Summary
프로토콜은 조직 검사 및 immunohistochemistry folate 수용 체 베타 macrophage와 총 면역 세포와의 관계는 거 대 세포 동맥 생 검 측 두 엽 동맥에에서 침투 하는 프로 파일의 사용을 보여 줍니다.
Abstract
거 대 세포 동맥 (GCA) 만성 면역 중재 매체-큰 크기의 동맥의 영향을 미치는 질병 노인 이다. GCA 매니페스트 관절염과 두통의 폐색 증상, 뇌졸중 또는 손실 비전. 대 식 세포 및 T-헬퍼 세포 혈관 벽에 침투 하 고 선박 손상 및 허 혈 이어질 프로 염증 반응을 생산. 날짜 하려면, 아무 GCA 바이오 마커 질병 활동 및 가이드 치료 응답을 감시할 수 있는 있다.
Folate 수용 체 베타 (FRB)는 glycosylphosphatidylinositol 단백질을 세포 막에 정박 하 고 일반적으로 myelomonocytic 혈통 및 또한 종양 및 류 마티스 활 액 세포, 골수성 백혈병 세포의 대부분을 표현 어디의 식을 질병의 심각도와 상관 한다. FRB의 능력 화합물 엽 산, 엽 산-어원이 같은 말 및 antifolate 마약을 했다 druggable 대상을 암 및 염증 성 질환 연구. 이 보고서 식 및 GCAimmunopathology에 관하여 FRB의 배포를 평가 하는 데 사용 하는 조직 및 immunohistochemical 방법을 설명 합니다.
GCA 및 일반 컨트롤에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 및 측 두 엽 동맥 biopsies Hematoxylin 및 오신 조직 조직학을 검토 하 여 pathognomonic 기능 스테인드 했다. Immunohistochemistry는 FRB, CD68 CD3 식 감지 하 사용 되었다. 현미경 분석 척도 10 선택 된 고 전력 필드 섹션 및 동맥 벽에 그들의 각각 위치에 긍정적으로 얼룩진된 셀의 수를 수행 했다.
Lymphohistiocytic (LH) 염증 내 증식 동반 및 방해 탄력 있는 lamina 컨트롤에 없음 GCA에 보였다. LH 침투는 약 60% 40%와 세포 대 식 세포의 구성 되었다. FRB 식 세포, CD68 + macrophage 총인구의 31%를 구성 하 고 미디어와 adventitia로 제한 했다. 아니 FRB 컨트롤에서 보였다.
이 프로토콜 GCA에 혈관 면역 microenvironment 기준으로 FRB macrophage의 고유한 숫자 및 공간 패턴을 보여주었다.
Introduction
거 대 세포 동맥 (GCA)의 매체-큰 동맥, 대동맥 및 그것의 분 지를 대상으로 하 고 노인에 영향을 미치는 염증 성 질환 이다. 그것은 온화한 두통, 턱 통증, 시력 손상, 뇌졸중과 조직 괴 저 등 심각한 허 혈 성 합병증을 선물 한다. 진단은은 적혈구 침 강 속도 (ESR)와 측 두 엽 동맥 생 검 (탭)1에 별개 조직 패턴 같은 높은 염증 성 마커에 의해 확인 된다. GCA는 가장 일반적인 성인 맥 고 진단에 대 한 얻은 측 두 엽 동맥의 내게 필요한 옵션 하나 더 쉽게 그것의 병 인 연구를 활성화 하는 다른 vasculopathies에 비해 우위를 선물 한다. 탭에 일반적인 연구 결과 세포/histiocytes 및 일반적으로이 구분 하는 탄력 있는 lamina의 동시 파괴 tunica intima, 미디어, 그리고 adventitia의 모든 혈관 층에 걸쳐 발견 하는 T 세포의 침투를 포함 구획2. 도우미의 채용 다음 T (Th) 세포, 특히 Th1과 Th17 하위 인터 루 킨-17 분 비는, 현재 증거 보여줍니다 GCA 혈관 adventitia에 수지상 세포를 활성화 하는 알 수 없는 항을 포함 하 고 인터페론-감마 (IFG) 각각. IFG 다음 신병 고 cytokines 및 프로 테아 제를 생산 하는 세포를 활성화 합니다. 이러한 프로 염증 성 cytokines; 포함 IL-12, 상호 긍정적인 피드백 루프; 제공 Th1 세포 활성화를 포함 하 여 종양 괴 사 인자와 인터 루 킨-6, 관절염과 열과 metalloproteases는 원인이 손상 탄력 있는 lamina. 스테로이드 제제 (GC), 표준 만성 치료를 구성 하는 부분적으로 약하게 Th17/IL-17 하지만 면역 반응3,4의 Th1/IFG 팔 하지 여 cytokine 경로 제어 합니다. 불행히도, GC의 중지 질병 재발 발생합니다. 대체 양식 적임으로 토트 GCA 치료 용도가 변경 하지만 더 민감한 생체 치료 모니터링5,6에 대 한 활용 하지는 않지만 원하는 임상 끝점 일관 되 게 달성 하지 했다 . 2017 년, 인터 류 킨 6 차단기, tocilizumab, 같이 그것은 효과적으로 질병 관리 및 스테로이드 효과7,8살려주는 GCA의 치료를 위해 승인 되었다.
날짜 하려면, GCA에 대 한 더 좋은 생체 있다. 결과적으로, 그것은 질병 활동을 모니터링 하 고 부작용을 방지 하 고 사회 비용의 부담을 줄이기 위해 사용할 수 있는 약물의 복용량을 적정 어렵다. 따라서, 질병 활동 상호 병 인 및 치료 결정에 있는 원조에 새로운 통찰력을 제공 하는 후보 biomarker에 대 한 보고는 것이 필수적 이다.
대 식 세포 활성화의 dysregulation GCA 병 인에 중요 한 요소 이다. 따라서, GCA 치료의 효과적인 수단 활성화 된 대 식 세포의 선택적 대상 수 있습니다. Folate 수용 체 베타 (FRB)는 세포 막에 정박 glycosyl phosphatidylinositol 당단백질 정상적인 myelomonocytic 셀, 골수성 백혈병 세포에에서 표현 하 고 대 식 세포를 활성화. 그것의 ligand, 엽 산, 세포질 DNA 합성, 메 틸 화 및 수리9수 감소 형태로 필수적인 비타민 이다. 자가 면역 질환 및 발암 중 FRB 식이 유도 된다. 그 식이 고체 기관 및 골수성 악성10,,1112 monocytes 또는 류 마티스 관절염, 프로-염증 성 M1 세포의 표면에 또는 항 염증 제 M2 세포에 제한 , 13. 활성화 된 대 식 세포의 biomarker로 그것의 잠재적인 역할, FRB는 엽 산, antifolates 또는 셀에서 folate 활용 약물 수용 체 바인딩으로 시작 하는 다단계 프로세스를 통해 선택적 약물 전송 가능 표면, 국제화, 릴리스 및 내부 셀 기계12,14,,1516원하는 약물의 최종 배달 합니다. 대조적으로 FRB 암 세포에 표현 하 고 대 식 세포 활성화, 정상 조 혈 세포에 표현 하는 FRB는 FRB/엽 산 중재 약물 전달 FRB 양성 염증 성 또는 암 세포가 되도록 folates 바인딩할 수.
우리의 이전 연구에서 우리는 FRB GCA 대 식 세포에 표현 되는 처음으로 시연 하 고 표현 연관 CD68 + 및 endothelin 수용 체 베타 세포, GCA pathogenesis17을. 이 보고서에서 우리는 histopathological 설명 및 immunohistochemical 방법 FRB macrophage를 평가 하는 데 사용 총 림프 구 분석 그리고 macrophage GCA 혈관에 FRB의 위치에 대 한 통찰력을 얻기 위해 계산.
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Protocol
설명 된 모든 방법은 펜 주 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
1. histopathological 준비, 그리고 측 두 엽 동맥 생 검 후 처리
참고: 측 두 엽 동맥 생 검 (탭) 로컬 마 취 및 무 균 상태에서 인증 된 외과 의사에 의해 수행 됩니다. 후 수술 더 영향을 받는 쪽에 3 cm 동맥 섹션, 표본 즉시 24 h에 대 한 포 르 말린에 고정, 3 ~ 4 m m 섹션으로 나누어 이며 파라핀, 조직 블록에 적절 한 맞춤에 주의 깊은 관심을 지불에 포함 된는 다음 상 온에 저장 됩니다. 견본 선택 진료 기록을 확인 한 후 수행 됩니다. 진단은 류 마티스 1990 기준의 과목 3 5 도메인의 충족을 요구 하는 미국 대학에 기반: 나이 > 50 년, 새로운 두통, 측 두 엽 동맥 부드러움, 적혈구 침 강 속도 > 50 mm/시간 Westergren 메서드에서 비정상적인 탭입니다. 안전을 위해, 보호 장갑을 착용 해야 합니다 항상 표본, 화학 물질과 항 체를 처리 하는 경우.
- 포함 된 블록에서는 톰을 사용 하 여 4-5 µ m 두꺼운 섹션을 잘라. 그리고 얼룩 Hematoxylin와 오신 (H & E). 품질 보증에 대 한 선택 된 정상 조직의 제어 섹션을 사용 합니다.
- 플 로트 따뜻한 물 목욕에 대 한 섹션을 잘라 주름 제거와 코팅된 유리 현미경 슬라이드를 데리 러 40 ° C에가 열. 유리 슬라이드 건조 및 슬라이드 섹션의 준수를 촉진 하기 위하여 60 분 동안 60 ° C 오븐에서 따뜻한 접시에 놓습니다.
- 유리 슬라이드 건조 및 슬라이드 섹션의 준수를 촉진 하기 위하여 60 분 동안 60 ° C 오븐에서 따뜻한 접시에 놓습니다.
- 현미경 슬라이드에 3 섹션을 탑재 합니다.
- 37 ° C에서 24 h 건조 하룻밤에 수직 랙 슬라이드를 놓습니다.
- 컨테이너에 4 ° c.에 게 슬라이드를 배치
2. Immunohistochemical 준비, Dewaxing, 항 원 검색 및15,18,,1920 얼룩
- 슬라이드 랙 슬라이드를 로드 합니다. 요리를 통해 랙을 다음과 같이 실행: 10 초의 부드러운 동요 10 초 동요와 함께 70% 에탄올에 한 번 10 초 동요와 90% 에탄올에 한 번 10 초 동요와 함께 100% 에탄올에 한 번 30 초 마다 5 분 동안 100% 크 실 렌에 두 번 두 번에 더블 10 초 동요와 H2O를 증 류 하는 고.
참고: 크 실 렌과 아세톤의 처리는 흡입과 호흡기 독성을 피하기 위해 환기 후드에서 행해져야 한다. - 랙 10 mmol/L, pH 6.0 구 연산 염 버퍼 95 ° c.에 prewarmed의 200 mL와 함께 유리 용기에 전송 하 여 항 원 검색 물 욕조에 30 분 동안 타이머를 설정 후 20 분 후 5 분 동안 실행 하는 물으로 씻어 실 온에서 냉각.
- 10 분 동안 3%의 과산화 수소의 200 mL에 배양 하 여 내 인 성 과산화 효소 활동을 제거 합니다. Tris 버퍼 염 (TBSS)의 200 µ L에 슬라이드 3 번을 씻어.
- 랙에서 슬라이드를 제거 하 고 부드럽게 닦아 초과 버퍼에 각 하나 줘 봐. 얼룩, 추가 다음 주 항 체의 200 µ L 커버 슬립 슬라이드에 추가 하 고 실 온에서 1 시간 동안 습 실에서 품 어.
안티-FRB 항 체 희석 1:800
단일 클로 널 마우스 안티 인간 CD68, 1: 200 희석
Polyclonal 토끼 안티-CD3 1: 100 희석
참고: 포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 부분의 태 또한 2.9 및 안티-FRB18와 incubated 단계 2.1에 명시 된 대로 처리 되었고 긍정적인 통제로 사용. 얼룩 결과 최적의 항 체 농도 찾는 하 여 가져온와 두 배 희석 (1시 50분, 1: 100, 1: 200, 1:400, 1:800, 1:1600)에서 항 체를 titrating에 의해 수행 됐다. - 부 화 후 폐기 커버 슬립을 제거 합니다. TBSS 각 2 분 동안 3 번 슬라이드를 린스, 배수 및 초과 버퍼를 닦아.
- 조직 항 원에 바인딩된 결합형된 기본 항 체와 반응 biotinylated 안티 Rabbit/마우스 이차 항 체를 포함 하는 이차 항 체 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. Coverslips 슬라이드에 배치 하 고 실 온에서 45 분 동안 습 실에서 품 어.
- 부 화 후 폐기 커버 슬립을 제거 합니다. 슬라이드 3 번 TBS 각 2 분 동안 린스, 배수와 초과 버퍼를 닦아.
- Diaminobenzidine (한 덩어리) + 기판 버퍼 (이미 HCl)의 200 µ L 추가-chromogen 시스템 및 얼룩 패턴을 시각화 하는 10 분 동안 품 어. 씻어 TBSS 다음 10 분 동안 실행 하는 수돗물에.
- 3 분으로 되며 counterstain.
- 슬라이드의 표면에 장착 매체의 70 µ L을 적용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다. 천천히 설치 매체에 coverslip 팁 고로에 낮은 거품을 만들지 마십시오. 건조 24 시간 기다립니다.
3. 조직 및 Immunohistochemical (IHC) 분석
H & E와 IHC 스테인드 GCA 긍정적이 고 정상적인 과목 가벼운 현미경을 사용 하 여 섹션을 검사 합니다.
-
H 조 & 전자에 대 한 스테인드 섹션:
- 혈관 아키텍처를 평가 하 고 tunica 매체, 및 섬유 아 세포에서 평활 근 세포와 tunica adventitia21,22바사 vasorum tunica intima에 내 피 세포를 식별 합니다.
- 림프 구 및 대 식 세포/histiocyte 침투, 세포 증식, 내부 탄력 있는 lamina 저하 GCA 기능을 식별 합니다.
- Lymphohistiocytic 침투 식별 하 고 세포를 기준으로 대 식 세포의 수를 측정 하 여 분석 합니다. 내부 탄력 있는 lamina 중단 및 주민 셀과 변경의 정도 평가 하 고 컨트롤과 비교 합니다.
-
IHC 스테인드 섹션에 대 한:
- FRB, 총 면역 침투, 총 대 식 세포 마커, 안티-CD68, 그리고 팬을 특정 유형 또는 종류의 세포와 혈관 레이어와 관계 내에서 분포는 식의 노트를 복용의 얼룩 패턴 검사 림프 구 마커 CD3 안티.
- 여러 개의 무작위로 선택 된 고성능 필드 (hpf) 10에 긍정적으로 얼룩진된 셀을 계산 하 여 FRB, CD68 CD3 셀 식 계량 하 고 수단을 기록 합니다.
참고: 이러한 정상적이 고 pathologic 셀 및 구조 식별 인증된 심장 병리학 자 (J.M.)에 의해 수행 했다 고 즘 (S.A.A.) 및 결과 모든 경우에 대 한 기록 했다. - 디지털 카메라를 사용 하 여 대표 이미지를 캡처하십시오.
참고: 이 단계 후 aliquots 남은 저장 될 수 있습니다-80 ° c.에
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Representative Results
조직 결과
H & E tunica intima, tunica 매체에 있는 평활 근 세포에서에서 내 피 세포와 함께 정상 표본 시연된 정상적인 동맥 해부학에 얼룩과 섬유 아 세포와 피더 선박 등 이기종 콜라겐 매트릭스 라는 바사 vasorum tunica adventitia에서. 없는 염증 성 침투 식별 있다. GCA 긍정적인 일시적인 동맥 보통 심한 염증 세포/histiocytes, 림프 톨, 가끔 플라스마 세포, 및 multinucleated 거 대 한 셀의 집계를 보여주었다. Luminal 좁히기 지적 되었고 내부 탄력 있는 lamina (그림 1)의 내 두껍게 및 90% 파괴를 동반.
Immunohistochemical 결과
CD3 + 세포 및 CD68 + 세포 모든 GCA + 표본에 모든 생 검에서 비슷한 얼룩 패턴을 보여주었다. 1.6 CD3/CD68 비율 대 식 세포에 세포 predominated. FRB에 대 한 얼룩 세포와 multinucleated 거 대 한 세포 adventitia와 미디어 (표 1 및 그림 2)에 우선적으로 지역화를 제한 했다. 최소한의 백혈구를 보여준 표본 제어 (< 5 셀/고 전력 분야)과 FRB 식이 없는.
그림 1: 일시적인 동맥의 이미지 H & E. 다른 레이어와 정상적인 측 두 엽 동맥의 (A) 대표 H & E 이미지 tunica (t) adventitia, 미디어, 그리고 바깥쪽에서 안쪽/Luminal에 intima의 각각 측면. Adventitia (굵은 화살표), 미디어 (얇은 화살표), 평활 근 세포와 intima (10 배 확대)에서 내 피 세포에서 콜라겐과 바사 vasorum 네트워크 note (B) intima-미디어 인터페이스의 확대 현미경 사진 A에 사각형 삽입 하 여 강조 표시 하 고 내부 탄력 있는 lamina (화살촉) (20 배 확대)로 구분 됩니다. 거 대 세포 동맥 과거 lymphohistiocytic 침투 (굵은 화살표), 내 증식 및 내부 탄력 있는 lamina (화살촉) (10 배 확대)의 파괴에 의해 표시 된 TA의 (C) 대표 H & E 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 거 대 세포 동맥으로 일시적인 동맥의 Immunohistochemical 얼룩. (A) 대표 이미지는 광범위 한 염증 성 침투 CD68 긍정적인 세포와 거 대 한 세포 (화살표) 미디어와 adventitia (10 배 확대)에서 주로 발견 보여. (B) Folate 수용 체 베타 (FRB)는 활성화 된 대 식 세포 (화살표) (10 배 확대)에서 선택적으로 표현 했다. 높은 전력에서 찍은 이미지 시연 FRB 긍정적인 세포 (C)와 (D) CD68 긍정적인 세포 (100 배 확대). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| GCA 과목 (n = 5) | 평균 (±SD) |
| CD3 (면역 침투의 %) | 61.7 ± 4.1 |
| CD68 (면역 침투의 %) | 38.3 ± 4.1 |
| CD68 histiocytes/대 식 세포 (세포/hpf) | 34.8 ± 10.4 |
| FRB + 세포 (세포/.hpf) | 10.8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12.7 |
표 1: FRB, CD68, 및 CD3 식의 요약.
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Discussion
GCA는 성인에서 가장 흔한 맥 그리고 그것의 pathologic 특징 T 조 수 세포의 강력한 조합을 보여준다 또한 다른 granulomatous 질병 또는 sarcoidosis 같은 vasculopathies에서 찾을 수 있는 대 식 세포를 활성화 하 고 granulomatous polyangiitis2,3. GCA, 측 두 엽 동맥 매체-큰 크기의 동맥의 좋은 표시를 제공 합니다 및 조교 생 저장 될 수 있는 파라핀 블록에 년, 따라서 진단 신흥의 역할을 공부 하는 기회를 만드는 상당한 샘플을 제공 하 고 치료 목표는 vasculitic microenvironment에서 FRB 처럼. 우리가 액세스할 수 있는 조직 및 표준 immunopathologic는 FRB IHC 통해 안정적으로 분석 될 수 있는지 여부를 물어 방법을 제시 하는 이용을 했다. 우리의 연구 결과 입증 histopathology 및 IHC GCA에 다른 대 식 세포의 역할을 검증 뿐만 아니라 진단 및 혈관 손상의 정도 확인 하는에 뿐만 아니라 귀중 한 공구로 봉사 할 수 있다.
Histopathology 및 IHC 메서드는 모두 노동 집약적인 조직화 학적인 기술자, 병리학 및 즘, 기술이 필요로 하지만 기술과 잘 설립 같은 다른 방법을 사용 하 여 위한 발사대 역할을 할 수 있습니다. 면역 형광 검사 및 흐름 cytometry입니다. 그러나 이러한 방법의 단점은, 신선한 냉동된 조직 잠재 컬렉션을 필요에 대 한 필요성입니다. IHC 조직 검사와는 FRB 처럼 소설 단백질의 출현으로 특히 반복적으로 액세스 하 고 분석 수 있는 혈관 면역 microenvironment의 파노라마 관점 제시에 가치가 있다. Hematoxylin과 오신 (H & E) 얼룩 조직 조직학을 검토 한 수 있습니다. 되며 핵 얼룩과 오신 핵 및 세포질 기능 간의 차이 보여주는에서 에이즈는 counterstain 역할을 하는 동안 핵 정보를 하이라이트. 선택 된 정상 조직의 제어 섹션의 사용 품질 보증에 대 한 평가에 필수적 이다.
IHC는 현미경 검사 법에 의해 시각화 하는 여러 항 체의 사용을 통해 냉동 또는 말린 고정 및 파라핀 끼워 넣어진 조직에 관심사의 항 원을 감지 합니다. 설명 하는 프로토콜 반 데르 Heijden에서 적응 시켰다 외15, 류 마티스 관절염 활 액 세포에서 FRB 식 증명. 필수 IHC 단계 조직 준비, dewaxing/deparaffinization, 항 원 검색 및23얼룩을 포함 합니다. 환자에서 제거 조직 포 르 말린 및 조직 정렬 및 파라핀에 고정 때 꼼꼼하게 보존 하는 방향에서 즉시 고정 되도록 필수적 이다. 조직을 얇게는 톰의 사용으로 구분 하 고 크 실 렌, 에탄올과 물에서 여러 세척을 필요로 하는 dewaxing 단계를 겪 습. 다음 단계인 항 원 검색, 포 르 말린 기정 동안 methylene 연계 뜨 필요 하며 시트르산 기반 버퍼 및 습 한 열. 슬라이드를 항 원 탐지를 방해할 수 있는 내 인 성 과산화 효소 효소를 차단 과산화 수소와 함께 처리 됩니다. 얼룩 절차 다음 주 항 원-항 체 반응을 감지 이차 항 체를 적용 하 여 다음의 항 원 바인딩 것입니다 희석된 주 항 체와 슬라이드 배양에 의해 수행 됩니다. 이것은 chromogen DAB 기판 현미경 시각 이다 갈색 색소를 형성 하로 옵니다. 마지막 단계는 거품 처럼 간섭 물질 없이 커버 슬립 표면 사이 형성 된다 확인 영구 솔루션으로 조직의 주의 장착. 프로토콜 동맥 조직의 사용에 맞게 수정 해야 합니다. 최적의 항 체 농도 알려지지 않았다 및 여러 희석 1시 50분, 1: 100, 1: 200, 1:400, 1:800, 1:1, 600에서 필요한 연구 GCA에 FRB를 평가 하는 첫번째 이었다, 때문에 최고 품질 최저 배경 잡음 또는 신호에 얼룩과 1:3200에 달성, 1:800입니다.
멤브레인 관련 된 FRB 이전 로스에 의해 확인 했다 외18,24 정상 placental 세포, 호 중구, leukemic 돌풍 promyelocytic 백혈병, 만성 골수성 백혈병에서 표현 될 발견 하 고 myelomonocytic, 및 erythroleukemias의 그리고 변함없이 M1/M2 급성 골수성 백혈병에는 인구를 myeloblast 친 화력 정화 토끼 polyclonal 항 체가 이전 작품에 사용 되는 FRB에 대 한 특정 있다 이후 류 마티스 관절염 긍정적인 활 액 세포와 고체 기관 종양의 연구에 적용 되었습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 FRB 항 체 상업적으로 사용할 수 있으며 광범위 한 응용 프로그램을 방해할 수 있습니다. 여기서 설명 하는 방법론 또한 다른 FRB 항 체에 대 한 작동 수 있습니다 하지만 더 큰 숫자에서의 사용 하기 전에 개별 최적화가 필요 합니다. FRB는 태 반에 크게 표시 됩니다, 이후이 조직이 반복적으로 사용 되었습니다 긍정적인 통제로.
연구 디자인 작은 샘플 크기에 의해 제한 되었다 하며 이상적으로 GCA의 초기 및 늦은 단계에서 얻은 탭의 더 큰 숫자에서 유효성 검사. 또한, 이후 FRB macrophage 잎 활용된 에이전트와 antifolates 잠재적인 진단 및 치료 대상으로 사용할 수 있습니다, 여기에서 얻은 데이터 지원 M1 및 M2 대 식 세포의 맥락에서 표현 형 FRB 추가 검사 필요 분극입니다. 다른 진단 기준 FRB 대상으로 엽 산 비 침략 적 영상 접근에 대 한 이러한 결과 오픈 기회 애완 동물 SPECT 이미징 에이전트 활용. 또한, 대 식 세포 침투는 질병의 진행 및 아 테 롬, scleroderma, sarcoidosis, 그리고 류 마티스 관절염에 활동의 각 인,이 프로토콜을 사용 하 고는 이러한 조건에서 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다.
이것은 식이와 GCA에 FRB의 첫 번째 프로토콜 이다. IHC는 허용 파노라마 횡단면 및 다중 뷰는 TA의 면역 침투와 동맥 microenvironment 사이의 숫자 관계의 분석을 수 있습니다. FRB는 혈관 벽의 모든 층에 침투 하는 총 대의 30%를 구성 하지만 FRB 하지은 intima에 고 adventitia와 미디어에만 지역화 흥미롭게도. 배급의이 패턴 미디어 및 adventitial 레이어25에 차동 콜라겐 구성에 대 한 FRB macrophage 차 있는 굴곡 운동에 대 한 새로운 통찰력을 계시 할지도 모른다. (같은 팬-림프 구 마커 안티-CD3에 의해 측정) 약 60% 림프 톨 및 40% 대 식 세포 (macrophage 팬 마커 안티-CD68에 의해 표시) 면역 침투에 의하여 이루어져 있다. 최근 연구 결과와 상관 된다 CD3 GCA 진단에 대 한 높은 감도 다른 CD68 식 높은 질병 활동을 연결 하는 동안. 따라서, 우리는 초기 GCA 혈관 면역 환경 FRB 긍정적인 되 고 대 식 세포의 30%와 세포: 세포의과 비로 시작을 제안 합니다. 여부 이것에 대 한 진정한 보유 하 고 그리고 일관 되 게 이른 질병을 가진 환자에서 입증 되어야 더 미래에 검증 되 고 예비 실험. 이 세포 침투 배포 일관 되 게만 좋다면, 그것은 다음 GCA 질병 활동에 대 한 바이오 마커 합성 역할 수 있습니다.
결론적으로,이 프로토콜 미디어에서 FRB 침투의 존재와 GCA에 일시적인 동맥의 adventitia 처음으로 시연 했다. FRB 대 식 세포는 초기에 총 대 식 세포 인구의 약 1/3와 활성 GCA microenvironment 60% 40%와 세포 대 식 세포의 구성 대표.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 박사 더글러스 계단, 마리 안 Klinger, 앤 Benko, 사단의 류 마티스/학과 의학 그리고 분자 조직 핵심 연구소, 펜 주립 대학 대학의과 대학, 허쉬 실바의 지원에 의해 가능 하 게 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
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