Summary
Das Protokoll zeigt die Verwendung der histologischen Untersuchung und immunhistochemische Profil Folat Rezeptor Beta-Makrophagen und seine Beziehung zu der gesamten Immunzelle Schläfenarterie Biopsien in riesige Zelle Arterienentzündung zu infiltrieren.
Abstract
Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung des Mittel-groß dimensionierte Arterien, die ältere Erwachsenen betrifft. GCA Manifeste mit Arthritis und okklusive Symptome von Kopfschmerzen, Schlaganfall oder vision Verlust. Makrophagen und T-Helfer-Lymphozyten die Gefäßwand zu infiltrieren und eine Pro-inflammatorische Reaktion, die zu Schiff Schaden und Ischämie führen zu produzieren. Bisher gibt es keine GCA-Biomarker, die Krankheit Aktivität und Guide therapeutische Reaktion überwachen können.
Folat-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein Glycosylphosphatidylinositole Protein, das auf Zellmembranen verankert ist und normalerweise ausgedrückt in der Myelomonocytic Linie und in der Mehrzahl der myeloischen Leukämie-Zellen sowie in Tumor und rheumatoide synovialen Makrophagen, wo seinen Ausdruck mit der Schwere der Erkrankung korreliert. Die Fähigkeit der FRB, Folat Verbindungen, Folsäure-Konjugate und Strukturähnliche Medikamente binden hat es ein druggable Ziel in Krebs und entzündliche Erkrankung Forschung gemacht. Dieser Bericht beschreibt die histologischen und immunhistochemische Methoden verwendet, um Ausdruck und Verteilung der FRB in Bezug auf GCAimmunopathology zu bewerten.
Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Schläfenarterie Biopsien von GCA und normalen Kontrollen waren voller Flecken mit Hämatoxylin und Eosin prüfen Gewebe Histologie und pathognomonische Funktionen ermitteln. Immunohistochemistry diente, FRB, CD68 und CD3 Ausdruck zu erkennen. Eine mikroskopische Analyse wurde durchgeführt, um die Anzahl der positiv gefärbten Zellen auf 10 ausgewählten high-power-Bereich Sektionen und ihre jeweiligen Standorte in der Arterienwand zu quantifizieren.
Lymphohistiocytic (LH) Entzündung begleitet von Intima-Hyperplasie und gestörten elastischen Lamina galt in GCA mit keine Kontrollen gefunden. Das LH Infiltrat bestand aus ca. 60 % Lymphozyten und 40 % Makrophagen. FRB Ausdruck beschränkte sich auf Makrophagen, bestehend aus 31 % der CD68 + Makrophagen Gesamtbevölkerung und in der Media und Adventitia lokalisiert. Keine FRB wurde in Steuerelementen gesehen.
Dieses Protokoll zeigt ein eindeutiges numerisches und räumliche Muster der FRB Makrophagen im Verhältnis zu der vaskulären immun Mikroumgebung in GCA.
Introduction
Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine entzündliche Erkrankung des mittleren bis großen Arterien, targeting der Aorta und seine Niederlassungen und ältere Erwachsene betroffen. Es stellt mit leichten bis schweren ischämischen Komplikationen wie Kopfschmerzen, Kieferschmerzen, Verlust der Sehkraft, Schlaganfall und Gewebe Gangrän. Die Diagnose wird durch hohe Entzündungsmarker wie Erythrozyten Sedimentation Rate (ESR) und ein eindeutiges histologischen Muster auf der Schläfenarterie Biopsie (TAB)1bestätigt. GCA ist die häufigste Vaskulitis Erwachsenen, und die Zugänglichkeit der Schläfenarterie erhalten für die Diagnose stellt einen Vorteil gegenüber anderen Vasculopathies, so dass man seine Pathogenese leichter zu studieren. Die typische Ergebnisse auf Registerkarte "beinhalten ein Infiltrat von Makrophagen/Histiozyten und T-Lymphozyten über alle vaskulären Schichten der Tunica Intima, Media und Adventitia mit gleichzeitiger Zerstörung der elastischen Lamina, die normalerweise diese trennt gefunden Fächer2. Die aktuelle Beweise zeigt, dass GCA ein unbekanntes Antigen beinhaltet, die dendritische Zellen in der vaskulären Adventitia aktiviert, gefolgt von der Einstellung des Helfers T (Th) Zellen, insbesondere Th1 und Th17-Subtypen, die absondern Interleukin-17 und Interferon-Gamma (IFG) beziehungsweise. IFG dann rekrutiert und aktiviert Makrophagen produzieren Zytokine und Proteasen. Dazu gehören Pro-inflammatorischen Zytokinen; einschließlich der IL-12, die wechselseitig Th1 Zellen, wodurch eine positive Rückkopplung aktiviert; Tumor-Nekrose-Faktor und Interleukin-6, die Arthritis und Fieber und Metalloproteasen, die verursachen Schäden der elastischen Lamina. Glukokortikoide (GC), die die Standardtherapie der chronischen darstellen, Steuern die Cytokine Bahnen teilweise mildernde Th17/IL-17, aber nicht die Th1/IFG Arm der Immunantwort3,4. Leider führt Absetzen des GC Rückfall der Erkrankung. Als alternative Modalität Methotrexat hat für GCA Behandlung umgewidmet worden, aber die gewünschte klinische Endpunkte wurden nicht konsequent erreicht, obwohl empfindlicher Biomarker für therapeutischen Überwachung5,6 nicht verwendet worden sein . Im Jahr 2017 wurde die Interleukin 6-Blocker, Tocilizumab, für die Behandlung von GCA genehmigt, wie effektiv Krankheitskontrolle und schonende Wirkung7,8Steroid nachgewiesen.
Bisher gibt es keine guten Biomarker für GCA. Infolgedessen ist es schwierig, zur Überwachung der Krankheitsaktivität und titrieren Dosen von verfügbaren Medikamenten, um negative Auswirkungen zu vermeiden und reduzieren die Belastung der Kosten für die Gesellschaft. Daher ist es unerlässlich, ein Kandidat Biomarker, dass korreliert mit Krankheitsaktivität, bieten neue Einblicke über die Pathogenese und Hilfe bei therapeutischen Entscheidungen suchen.
Die Dysregulation der Makrophagen Aktivierung ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese der GCA. So kann ein wirksames Mittel zur Behandlung von GCA sein die gezielte Ausrichtung der aktivierten Makrophagen. Die Folsäure-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein a1-Phosphatidylinositol-Glykoprotein, das auf der Zellmembran verankert ist in normalen Myelomonocytic Zellen, myeloische Leukämie-Zellen exprimiert und aktiviert Makrophagen. Die Liganden, Folsäure, ist ein wichtiges Vitamin in seiner reduzierten Form, der zelluläre DNA-Synthese, Methylierung und Reparatur9ermöglicht. FRB-Ausdruck wird in Autoimmunerkrankung und während der Karzinogenese induziert. Ihr Ausdruck ist auf der Oberfläche von Monozyten oder Pro-inflammatorischen M1 Makrophagen bei rheumatoider Arthritis oder auf entzündungshemmende M2-Makrophagen beschränkt in festen Orgel und myeloischen malignen Erkrankungen10,11,12 , 13. neben ihrer möglichen Rolle als Biomarker der aktivierten Makrophagen, FRB können selektive Drug Transport durch einen mehrstufigen Prozess, der mit die Rezeptorbindung, Folsäure, Antifolates oder Folat konjugiert Drogen an der Zelle beginnt Oberfläche, gefolgt von Verinnerlichung, Freigabe und eventuelle Lieferung des gewünschten Medikaments an die interne Zelle Maschinen12,14,15,16. Im Gegensatz zu FRB in Krebszellen exprimiert und aktiviert Makrophagen, FRB in normalen blutbildenden Zellen exprimiert ist nicht in der Lage zu binden Folate damit FRB/Folat-vermittelten Drug-Delivery FRB-positiven entzündlichen oder Krebszellen beschränkt.
In unserem vorangegangenen Studie zeigten wir zum ersten Mal, das FRB in GCA Makrophagen zum Ausdruck bringt und seinen Ausdruck korreliert mit CD68 + und Endothelin Rezeptor Beta-Makrophagen, die GCA Pathogenese17beitragen. In diesem Bericht beschreiben wir die histopathologische und immunhistochemische Methoden zur Beurteilung der FRB Makrophagen und analysiert den gesamten Lymphozyten und Makrophagen zählt, um Einblick in die FRB Position in der GCA vaskulären Landschaft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschriebene Methoden wurden von der Penn State Institutional Review Board genehmigt.
(1) histopathologische Vorbereitung und Verarbeitung nach Erhalt Schläfenarterie Biopsie
Hinweis: Die Schläfenarterie Biopsie (TAB) wird durch einen qualifizierten Chirurgen unter örtlicher Betäubung und sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach chirurgisch Erhalt einen 3 cm arteriellen Abschnitt auf der mehr betroffenen Seite, die Probe ist in Formalin sofort für 24 h behoben, in 3 bis 4 mm Abschnitte unterteilt und eingebettet in Paraffin, sorgfältige Aufmerksamkeit auf die korrekte Ausrichtung des Gewebes im Block, ist dann bei Raumtemperatur gelagert. Probe-Auswahl erfolgt nach Überprüfung der medizinischen Aufzeichnungen. Die Diagnose basiert auf der American College of Rheumatology 1990 Kriterien, wonach Themen 3 5 Domains erfüllen: Alter > 50 Jahre, neue Kopfschmerzen, Schläfenarterie Zärtlichkeit, einer Erythrozyten Sedimentation Rate > 50 mm/Stunde von Westergren-Methode und eine abnorme Registerkarte. Aus Sicherheitsgründen müssen Schutzhandschuhe getragen werden zu allen Zeiten bei der Handhabung der Proben, Chemikalien und Antikörper.
- Geschnitten Sie von den eingebetteten Blöcken 4-5 µm dicke Abschnitte mit einem Mikrotom. und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Verwenden Sie ein Steuerteil des ausgewählten Normalgewebe zur Qualitätssicherung.
- Schwimmer schneiden Abschnitte über einem warmen Wasserbad erwärmt bis 40 ° C zu Falten entfernen und mit einem beschichteten Objektträger mikroskopische abholen. Platzieren Sie den Objektträger auf einem warmen Teller in einem 60 ° C Backofen für 60 Minuten trocknen und die Einhaltung des Abschnitts der Folie zu erleichtern.
- Platzieren Sie den Objektträger auf einem warmen Teller in einem 60 ° C Backofen für 60 Minuten trocknen und die Einhaltung des Abschnitts der Folie zu erleichtern.
- Montieren Sie 3 Abschnitte auf Objektträger.
- Legen Sie Folien in eine vertikale Rack und über Nacht bei 37 ° C für 24 h trocknen.
- Platzieren Sie Folien in einem Behälter und Speicher bei 4 ° C.
2. die immunhistochemische Vorbereitung, entwachsen, Antigen-Retrieval und Färbung15,18,19,20
- Laden Sie Folien Folie einbauen. Führen Sie das Gestell durch Gerichte wie folgt: zweimal in 100 % Xylol für 5 Minuten mit 10 Sekunden sanft Agitation alle 30 Sekunden einmal in 100 % igem Ethanol unter 10 Sekunden rühren, einmal in 90 % Ethanol unter 10 Sekunden rühren, einmal in 70 % igem Ethanol unter 10 Sekunden rühren , und zweimal in doppelt destilliertem H2O unter 10 Sekunden rühren.
Hinweis: Umgang mit Xylol und Aceton sollte in belüfteten Hauben, Inhalation und Atemwege Toxizität zu vermeiden erfolgen. - Abrufen des Antigens durch die Übertragung der Rack in einem Glasbehälter mit 200 mL 10 Mmol/L, pH 6.0 Citrat-Puffer auf 95 ° c vorgewärmt Stellen Sie den Timer für 30 Minuten im Wasserbad, dann für 20 Minuten dann spülen unter fließendem Wasser für 5 Minuten bei Zimmertemperatur abkühlen.
- Entfernen Sie endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation in 200 mL Wasserstoffperoxid 3 % für 10 Minuten. Waschen Sie Objektträger in 200 µL Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBSS) 3 Mal.
- Entfernen Sie die Folien aus dem Rack und tupfen Sie jeweils vorsichtig, um überschüssigen Puffer zu wischen. Zum Beizen, fügen Sie 200 µL der folgenden primären Antikörper, Deckel rutscht auf Folien hinzufügen und 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren hinzu:
Anti-FRB Antikörper verdünnt 1:800
Monoklonaler Maus Anti-Human CD68, Verdünnung 1: 200
Polyklonale Kaninchen Anti-CD3 1: 100 Verdünnung
Hinweis: Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Teile der Plazenta waren auch verarbeitet wie in Schritte 2.1 bis 2.9 und inkubierten mit Anti-FRB18 beschrieben und als Positivkontrolle verwendet. Färbung Ergebnisse wurden von der Suche nach der optimalen Antikörperkonzentration erhalten und wurde von titrieren des Antikörpers in doppelter Verdünnungen (z.B. 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600) durchgeführt. - Entfernen Sie Deckglas nach Inkubation und entsorgen. Folien 3 Mal für 2 Minuten mit TBSS abspülen, abtropfen lassen und wischen Sie überschüssiges Puffer.
- Fügen Sie 200 µL Sekundärantikörper Lösung mit biotinylierte Rabbit/Maus Sekundärantikörper mit unconjugated primären Antikörper gebunden, Gewebe-Antigen reagieren. Deckgläsern auf Folien und 45 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren.
- Entfernen Sie Deckglas nach Inkubation und entsorgen. Folien 3 Mal für 2 Minuten mit TBS abspülen, abtropfen lassen und wischen Sie überschüssiges Puffer.
- Fügen Sie 200 µL des Diaminobenzidine (DAB) + Substratpuffer (Imidazol HCl)-Chromogen System und inkubieren Sie für 10 Minuten Färbung Muster zu visualisieren. Waschen Sie mit TBSS dann in fließendem Leitungswasser für 10 Minuten.
- Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 3 Minuten.
- Montieren Sie die Folien, indem 70 µL Eindeckmedium auf der Oberfläche der Folie. Langsam kippen Sie das Deckglas auf den Eindeckmittel und vermeiden Sie Luftblasen, wie Sie es einrastet unten. Warten Sie 24 Stunden trocknen lassen.
(3) histologischen und immunhistochemische (IHC) Analyse
Untersuchen Sie die H & E und IHC Abschnitte von GCA positive und normalen Probanden mit einem Lichtmikroskop gefärbt.
-
Für die H & E gefärbt Abschnitte:
- Beurteilen Sie die Gefäßarchitektur und identifizieren Sie Endothelzellen in der Tunica Intima, glatten Muskelzellen in der Tunica Media und Fibroblasten und Vasa Vasorum in Tunica Adventitia21,22zu.
- GCA Funktionen, darunter Lymphozyten und Makrophagen/Histiocyte Infiltration, zelluläre Hyperplasie und internen elastischen Lamina Abbau zu identifizieren.
- Analysieren Sie das Lymphohistiocytic Infiltrat durch Identifizierung und Quantifizierung der Anzahl von Makrophagen im Verhältnis zu den Lymphozyten. Das Ausmaß der Störung der internen elastischen Lamina und hyperplastische Veränderungen in ihren Wohnsitz Zellen zu beurteilen und zu vergleichen mit Steuerelementen.
-
Für die IHC gebeizt Abschnitte:
- Untersuchen Sie die Färbung Muster der FRB, nehmend von seinen Ausdruck durch eine bestimmte Art oder Arten von Zellen und deren Verteilung innerhalb der vaskulären Schichten und ihre Beziehung auf das gesamte Immunsystem Infiltrat, total Makrophagen Marker, Anti-CD68 und die Pfanne Lymphozyten Marker anti-CD3.
- Quantifizieren des Ausdrucks der FRB, CD68 und CD3 Zellen durch zählen der positiv gefärbten Zellen auf 10 mehrere zufällig ausgewählte Hochleistungs-Felder (hpf) und notieren Sie die Mittel.
Hinweis: Identifizierung von diesen normalen und pathologischen Zellen und Strukturen wurden von einem zertifizierten Herz-Kreislauf-Pathologen (j.m.) durchgeführt und Rheumatologen (S.A.A) und die Ergebnisse für alle Fälle aufgezeichnet wurden. - Aufnehmen Sie repräsentative Bilder mit einer Digitalkamera.
Hinweis: Nach diesen Schritten kann verbleibende Aliquote bei-80 ° c gelagert werden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histologischen Befunde
Der H & E Flecken in normalen Proben nachgewiesen normale arterielle Anatomie mit Endothelzellen in der Tunica Intima, glatten Muskelzellen in der Tunica Media und eine heterogene Kollagen-Matrix die Fibroblasten und Feeder Schiffe gehören genannt Vasa vasorum in Tunica Adventitia. Es gibt keine entzündlichen Infiltrat identifiziert. GCA positive zeitliche Arterien zeigte mäßige bis schwere Entzündungen mit Aggregaten von Makrophagen/Histiozyten, Lymphozyten und gelegentliche Plasmazellen mehrkernigen Riesenzellen. Luminalen Verengung wurde zur Kenntnis genommen und begleitet von Intima Verdickung und 90 % Störung der internen elastischen Lamina (Abbildung 1).
Immunhistochemische Ergebnisse
CD3 + Lymphozyten und Makrophagen CD68 + in allen GCA + Proben anwesend waren und ähnliche Färbung Muster alle Biopsien nachgewiesen. Die Lymphozyten herrschte über Makrophagen mit einem CD3/CD68-Verhältnis von 1.6. Färbung für FRB beschränkte sich auf Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen, die bevorzugt die Adventitia und Medien (Tabelle 1 und Abb. 2) lokalisiert. Steuern Proben zeigte minimale Leukozyten (< 5 Zellen/high-power-Bereich) und kein FRB-Ausdruck.
Abbildung 1: H & E Bilder von zeitlichen Arterien. (A) Vertreter H & E Bild von einem normalen Schläfenarterie mit getrennten Schichten der (t) Tunica Adventitia, Medien und Intima aus der äußersten, die innerste/Luminal bzw. Seite. Beachten Sie das Netz von Kollagen und Vasa Vasorum in der Adventitia (Dicke Pfeile), die glatten Muskelzellen in den Medien (dünne Pfeile) und die Endothelzellen in der Intima (10-fache Vergrößerung). (B) einen erweiterten Schliffbild der Intima-Media-Schnittstelle wird hervorgehoben durch die rechteckigen Ausschnitt a und ist durch die internen elastischen Lamina (Pfeilspitzen) (20 X Vergrößerung) getrennt. (C) Vertreter H & E Bild von einem TA mit riesige Zelle Arterienentzündung, gekennzeichnet durch eine Transmural Lymphohistiocytic Infiltrat (Dicke Pfeile), Intima-Hyperplasie und Zerstörung von der internen elastischen Lamina (Pfeilspitzen) (10-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: immunhistochemische Färbung von zeitlichen Arterien mit riesige Zelle Arterienentzündung. (A) repräsentative Bilder zeigen eine umfangreiche entzündlichen Infiltrat mit CD68 positiven Makrophagen und Riesenzellen (Pfeile) fand vor allem in den Medien und Adventitia (10-fache Vergrößerung). (B) Folat-Rezeptor-Beta (FRB) drückte sich selektiv in aktivierten Makrophagen (Pfeile) (10-fache Vergrößerung). Aufnahme mit höherer Leistung gezeigt, FRB positiven Makrophagen (C) und CD68 positiven Makrophagen (D) (100 X Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| GCA Probanden (n = 5) | Mittelwert (±SD) |
| CD3 (% des Immunsystems Infiltrat) | 61.7 ± 4.1 |
| CD68 (% des Immunsystems Infiltrat) | 38,3 ± 4.1 |
| CD68 Histiozyten/Makrophagen (Zellen/hpf) | 34,8 ± 10,4 |
| FRB + Makrophagen (Zellen/.hpf) | 10.8 ± 4,4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12,7 |
Tabelle 1: Zusammenfassung der FRB, CD68 und CD3 Ausdruck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GCA ist die häufigste Vaskulitis bei Erwachsenen, und pathologische Wahrzeichen steht beispielhaft für eine wirkungsvolle Kombination von T-Helfer-Lymphozyten und aktiviert Makrophagen, die auch in andere granulomatöse Erkrankungen oder Vasculopathies wie Sarkoidose gefunden werden können und granulomatöse Polyangiitis2,3. In GCA, die Schläfenarterie bietet eine gute Darstellung einer Mittel-groß dimensionierte Arterie und die TA-Biopsie gibt eine große Probe, die in Paraffin-Blöcke für Jahre kann wodurch Studienmöglichkeiten die Rollen gespeichert werden von neuen diagnostischen und therapeutische Ziele wie FRB in vasculitic Mikroumgebung. Wir nutzten präsentiert von zugänglich Gewebe und standard Immunopathologic Methoden zu Fragen, ob die FRB zuverlässig durch IHC analysiert werden kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Histopathologie und IHC als wertvolle Werkzeuge nicht nur bestätigt die Diagnose und das Ausmaß der vaskulären Schäden, sondern auch in die Rolle der verschiedenen Makrophagen Subtypen in GCA Validierung dienen können.
Die Histopathologie und IHC Methoden sind beide arbeitsintensiv und die Fähigkeiten der histochemische Techniker, Pathologen und Rheumatologen erfordern, aber die Techniken gut etabliert und können als eine Startrampe für die mit anderen Methoden wie Immunfluoreszenz und Flow Cytometry. Der Nachteil dieser Methoden ist jedoch die Notwendigkeit einer frisch gefrorenes Gewebe, das prospektive Erhebung erfordert. IHC, zusammen mit histologischen Untersuchung ist von unschätzbarem Wert bei der Präsentation einer Panorama Perspektive der vaskulären immun Mikroumgebung, die wiederholt zugegriffen und analysiert werden können vor allem mit dem Aufkommen der neuen Proteine wie die FRB. Die Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung kann Gewebe Histologie zu überprüfen. Hämatoxylin Flecken Nucleus und unterstreicht die nukleare Details während Eosin als eine Gegenfärbung dient die Beihilfen die Unterschiede zwischen Kern- und zytoplasmatischen Features zu demonstrieren. Die Verwendung von einem Steuerteil des ausgewählten Normalgewebe unbedingt zur Qualitätssicherung zu bewerten.
Der IHC erkennt das Antigen des Interesses an gefrorenen oder Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Gewebe durch den Einsatz von mehreren Antikörper, die durch Mikroskopie visualisiert werden. Das Protokoll beschrieben wurde von van der Heijden Et Al.15, die FRB Ausdruck in synovialen Makrophagen bei rheumatoider Arthritis unter Beweis gestellt. Die wesentlichen Schritte der IHC gehören Gewebe Vorbereitung, entwachsen/4.wenn, Antigen-Retrieval und Färbung23. Es ist unbedingt darauf zu achten, dass das Gewebe des Patienten entfernt sofort in Formalin und Gewebe Ausrichtung und Orientierung, die sorgfältig erhalten, wenn in Paraffin fest fixiert ist. Das Gewebe ist dünn mit einem Mikrotom geschnitten und durchläuft einen dewaxing Schritt, der mehrere Wäschen in Xylol, Ethanol und Wasser benötigt. Der nächste Schritt, genannt Antigen-Retrieval, ist notwendig, um die Methylenblau-Verbindungen gebildet während Formalin Fixierung brechen und erfordert ein Citrat-Puffer und feuchte Hitze. Die Folien werden behandelt mit Wasserstoffperoxid, endogene Peroxidase Enzyme blockieren, die Antigennachweis stören können. Das Färbeverfahren wird weiter durch Inkubation der Folien mit verdünnter primären Antikörper, die das Antigen des Interesses, gefolgt von eine sekundäre Antikörper, der die primäre Antigen-Antikörper-Reaktion erkennt die Anwendung binden werden durchgeführt. Danach erfolgt die Kennzeichnung mit einem Chromogen DAB-Substrat, das braunes Pigment bildet, das unter dem Mikroskop sichtbar gemacht wird. Der letzte Schritt ist die sorgfältige Montage des Gewebes mit einer dauerhaften Lösung, um sicherzustellen, dass keine störenden Substanzen wie Luftblasen zwischen Deckglas und Oberfläche gebildet werden. Das Protokoll erforderlichen Modifikationen, die Verwendung des arteriellen Gewebes unterzubringen. Da die Studie war die erste, FRB in GCA zu bewerten, die optimale Antikörperkonzentration unbekannt war und brauchte mehrere Verdünnungen bei 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1, 600, 1:3200 mit der besten Qualität zu den niedrigsten Hintergrundgeräusche oder Signal Färbung erreicht bei 1:800.
Die membranassoziierten FRB validiert wurde früher von Ross Et Al.18,24 und erwies sich in normalen Zellen der Plazenta, Neutrophile, leukämischen Blasten bei chronisch myeloischer Leukämie, Promyelocytic Leukämie ausgedrückt werden Myeloblast Bevölkerungen von Myelomonocytic und Erythroleukemias und variabel in M1/M2 akute myeloische Leukämie. Die Affinität gereinigt Kaninchen polyklonalen Antikörper spezifisch für FRB in diesen früheren Werken verwendet da angewandt worden, um Studien zur rheumatoiden Arthritis positiv synovialen Makrophagen und solide Orgel Tumoren. In diesem Protokoll verwendeten FRB-Antikörper ist nicht im Handel erhältlich und kann behindern breite Anwendung. Denkbar, die hier beschriebene Methode funktioniert auch für andere FRB-Antikörper aber erfordert individuelle Optimierung vor seiner Verwendung in größeren Stückzahlen. Da FRB in Plazenta deutlich zum Ausdruck kommt, hat dieses Gewebe mehrfach als Positivkontrolle eingesetzt.
Das Studiendesign wurde durch einen geringen Stichprobenumfangs begrenzt und erfordert die Validierung in einer größeren Anzahl von Registerkarten, die im Idealfall in frühen und späten Stadien der GCA erhalten. Darüber hinaus da die FRB Makrophagen als mögliche diagnostische und therapeutische Ziel mit Folsäure konjugierten Agenten und Antifolates dienen kann, unterstützt die hier gewonnenen Daten die Notwendigkeit eingehender zu untersuchen, FRB Phänotyp im Zusammenhang mit M1 und M2-Makrophagen Polarisation. In Bezug auf andere Diagnose konjugiert diese Ergebnisse offene Verkaufschancen für nicht-invasive bildgebende Ansätze mit FRB gezielte Folsäure SPECT von PET imaging Agents. Zusätzlich, da die Makrophagen Infiltration ein Markenzeichen der Krankheitsprogression und Aktivität in Atherosklerose, Sarkoidose, Sklerodermie und rheumatoider Arthritis ist, finden die Verwendung dieses Protokolls Anwendungen unter diesen Bedingungen.
Dies ist das erste Protokoll, den Ausdruck und die Verteilung der FRB in GCA zu erkunden. Der IHC erlaubt einen Panoramablick Querschnitts- und mehrere Ansichten des TA und ermöglicht die Analyse der numerischen Beziehungen zwischen immun infiltrieren und die arterielle Mikroumgebung. Die FRB umfasste 30 % von der gesamten Makrophagen, die alle Schichten der Gefäßwand infiltriert, aber Interessanterweise FRB war nicht in der Intima gefunden und lokalisiert nur auf die Adventitia und Medien. Dieses Muster der Verteilung kann neue Einblicke auf FRB Makrophagen Tropismus für die differenzielle Kollagen Zusammensetzung gefunden in den Medien und adventitial Layer25offenbaren. Das Immunsystem Infiltrat bestand aus ca. 60 % Lymphozyten (gemessen an der Pan-Lymphozyten Marker Anti-CD3) und 40 % Makrophagen (gekennzeichnet durch Pan-Makrophagen Marker Anti-CD68). Eine aktuelle Studie korreliert CD3 mit eine höhere Empfindlichkeit für GCA Diagnose, während ein anderes CD68 Ausdruck höherer Krankheitsaktivität verbunden. Daher schlagen wir vor, dass die frühen GCA vaskuläre immun Milieu mit einem 60: 40 Verhältnis von Lymphozyten: Makrophagen mit 30 % von den Makrophagen wird FRB positiv beginnt. Ob dies gilt auch für und immer wieder gezeigt, bei Patienten mit frühen sollen weitere validierte in Zukunft und zukünftige Experimente. Wenn diese zelluläre Infiltrat Verteilung konstant hält, kann es dann als Biomarker Verbundwerkstoff GCA Krankheitsaktivität dienen.
Abschließend zeigte dieses Protokoll zum ersten Mal das Vorhandensein der FRB Infiltration in den Medien und Adventitia der zeitlichen Arterien in GCA. FRB Makrophagen vertreten, etwa ein Drittel der Bevölkerung in einer frühen totalen Makrophagen und aktive GCA Mikroumgebung bestehend aus 60 % Lymphozyten und 40 % Makrophagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung von Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, der Abteilung Rheumatologie/Abteilung Medizin und Molekularbiologie und histologischen Zentrallabor, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
