrón histopatológico distinto en la biopsia (ficha) de arteria temporal1. GCA es la vasculitis más común de adultos, y la accesibilidad de la arteria temporal obtenida para diagnóstico presenta una ventaja sobre otros vasculopathies, así que permiten estudiar más fácilmente su patogenesia. Los resultados típicos en ficha incluyen un infiltrado de macrófagos/histiocitos y linfocitos T encontrados todas las capas vasculares de la intima del tunica, media y adventicia con simultánea destrucción de la lámina elástica que normalmente separa estos compartimientos de2. La evidencia actual demuestra que GCA implica un antígeno desconocido que activa las células dendríticas en la adventicia vascular, seguido por la contratación de ayudante células de T (Th), subtipos específicamente Th1 y Th17 que secretan interleucina-17 y interferón-gamma (IFG) respectivamente. IFG y recluta y activa los macrófagos para producir citocinas y proteasas. Estos incluyen las citoquinas pro inflamatorias; incluyendo la IL-12, que recíprocamente activa Th1 células proporcionando así un bucle de retroalimentación positiva; factor de necrosis tumoral y la interleucina-6, que causa la artritis y fiebres y metaloproteasas que dañan la lámina elástica. Glucocorticoides (GC), que constituyen la terapia crónica estándar, controlan parcialmente las vías del cytokine atenuando la Th17/IL-17, pero no el brazo Th1/IFG de la respuesta inmune3,4. Desafortunadamente, discontinuación de la GC resulta en recaída de la enfermedad. Como una modalidad alternativa, metotrexato ha sido repurposed para el tratamiento de la GCA y los puntos finales clínicos deseados no siempre lograron aunque biomarcadores más sensibles no han sido utilizados para el monitoreo terapéutico5,6 . En 2017, el bloqueador de interleucina 6, tocilizumab, era aprobado para el tratamiento de ACG como demostró con eficacia control de la enfermedad y esteroides sparing efectos7,8.
Hasta la fecha, no hay ninguna buena biomarcadores para GCA. Como resultado, es difícil supervisar actividad de la enfermedad y valorar la dosis de fármacos disponibles para evitar los efectos adversos y reducir la carga de costo a la sociedad. Por lo tanto, es imperativo buscar un biomarcador de candidato que se correlaciona con la actividad de la enfermedad, proporcionar nuevos conocimientos sobre patogénesis y ayuda en las decisiones terapéuticas.
La desregulación de la activación de los macrófagos es un factor crítico en la patogénesis de la GCA. Así, puede ser un medio eficaz de tratar la GCA la focalización selectiva de macrófagos activados. La beta del receptor del folato (FRB) es una glicoproteína de glicosil-fosfatidilinositol que está anclada en la membrana de la célula expresados en células myelomonocytic normal, las células de la leucemia mieloide y activa los macrófagos. Su ligando, el ácido fólico es una vitamina esencial en su forma reducida, que permite que celular DNA síntesis, reparación y metilación del9. FRB expresión es inducida en la enfermedad autoinmune y durante la carcinogénesis. Su expresión se limita a la superficie de monocitos o macrófagos pro-inflamatorias de M1 en la artritis reumatoide o a antiinflamatorios macrófagos M2 en órganos sólidos y malignidades mieloides10,11,12 , 13. Además de su papel potencial como un biomarcador de macrófagos activados, la unidad FRB puede habilitar el transporte de droga selectiva a través de un proceso de múltiples paso que comienza con el atascamiento del receptor para ácido fólico, antifolates o medicamentos conjugados con ácido fólico en la célula superficie, seguida de la internalización, la liberación y la eventual entrega de droga deseada a la interna de la célula maquinaria12,14,15,16. En contraste con FRB expresado en las células cancerosas y activa macrófagos, FRB expresado en las células hematopoyéticas normales es incapaz de enlazar folatos garantizando que FRB/folato-mediado entrega de la droga se limita a FRB-positiva inflamatoria o las células cancerosas.
En nuestro estudio anterior, demostramos por primera vez que FRB se expresa en los macrófagos de la GCA y su expresión correlaciona con CD68 + y endotelina macrófagos de receptores beta, que contribuyen a la patogénesis de GCA17. En este informe, describimos el histopatológico y métodos inmunohistoquímicos utilizan para evaluar el macrófago de la FRB y analizan el total de linfocitos y macrófagos cuenta para ganar la penetración en la posición de la FRB en el paisaje vascular GCA.
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Protocol
Todos los métodos descritos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional del estado de Penn.
1. histopatológico preparación y procesamiento después de obtener la biopsia de arteria Temporal
Nota: La biopsia de arteria temporal (ficha) se realiza bajo anestesia local y las condiciones de esterilidad por un cirujano certificado. Tras obtener quirúrgicamente una sección arterial de 3 cm en el lado más afectado, la muestra fijada en formalina inmediatamente por 24 h, dividida en secciones de 3 a 4 mm y embebida en parafina, prestando especial atención a la alineación correcta de tejido en el bloque que se almacena a temperatura ambiente. Selección de la muestra se realiza después de verificar los informes médicos. El diagnóstico se basa en el Colegio Americano de Reumatología 1990 criterios que requiere que sujetos cumplan 3 de los 5 dominios: edad > 50 años, nuevo dolor de cabeza, sensibilidad de la arteria temporal, una eritrosedimentación > 50 mm/hora por el método de Westergren y una pestaña anormal. Por seguridad, deben llevarse guantes de protección en todo momento al manipular las muestras, productos químicos y los anticuerpos.
- De los bloques integrados, cortar secciones de 4-5 μm espesor utilizando un micrótomo. y tinción con hematoxilina y eosina (H & E). Utilice una sección de control de tejido normal seleccionado para el aseguramiento de la calidad.
- Flotador cortar secciones en un baño de agua caliente calentada a 40 ° C para eliminar las arrugas y recoger con una diapositiva microscópica de vidrio revestido. Coloque el portaobjetos sobre una placa caliente en un horno de 60 ° C durante 60 minutos facilitar el secado y el cumplimiento de la sección de la diapositiva.
- Coloque el portaobjetos sobre una placa caliente en un horno de 60 ° C durante 60 minutos facilitar el secado y el cumplimiento de la sección de la diapositiva.
- 3 secciones de montaje en portaobjetos.
- Coloque los portaobjetos en un bastidor vertical y seque durante la noche a 37 ° C durante 24 h.
- Coloque los portaobjetos en un recipiente y conservar a 4 ° C.
2. Immunohistochemical preparación, desparafinado, recuperación de antígeno y tinción15,18,19,20
- Cargue los portaobjetos en una parrilla. Ejecutar la rejilla a través de platos como sigue: dos veces en xileno 100% durante 5 minutos con 10 segundos de agitación suave cada 30 segundos, una vez en 100% de etanol con agitación 10 segundos, una vez en el 90% de etanol con agitación 10 segundos, en etanol al 70% con agitación 10 segundos , y doble dos veces en agua destilada H2O con agitación de 10 segundos.
Nota: Manejo de xileno y acetona debe hacerse en campanas de ventilación para evitar la inhalación y la toxicidad respiratoria. - Recuperar el antígeno mediante la transferencia de la parrilla en un recipiente de cristal con 200 mL de 10 mmol/L, pH tampón citrato 6.0 precalentado a 95 ° C. Ajustar el temporizador de 30 minutos en el baño de agua, luego enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego enjuague con agua corriente durante 5 minutos.
- Eliminar actividad de peroxidasa endógena por incubación en 200 mL de peróxido de hidrógeno 3% durante 10 minutos. Lave el portaobjetos 3 veces en 200 μL de solución salina tamponada con Tris (TBS).
- Quite las diapositivas de la rejilla y frote cada una suavemente para eliminar el exceso de tampón. Para la tinción, añadir 200 μL de los siguientes anticuerpos primarios, añadir cubreobjetos en portaobjetos e incubar en cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente:
Anticuerpo anti-FRB diluido 1: 800
Humano anticuerpo monoclonal de ratón CD68, dilución 1: 200
Dilución de 1: 100 de anti-CD3 policlonal de conejo
Nota: Formalina-fijo secciones parafina-encajadas de la placenta también se procesaron como se describe en pasos 2.1 a 2.9 e incubados con anti-FRB18 y utilizadas como control positivo. Resultados de tinción fueron obtenidos por encontrar la concentración óptima del anticuerpo y fue realizada por valorar el anticuerpo en diluciones dobles (e.g. 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1:1600). - Quite el cubreobjetos después de la incubación y descarte. Enjuague los portaobjetos durante 2 minutos con TBS 3 veces, drene y limpie el exceso de tampón.
- Añadir 200 μL de solución de anticuerpo secundario biotinilado anticuerpo secundario de ratón-anti-conejo para reaccionar con el anticuerpo primario no conjugado a antígeno tisular. Coloque el cubreobjetos en portaobjetos e incubar en cámara húmeda durante 45 minutos a temperatura ambiente.
- Quite el cubreobjetos después de la incubación y descarte. Enjuague los portaobjetos durante 2 minutos con TBS 3 veces, drene y limpie el exceso de tampón.
- Añadir 200 μL de diaminobenzidina (DAB) + buffer sustrato (imidazol HCl)-sistema cromógeno e incubar 10 minutos a visualizar el patrón de coloración. Lavado con TBS luego en chorro del grifo durante 10 minutos.
- Contratinción con hematoxilina durante 3 minutos.
- Montar las diapositivas aplicando 70 μl de medio de montaje a la superficie de la diapositiva. Lentamente incline el cubreobjetos en el medio de montaje y evitar crear burbujas como bajarlo en su lugar. Espere 24 horas para secarse.
3. histopatológico y análisis inmunohistoquímico (IHQ)
Examinar la H & E y IHC manchado secciones de GCA normales y positivas los temas usando un microscopio de luz.
-
Para la H & E tinción de secciones:
- Evaluar la arquitectura vascular e identificar las células endoteliales en la intima del tunica, células de músculo liso en la túnica media y los fibroblastos y vasa vasorum en la túnica adventicia21,22.
- Identificación de las características de la GCA, que incluyen linfocitos y macrófagos/histiocitos infiltración, hiperplasia celular y degradación de la lámina elástica interna.
- Analizar el lymphohistiocytic infiltra por identificar y cuantificar el número de macrófagos en relación a los linfocitos. Evaluar el grado de interrupción de la lámina elástico interna y hyperplastic cambios en células residentes y comparar con controles.
-
Para el IHC secciones manchada:
- Examinar el patrón de coloración de la FRB, tomando nota de su expresión por un determinado tipo o tipos de células y su distribución dentro de las capas vasculares y su relación a la infiltración inmunitaria total, el marcador de macrófagos total, anti-CD68 y el pan marcador de linfocitos anti CD3.
- Cuantificar la expresión de células de FRB, CD68 y CD3 contando las células teñidas positivamente en 10 varios campos seleccionados al azar de alto poder (hpf) y registrar los medios.
Nota: Identificación de estas células normales y patológicas y las estructuras fueron realizadas por un patólogo cardiovascular certificado (J.M.) y reumatólogo (S.A.A.) y los resultados se registraron en todos los casos. - Captura de imágenes representativas con una cámara digital.
Nota: Después de estos pasos restantes alícuotas pueden ser almacenadas a-80 ° C.
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Representative Results
Resultados histopatológicos
La H & E mancha en anatomía arterial normal demostrada muestras normales con células endoteliales en la intima del tunica, células de músculo liso en la túnica media, y una matriz de colágeno heterogéneos que incluyen fibroblastos y alimentador vasos llamados vasa vasorum en el adventitia de tunica. Hay no hay infiltrado inflamatorio identificado. Arterias temporales positivas GCA demostraron moderada a severa inflamación con agregados de macrófagos/histiocitos, linfocitos, ocasionalmente células plasmáticas y células gigantes multinucleadas. Estrechamiento luminal fue observado y acompañado por interrupción íntima de espesamiento y el 90% de la lámina elástica interna (figura 1).
Resultados immunohistochemical
Linfocitos CD3 + y macrófagos CD68 + estaban presentes en todos los especímenes de GCA + y demostraron similares patrones de coloración en todas las biopsias. Los linfocitos predominaron sobre los macrófagos con una relación de CD3/CD68 de 1.6. Coloración para FRB se restringió a los macrófagos y células gigantes multinucleadas que preferentemente localizaron en la adventicia y la media (tabla 1 y figura 2). Control muestras mostraron leucocitos mínimo (< 5 células/alta potencia campo) y ninguna expresión de la FRB.
Figura 1: H & E imágenes de arterias temporales. (A) representante de H & E imagen de una arteria temporal normal con capas distintas del adventitia de tunica (t), la media y la intima de la más externa a más interna/Luminal lado respectivamente. Tenga en cuenta la red de colágeno y la vasa vasorum de la adventicia (flechas gruesas), las células de músculo liso en los medios (flechas delgadas) y las células endoteliales de la íntima (10 aumentos). (B) una micrografía agrandado de la interfaz de íntima-media es resaltada en el recuadro rectangular en el A y está separada por la lámina elástica interna (flecha) (20 aumentos). Imagen (C) representante de H & E de un TA con arteritis de células gigantes marcado por transmural lymphohistiocytic infiltra (flechas gruesas), hiperplasia intimal y destrucción de la lámina elástica interna (flecha) (10 aumentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la coloración de Immunohistochemical de arterias temporales con arteritis de células gigantes. Imágenes representativas (A) demuestran un infiltrado inflamatorio extenso con CD68 positivo macrófagos y células gigantes (flechas) sobre todo en la media y adventicia (10 aumentos). (B) beta del receptor de folato (FRB) fue expresado selectivamente en los macrófagos activados (flechas) (10 aumentos). Imagen tomada en una energía más alta demostró macrófagos positivos FRB en (C) y CD68 macrófagos positivos en (D) (x 100 aumentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Temas de GCA (n = 5) | Media (±SD) |
| CD3 (% del infiltrado inmune) | 61,7 ± 4.1 |
| CD68 (% del infiltrado inmune) | 38,3 ± 4.1 |
| CD68 histiocitos/macrófagos (células/hpf) | 34,8 ± 10.4 |
| FRB + macrófagos (células/.hpf) | 10.8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12,7 |
Tabla 1: Resumen de expresión FRB, CD68 y CD3.
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Discussion
GCA es la vasculitis más común en adultos, y su seña de identidad patológica ejemplifica una potente combinación de linfocitos del ayudante T y activa los macrófagos que se encuentran también en otras enfermedades granulomatosas o vasculopathies como sarcoidosis y polyangiitis granulomatosa2,3. En ACG, la arteria temporal proporciona una buena representación de una arteria de tamaño mediano a grande y la biopsia TA da una muestra de tamaño considerable que puede almacenarse en bloques de parafina durante años, creando así oportunidades para el estudio de las funciones de los emergentes diagnóstico y dianas terapéuticas como FRB en el microambiente vasculitic. Tomamos la ventaja presentada por tejido accesible y immunopathologic estándar métodos para preguntar si la unidad FRB puede analizarse confiablemente a través de la IHQ. Nuestros resultados demuestran que la histopatología y la IHQ pueden servir como herramientas valiosas no sólo para confirmar el diagnóstico y el grado de daño vascular, sino también validar el papel de subtipos diferentes de macrófagos en ACG.
La histopatología y métodos IHC son intensivos de mano de obra y requieren de las habilidades del técnico histoquímico, patólogo y reumatólogo, pero las técnicas han sido bien establecidas y pueden servir como una plataforma de lanzamiento para el uso de otros métodos tales como Citometría de flujo y de la inmunofluorescencia. La desventaja de estos métodos, sin embargo, es la necesidad de tejido fresco congelado que requiere colección prospectiva. La IHC, junto con la examinación histopatológica, es inestimable en la presentación de una perspectiva panorámica del microambiente inmunológico vascular que se puede acceder repetidamente y analizado especialmente con la aparición de nuevas proteínas como la FRB. La hematoxilina y eosina (H & E) tinción permite revisar la histología del tejido. La hematoxilina tiñe el núcleo y destaca los detalles nucleares mientras que la eosina es un contraste que ayuda a demostrar las diferencias entre las características citoplasmáticas y nucleares. El uso de una sección de control de tejido normal seleccionado es esencial para evaluar el aseguramiento de la calidad.
La IHQ detecta el antígeno de interés en tejidos congelados o fijados con formol y embebido en parafina mediante el uso de múltiples anticuerpos que son visualizados por microscopia. El protocolo descrito fue adaptado de van der Heijden et al.15, quienes han demostrado expresión de FRB en macrófagos sinoviales de artritis reumatoide. Los pasos esenciales de IHC incluyen preparación de tejido, desparafinado/parafina, recuperación de antígeno y tinción23. Es esencial para asegurar que el tejido extraído al paciente inmediatamente se fija en formol y tejido alineación y orientación meticulosamente preservados cuando fijadas en parafina. El tejido fino se secciona con el uso de un microtomo y somete a un paso de desparafinado que requiere múltiples lavados en xileno, etanol y agua. El siguiente paso, llamado recuperación de antígeno, es necesaria para romper los vínculos de metileno formados durante la fijación con formol y requiere un búfer de citrato y calor húmedo. Las diapositivas son tratadas con peróxido de hidrógeno para bloquear las enzimas peroxidasa endógena que pueden interferir con la detección de antígeno. El procedimiento de tinción se realiza a continuación incubar los portaobjetos con los anticuerpos primarios diluidos que se unen al antígeno de interés seguida aplicando un anticuerpo secundario que detecta la reacción antígeno-anticuerpo primario. Esto es seguido por etiquetar con un cromógeno DAB-substrato que forma un pigmento marrón que se visualiza al microscopio. El paso final es el montaje cuidadoso del tejido con una solución permanente, asegurándose de que no hay sustancias que interfieran como burbujas se forman entre el cubreobjetos y la superficie. Las modificaciones del protocolo requerido para acomodar el uso del tejido arterial. Puesto que el estudio fue el primero en evaluar FRB en ACG, la concentración óptima del anticuerpo era desconocida y necesita múltiples diluciones al 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1:1, 600, 1:3200 con la mejor coloración de calidad en la señal o ruido de fondo más bajo alcanzado en 1: 800.
El FRB asociada a la membrana anterior fue validada por Ross et al.18,24 y fue encontrado para ser expresado en células de la placenta normales, neutrófilos, ráfagas leucémicas en leucemia mielógena crónica, leucemia promielocítica poblaciones de Myeloblast de myelomonocytic y erythroleukemias y variable en la leucemia mieloide aguda M1/M2. El anticuerpo policlonal de conejo purificados por afinidad específico para FRB utilizado en estas primeras obras ya se han aplicado a los estudios de artritis reumatoide positivo macrófagos sinoviales y tumores de órganos sólidos. El anticuerpo de FRB usado en este Protocolo no está comercialmente disponible y puede obstaculizar una aplicación amplia. Concebible, la metodología aquí descrita también puede funcionar para otros anticuerpos FRB pero requerirá optimización individual antes de su uso en números más grandes. Puesto que FRB se expresa notablemente en placenta, este tejido se ha utilizado repetidamente como control positivo.
El diseño del estudio fue limitado por un tamaño de muestra pequeño y requiere validación en números más grandes de pestañas ideal obtenidos en etapas tempranas y tardías de ACG. Además, puesto que el macrófago FRB puede servir como un objetivo potencial diagnóstico y terapéutico con agentes conjugados fólico y antifolates, los datos obtenidos aquí apoyan la necesidad de examinar más lejos fenotipo FRB en el contexto de macrófagos M1 y M2 polarización. Con respecto a otros diagnósticos, estos resultados abierto oportunidades no imagen invasivos con ácido fólico de FRB dirigido conjugan SPECT de animal doméstico proyección de imagen a agentes. Además, dado que la infiltración de macrófagos es un sello de progresión de la enfermedad y actividad en aterosclerosis, esclerodermia, sarcoidosis y artritis reumatoide, el uso de este protocolo puede encontrar aplicaciones en estas condiciones.
Este es el primer protocolo para explorar la expresión y distribución de la unidad FRB en ACG. El CCI permite una panorámica transversal y múltiples vistas de la TA y permite el análisis de las relaciones numéricas entre el infiltrado inmune y el microambiente arterial. La unidad FRB compuesto por 30% de los macrófagos total que se infiltró en todas las capas de la pared vascular, pero curiosamente, la unidad FRB no fue encontrada en la intima y localizada sólo en la adventicia y la media. Este patrón de distribución puede revelar nuevas ideas sobre tropismo de macrófago de FRB para la composición de colágeno diferencial encontrada en los medios y capas adventitial25. El infiltrado inmune consistió en cerca de 60% linfocitos (medida por el pan-linfocito marcador anti-CD3) y 40% macrófagos (marcados por el marcador anti-CD68 de macrófagos de pan). Un estudio reciente correlacionó CD3 con una mayor sensibilidad para el diagnóstico de GCA mientras otro había ligado CD68 expresión mayor actividad de la enfermedad. Por lo tanto, proponemos que el ambiente inmune vascular temprano de GCA comienza con una relación de 60: 40 de linfocitos: macrófagos con 30% de los macrófagos siendo FRB positivo. Si esto es válido para y consistentemente demostrado en pacientes con enfermedad temprana debe ser más experimentos validados en el futuro y prospectivos. Si esta distribución del infiltrado celular mantiene constantemente, entonces pueden servir como compuestos de biomarcadores para la actividad de la enfermedad de GCA.
En conclusión, este protocolo demostró por primera vez la presencia de infiltración de FRB en la media y adventicia de arterias temporales en ACG. Macrófagos de FRB representados un tercio de la población total de macrófagos en un temprano y microambiente de GCA activa compuesta por macrófagos linfocitos y 40% 60%.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue posible gracias al apoyo del Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, la división de Reumatología del Departamento de medicina y la Molecular y laboratorio de base histopatológica, Penn estado Colegio de medicina de la Universidad, Hershey PA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
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