Summary
הפרוטוקול מדגים את השימוש היסטופתולוגיות אימונוהיסטוכימיה לפרופיל מקרופאג בטא קולטן של חומצה פולית ועל מערכת היחסים שלה עם המערכת החיסונית בתא סכום לחדור ביופסיות מהעורק arteritis תא ענק.
Abstract
תא ענק arteritis (GCA) היא בתיווך החיסון מחלה כרונית של העורקים בגודל בינוני וגדולים המשפיעה על מבוגרים. מניפסטים GCA עם דלקת מפרקים, ריטלין סימפטומים של כאבי ראש, שבץ או חזון הפסד. מאקרופאגים לימפוציטים T-helper לחדור את הקיר וסקולרית ומפיקים תגובה פרו דלקתיים להוביל כלי נזק ו איסכמיה. נכון להיום, יש אין סמן GCA יכול לפקח המחלה פעילות ומדריך תגובה טיפולית.
חומצה פולית קולטן בטא (FRB) הוא חלבון glycosylphosphatidylinositol מעוגנים על קרום התא, בדרך כלל לידי ביטוי בשושלת myelomonocytic, ברוב המכריע של תאים לוקמיה מיאלואידית כמו גם הגידול, מקרופאגים synovial לקומה, מאיפה הביטוי שלה בקורלציה עם חומרת המחלה. היכולת של FRB כדי לאגד תרכובות חומצה פולית, חומצה פולית-conjugates וסמים antifolate הפכה אותו למטרה druggable בסרטן, מחלה דלקתית מחקר. הדו ח מתאר את histopathologic immunohistochemical ושיטות להערכת ביטוי והפצה של FRB ביחס GCAimmunopathology.
פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע מהעורק ביופסיות מ GCA ופקדים רגילה היו מוכתמים Hematoxylin ואאוזין כדי לסקור את רקמת היסטולוגיה לזהות תכונות pathognomonic. אימונוהיסטוכימיה שימש כדי לזהות ביטוי FRB, CD68 ו- CD3. ניתוח מיקרוסקופי בוצעה לכמת את מספר התאים מוכתם באופן חיובי על 10 חלקים גבוה-power-שדות נבחרים ומקומות המתאימים שלהם בדופן העורקים.
דלקת Lymphohistiocytic (LH) בליווי היפרפלזיה intimal וראו פרופריה אלסטי שיבשו ב- GCA עם אף מצאה בפקדים. לחדור LH הולחן של 60% לימפוציטים ו- 40% מקרופאגים. FRB הביטוי הוגבל מקרופאגים, הכוללת 31% מכלל CD68 + מקרופאג האוכלוסייה, לוקליזציה מדיה ו- adventitia. FRB לא נראתה בפקדים.
פרוטוקול זה הפגין דפוס ברור של macrophage FRB ביחס microenvironment המערכת החיסונית כלי הדם ב- GCA הגיאופוליטיות והמרחביות מספריים.
Introduction
תא ענק arteritis (GCA) היא מחלה דלקתית של העורקים בינוניים וגדולים, מיקוד העורקים ואת סניפיה ומשפיע מבוגרים. הוא מציג עם קלה סיבוכים איסכמיים חמורים כגון כאבי ראש, כאבים בלסת, אובדן ראייה, משיכת לבין רקמת נמק. האבחנה אושר על ידי גבוהה סמנים דלקתיים כמו שקיעת דם (ESR) ודפוס histopathologic ברור על ה מהעורק ביופסיה (הכרטיסיה)1. GCA דלקת בכלי הדם הנפוצים ביותר למבוגרים, הנגישות של העורק הטמפורלי השיג עבור אבחון מציג יתרון על פני אחרים vasculopathies, ובכך מאפשר אחד ללמוד פתוגנזה שלה בקלות רבה יותר. הממצאים טיפוסי בכרטיסיה כוללים לחדור של מקרופאגים/histiocytes ו- T לימפוציטים שנמצאו על פני כל השכבות כלי הדם של אינטימה tunica, מדיה, adventitia עם הרס בו-זמניות של הנדן אלסטי שמפריד אלה בדרך כלל תאי2. הראיות הנוכחי מדגים GCA כרוך לאנטיגן לא ידוע מפעילה תאים דנדריטים ב- adventitia כלי הדם, ואחריו הגיוס של המסייע בתאי T (ה), במיוחד Th1 ו Th17 יחוברו אשר מפרישים אינטרלוקין-17 ו אינטרפרון-גמא (והסכמות) בהתאמה. והסכמות ואז מגייס ומפעיל מקרופאגים לייצר ציטוקינים, פרוטאזות. אלה כוללים ציטוקינים פרו-דלקתיים; כולל IL-12, אשר קישור הדדי מפעיל תאי Th1 המספקות מעגל משוב חיובי; הגידול גורם לנמק ו interleukin-6, אשר לגרום דלקת מפרקים, חום, metalloproteases זה גורם נזק הנדן אלסטי. Glucocorticoids (GC), אשר מהוות את טיפול כרוני סטנדרטי, שליטה חלקית המסלולים ציטוקין מאת attenuating ה-Th17/IL-17 אבל לא Th1/והסכמות הזרוע של התגובה החיסונית3,4. למרבה הצער, הפסקה של GC תוצאות התדרדרות המחלה. כמו מודאליות חלופית, מטוטרקסט יש כבר לשנות את ייעודו לטיפול GCA, אבל הקצה קליניים הרצוי לא עקבי הושגו למרות סמנים ביולוגיים יותר רגישים שלא נוצלו טיפולית ניטור5,6 . ב-2017, החוסם אינטרלוקין 6, טוסיליזומב, אושרה לטיפול GCA כמו זה ביעילות הפגינו מחלות ו סטרואידים ממעט אפקטים7,8.
נכון להיום, ישנם אין סמנים ביולוגיים טוב עבור GCA. כתוצאה מכך, קשה לעקוב אחר פעילות המחלה, titrate מינונים של תרופות זמינות כדי למנוע תופעות לוואי להפחית את הנטל של עלות לחברה. לכן, זה הכרחי כדי לחפש סמן המועמד כי בקורלציה עם פעילות המחלה, מספק תובנות הרומן על פתוגנזה וסיוע בקבלת החלטות טיפוליות.
Dysregulation של הפעלת מקרופאג הוא גורם קריטי GCA פתוגנזה. לפיכך, ייתכן אמצעי יעיל לטיפול GCA מיקוד סלקטיבי של מקרופאגים מופעל. חומצה פולית קולטן בטא (FRB) הוא גליקופרוטאין glycosyl-phosphatidylinositol זה מעוגנת על קרום התא הביע בתאים myelomonocytic נורמלי, תאים לוקמיה מיאלואידית ומופעל מקרופאגים. ליגנד שלה, חומצה פולית, היא ויטמין חיוני בצורתו מופחתת, המאפשרת הסלולר DNA סינתזה, מתילציה ותיקון9. FRB ביטוי מושרה במחלות אוטואימוניות, ובמהלך carcinogenesis. הביטוי שלה היא מוגבלת השטח של monocytes או הפרו דלקתיים מקרופאגים M1 ב דלקת מפרקים שגרונית, או אנטי-דלקתי M2 מקרופאגים מוצק איברים, ממאירות מיאלואידית10,11,12 , 13. בנוסף לתפקידה פוטנציאלי כמו סמן של מקרופאגים מופעל, FRB יכול לאפשר תחבורה סלקטיבית סמים thru תהליך רב שלבי שמתחיל עם האיגוד קולטן חומצה פולית, antifolates או מצומדת חומצה פולית סמים מהתא על פני השטח, ואחריו הפנמה, שחרור, בסופו של דבר מסירת הסם הרצוי ה תא פנימי מכונות12,14,15,16. בניגוד ל FRB לידי ביטוי תאים סרטניים ומופעל מקרופאגים, FRB לידי ביטוי תאים נורמליים hematopoietic הוא אפשרות לבצע איגוד folates ובכך מבטיחה כי FRB/חומצה פולית-מתווכת משלוח סמים הוא מוגבל FRB-חיוביות דלקתית או תאים סרטניים.
במחקר הקודם שלנו, להדגים בפעם הראשונה FRB מתבטאת GCA מקרופאגים, הביטוי שלה בקורלציה עם CD68 +, endothelin קולטן בטא מקרופאגים, אשר תורמים GCA פתוגנזה17. בדו ח זה, אנו מתארים את histopathological ואת immunohistochemical שיטות להערכת macrophage FRB את, וניתח את לימפוציט הכולל וסופרת מקרופאג כדי לזכות בתובנה מיקום של FRB בתוך הנוף GCA כלי הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות אושרו על ידי ועדת הבדיקה פן מוסדיים המדינה.
1. histopathological הכנה, עיבוד לאחר קבלת מהעורק ביופסיה
הערה: מהעורק ביופסיה (הכרטיסיה) מבוצע תחת הרדמה מקומית, בתנאים סטריליים על-ידי מנתח מוסמך. לאחר קבלת בניתוח מקטע עורקי 3 ס מ בצד המושפע יותר, הדגימה קבוע בפורמלין מיד במשך 24 שעות ביממה, מחולק למקטעים של 3-4 מ מ, והוא מוטבע, משלם תשומת-לב רבה יישור תקין של רקמות בבלוק פרפין אשר מאוחסנת לאחר מכן בטמפרטורת החדר. הבחירה הדגימה מבוצעת לאחר אימות הרפואיים. האבחנה מבוססת על המכללה האמריקאית של 1990 ראומטולוגיה קריטריונים אשר דורשת כי הנבדקים למלא 3 של 5 תחומים: גיל > 50 שנה, כאב ראש חדש, רוך בעורק הרקה, שקיעת דם של > 50 מ מ/שעה בשיטה Westergren, טאב חריג. בטיחות, כפפות מגן חובה לחבוש בכל עת בעת טיפול דגימות, כימיקלים נוגדנים.
- מבלוקים מוטבע, חותכים 4-5 מיקרומטר עבה למקטעים באמצעות מיקרוטום. הכתם ועם Hematoxylin אאוזין (H & E). השתמש מקטע בקרה של הרקמות שנבחר עבור אבטחת איכות.
- לצוף לחתוך קטעים על אמבט מים חמים מחומם עד 40 ° C כדי להסיר קמטים לאסוף עם מגלשת מיקרוסקופיים מצופה זכוכית. במקום שקופיות זכוכית על צלחת חמה בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות להקל על ייבוש תוך היצמדות של מקטע לשקופית.
- במקום שקופיות זכוכית על צלחת חמה בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות להקל על ייבוש תוך היצמדות של מקטע לשקופית.
- הר 3 סעיפים על שקופיות מיקרוסקופ.
- המקום בשקופיות אנכי לארון תקשורת ויבש בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- למקם את השקופיות מכולות וחנות ב 4 º C.
2. Immunohistochemical הכנה, Dewaxing, אחזור אנטיגן, צביעת15,18,19,20
- לטעון מגלשות לתוך ארון תקשורת שקופית. להפעיל את המדף דרך מנות כדלקמן: פעמיים ב- 100% קסילן למשך 5 דקות עם 10 שניות של עצבנות עדין כל 30 שניות, פעם ב 100% אתנול עם 10 שניות עצבנות, פעם ב- 90% אתנול עם 10 שניות עצבנות, פעם ב- 70% אתנול עם 10 שניות עצבנות , פעמיים בתוך זוגיות מזוקק H2O עם 10 שניות עצבנות.
הערה: טיפול של קסילן, אצטון צריך להיעשות בברדסים מאוורר כדי למנוע שאיפת ורעילות בדרכי הנשימה. - לאחזר אנטיגן על-ידי העברת ארון התקשורת לתוך מיכל הזכוכית עם 200 מיליליטר 10 mmol/L, pH ציטראט 6.0 מאגר prewarmed עד 95 מעלות צלזיוס. את הטיימר ל-30 דקות באמבט מים, ואז להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים זורמים במשך 5 דקות.
- הסר peroxidase אנדוגני פעילות על ידי המקננת ב 200 מ של 3% מי חמצן למשך 10 דקות. רחץ שקופיות 3 פעמים ב- µL 200 תמיסת באגירה טריס (TBSS).
- הסר את השקופיות מהמדף, כי אמחה קלות כל אחד בעדינות לנגב מאגר עודף. עבור צביעת, הוסף 200 µL של הנוגדנים הראשית הבאה, להוסיף שער גולשת בשקופיות, דגירה בחדר לחים למשך שעה בטמפרטורת החדר:
נוגדן anti-FRB מדולל 1:800
העכבר monoclonal האנטי-האדם CD68, 1:200 דילול
ארנב polyclonal anti-CD3 מטריים דילול
הערה: פורמלין-קבוע קטעים פרפין-מוטבע של השליה היו גם מעובד כפי שמתואר בספר 2.1 מדרגות 2.9, מודגרות עם אנטי-FRB18, משמש בקרה חיובית. צביעת התוצאות התקבלו על ידי מציאת ריכוז נוגדן אופטימלית, בוצע על ידי titrating הנוגדן ב דילולים זוגי (למשל 1:50 מטריים, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). - הסר את מכסה לאחר דגירה של ביטול. שקופיות 3 פעמים במשך 2 דקות כל אחד עם TBSS, ניקוז ושטפו מאגר עודף.
- להוסיף 200 µL של נוגדנים משניים, לאודנום biotinylated אנטי-Rabbit/עכבר נוגדנים משניים להגיב עם unconjugated נוגדן ראשוני מאוגדים רקמות אנטיגן. מקם coverslips בשקופיות ולאחר תקופת דגירה בחדר לחים של 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את מכסה לאחר דגירה של ביטול. שקופיות 3 פעמים במשך 2 דקות כל אחד עם TBS, לנקז ושטפו מאגר עודף.
- להוסיף 200 µL של diaminobenzidine (DAB) + מאגר המצע (Imidazole HCl)-chromogen מערכת דגירה ל-10 דקות להמחיש מכתים דפוס. לשטוף עם TBSS אז במים מהברז זורמים במשך 10 דקות.
- Counterstain עם hematoxylin במשך 3 דקות.
- הר השקופיות על-ידי החלת µL 70 של הרכבה בינונית על פני השטח של השקופית. לאט לאט עצה את coverslip אל המדיום הרכבה, הימנע מיצירת בועות כפי שאתה להנמיך אותו למקומו. המתן 24 שעות לייבוש.
3. histopathologic וניתוח Immunohistochemical (IHC)
לבחון את H & E ו- IHC צבעונית קטעים מן GCA חיובי ונורמלי הנבדקים באמצעות מיקרוסקופ אור.
-
עבור H & E צבעונית סעיפים:
- להעריך את הארכיטקטורה וסקולרית ולזהות תאי אנדותל אינטימה tunica, תאי שריר חלק tunica מדיה, ו fibroblasts ואת ואזא וזורום tunica adventitia21,22.
- לזהות תכונות GCA, אשר כוללים לימפוציטים, הסתננות מקרופאג/histiocyte, היפרפלזיה הסלולר והשפלות פרופריה אלסטית פנימית.
- לנתח לחדור lymphohistiocytic ידי בזיהוי וכימות המספר של מקרופאגים ביחס לימפוציטים. להעריך את מידת ההפרעה פרופריה אלסטית פנימית ושינויים hyperplastic בתאים תושב ולהשוות עם פקדים.
-
עבור IHC צבעונית סעיפים:
- לבחון את דפוס ההגדלה של FRB, לוקח הערה של הביטוי שלה על-ידי סוג מסוים או סוגים של תאים בתוך הרבדים כלי הדם ועל מערכת היחסים שלה כדי לחדור המערכת החיסונית הכולל, דה מרקר מקרופאג הכולל, anti-CD68 למחבת לימפוציט סמן אנטי CD3.
- לכמת הביטוי של תאים FRB, CD68 ו- CD3 על ידי ספירת התאים מוכתם באופן חיובי על 10 שדות שנבחרו באקראי מתח גבוה מרובים (hpf) והקלט את האמצעים.
הערה: זיהוי של תאים נורמליים ופיפטות ומבנים אלה בוצעו על ידי פתולוג מוסמך לב וכלי דם (קיבלתן), rheumatologist (אמ מ) והתוצאות נרשמו כל המקרים. - לכידת תמונות נציג באמצעות מצלמה דיגיטלית.
הערה: לאחר שלבים אלה, שנותרו aliquots ניתן לאחסן ב- 80 ° c
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ממצאים histopathologic
H & E כתמי באנטומיה עורקי נורמלי והפגינו דגימות נורמלי עם תאי אנדותל אינטימה tunica, תאי שריר חלק בתקשורת tunica, וקרא מטריצה קולגן heterogenous הכוללים fibroblasts וכלי מזין ואזא וזורום ב- adventitia tunica. יש לחדור דלקתיות לא מזוהה. העורקים טמפורלית חיובי GCA הפגינו בינוני עד לדלקת חמורה עם אגרגטים של מקרופאגים/histiocytes, לימפוציטים, ומדי פעם תאים פלזמה ותאים ענקיים multinucleated. היצרות luminal ציין, בליווי intimal הפרעה עיבוי ו 90% של הנדן אלסטית פנימית (איור 1).
ממצאים Immunohistochemical
CD3 + לימפוציטים ו CD68 + מקרופאגים היו קיימות בכל GCA + דגימות והפגינו דפוסים דומים מכתימים ב כל ביופסיות. לימפוציטים מילאו מעל מקרופאגים עם יחס CD3/CD68 של 1.6. צביעת עבור FRB הוגבל מקרופאגים ותאים multinucleated ענק אשר מעדיפים מקומית adventitia ומדיה (טבלה 1 ואיור 2). לשלוט דגימות הראה לויקוציטים מינימלי (< 5 תאים/גבוה-power שדה), אין ביטוי FRB.
איור 1: תמונות H & E של העורקים טמפורלית. (א) נציג H & E דימוי בעורק הרקה נורמלי עם שכבות שונות של adventitia tunica (t), מדיה, אינטימה מן החיצוני כדי Luminal/לנגדו צד בהתאמה. שימו לב הרשת של "ואסה" והקולגן וזורום את adventitia (חצים עבים), תאי השריר החלק בכלי התקשורת (חצים דקים), תאי אנדותל אינטימה (10 x הגדלה). (B) micrograph מוגדלת של הממשק האינטימה מדיה מודגשת על ידי שיבוץ מלבני א', מופרדת באמצעות הנדן אלסטית פנימית (חץ) (20 x הגדלה). (ג) נציג H & E תמונה של שיסחוב עם תא ענק arteritis המסומן transmural lymphohistiocytic לחדור (חצים עבים), היפרפלזיה intimal והרס של הנדן אלסטית פנימית (חץ) (10 x הגדלה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נוגדן עורקי זמני עם תא ענק arteritis. (א) להחליפן בתמונות להדגים לחדור דלקתיות נרחב עם CD68 חיובי מקרופאגים, תאי ענק (חיצים) נמצאו בעיקר ב- adventitia (10 x הגדלה) וכלי תקשורת. (B) חומצה פולית קולטן בטא (FRB) היה סלקטיבי לידי מופעל מקרופאגים (חיצים) (10 x הגדלה). תמונות שצולמו כוח עליון הפגינו מקרופאגים חיובי FRB ב (ג) ו מקרופאגים חיובי CD68 (D) (100 x הגדלה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| בנקיטת צעדים לקידום נושאים (n = 5) | זאת אומרת (±SD) |
| CD3 (% לחדור מערכת החיסון) | 61.7 ± 4.1 |
| CD68 (% לחדור מערכת החיסון) | 38.3 ± 4.1 |
| CD68 histiocytes/מקרופאגים (תאים/hpf) | 34.8 ± 10.4 |
| FRB + מקרופאגים (תאים/.hpf) | 10.8 ± 4.4 |
| %FRB/%CD68 | 31 ± 12.7 |
טבלה 1: סיכום של ביטוי FRB, CD68 ו- CD3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GCA וסקוליטיס הנפוצות ביותר אצל מבוגרים, והוא סימן ההיכר פיפטות שלה מדגימה שילוב חזק של לימפוציטים מסוג T helper ומופעל מקרופאגים שניתן למצוא גם מחלות גרגירומת ממושכת או vasculopathies כמו סרקואידוזיס אחרים, 2,polyangiitis גרגירומת ממושכת3. ב- GCA, העורק הטמפורלי מספק ייצוג טוב של עורק בגדלים בינוניים וגדולים ונותן הביופסיה TA מדגם נכבד שניתן לאחסן בבלוקים פרפין במשך שנים, ובכך ליצור הזדמנויות ללמוד את התפקידים של המתעוררים אבחון ו מטרות טיפולית כמו FRB microenvironment vasculitic. לקחנו את היתרון שהוצגו על ידי רקמת נגיש ושיטות immunopathologic רגיל לשאול אם להיות מנותח בצורה אמינה FRB באמצעות IHC. הממצאים שלנו להפגין histopathology ו- IHC יכול לשמש כלי רב ערך לא רק המאשרת את האבחון, במידה של נזק בכלי הדם, אלא גם את התפקיד של תתי סוגים שונים מקרופאג ב- GCA אימות.
Histopathology ופעולות IHC הם שניהם אינטנסיבי והם העבודה מחייבים את הכישורים של טכנאי מעבדה הומנית, פתולוג ו rheumatologist, אבל הטכניקות הוקמו טוב, יכול לשמש שיגור עבור שימוש בשיטות אחרות כגון cytometry immunofluorescence וזרימה. החיסרון של שיטות כאלה, אולם, הוא הצורך רקמות קפוא טרי המחייב אוסף פוטנציאליים. IHC, יחד עם היסטופתולוגיות, לא יסולא בפז בהצגת מבט פנורמי של כלי הדם microenvironment מערכת החיסון כי ניתן שוב ושוב לגשת לבדיקה במיוחד עם הופעתה של הרומן חלבונים כמו FRB. Hematoxylin ואאוזין (H & E) ההכתמה מאפשרת לסקור היסטולוגיה רקמות. Hematoxylin כתמי הגרעין, מדגיש את הפרטים הגרעיניים בזמן אאוזין משמש counterstain אשר מסייע להפגין את ההבדלים בין התכונות cytoplasmic גרעיני. השימוש של מקטע בקרה של הרקמות שנבחר הוא חיוני כדי להעריך עבור אבטחת איכות.
IHC מזהה אנטיגן עניין ברקמות קפוא או פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע באמצעות נוגדנים מרובים הם דמיינו ידי מיקרוסקופ. הפרוטוקול המתואר היה ממאמרו של ואן דר Heijden et al.15, אשר הפגינו FRB ביטוי מקרופאגים synovial ב דלקת מפרקים שגרונית. השלבים IHC חיוני כוללים הכנה רקמות, dewaxing/deparaffinization, אחזור אנטיגן, צביעת23. זה חיוני כדי להבטיח כי הרקמה הוסר מן המטופל מיד קבוע פורמלין ורקמות היישור והכיוון נשמר בקפידה בעת קבוע פרפין. הרקמה הוא דק למחלקה עם השימוש מיקרוטום ועוברים שלב dewaxing הדורשת מספר שוטף קסילן, אתנול, מים. השלב הבא, שנקרא אנטיגן אחזור, יש צורך לשבור את קישורים מתילן נוצר במהלך פורמלין קיבוע ודורש מאגר מבוסס-ציטראט עם חום לח. השקופיות מטופלים עם מימן על-חמצני כדי לחסום אנזימים אנדוגניים peroxidase יכולים להפריע זיהוי אנטיגן. ההליך מכתימים הבא מתבצע על ידי המקננת השקופיות עם נוגדנים העיקרי מדולל ילכוד אנטיגן עניין ואחריו החלת נוגדנים משניים כי יאתר את התגובה העיקרית אנטיגן-נוגדן. זה ואחריו תיוג עם chromogen DAB-המצע המהווה פיגמנט חום זה הוא מדמיין מתחת למיקרוסקופ. השלב הסופי הוא הרכבה זהיר של הרקמה עם פתרון קבוע כדי לוודא כי אין חומרים מפריעות כמו בועות נוצרות בין מכסה השטח. הפרוטוקול נדרשים שינויים כדי להתאים את השימוש ברקמות העורקים. מאז המחקר היה הראשון להעריך FRB ב GCA, ריכוז נוגדן אופטימלי לא היה ידוע וזקוקים דילולים מרובים-1:50, בטחונות, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1, 600, 1:3200 עם הטוב ביותר מכתים איכות רעש רקע או אות הנמוך שהושג ב 1:800.
FRB ממברנה-הקשורים שהוכח קודם לכן על ידי רוס 18,et al.24 נמצאה להתבטא תאים נורמליים היפרדות, נויטרופילים, תקיעות לוקמיה כרונית myelogenous, לוקמיה פרומיאלוציטית, אוכלוסיות myeloblast myelomonocytic, erythroleukemias, variably לוקמיה מיאלואידית חריפה M1/M2. הנוגדן polyclonal הארנב מטוהרים זיקה ספציפיות עבור FRB המשמש בעבודות קודמות אלה מאז הוחלו על מחקרים של דלקת מפרקים שגרונית מקרופאגים synovial חיובי מוצק איברים גידולים. הנוגדן FRB בשימוש פרוטוקול זה אינו זמין מסחרית ופוגעות עשויה יישום רחב. . שכעיקרון, המתודולוגיה המתוארת כאן תיתכן גם עבודה עבור אחרים נוגדנים FRB אך ידרוש אופטימיזציה בודדים לפני השימוש במספרים גדולים יותר. מאז FRB מתבטאת באופן משמעותי השליה, רקמה זו שימש שוב ושוב כפקד חיובי.
תכנון המחקר היה מוגבל על-ידי גודל מדגם קטן ואינו דורש אימות במספרים גדולים יותר של כרטיסיות שהושג באופן אידיאלי שלבי GCA מוקדם ומאוחר. בנוסף, מאז macrophage FRB יכול לשמש יעד פוטנציאליים האבחון והטיפול עם סוכנים מצומדת folic, antifolates, הנתונים שהושגו כאן תומך הצורך לבחון עוד יותר FRB פנוטיפ בהקשר של מקרופאג M1 ו- M2 קיטוב. לגבי אבחונים אחרים, ההזדמנויות פתוח. תוצאות עבור גישות הדמיה לא פולשנית בחומצה פולית FRB ממוקד מצומדת SPECT של חיית המחמד הדמיה סוכנים. בנוסף, בהתחשב בכך חדירה מקרופאג מהווה סימן היכר של התקדמות המחלה ופעילות טרשת עורקים, סקלרודרמה, סרקואידוזיס, דלקת מפרקים שגרונית, השימוש של פרוטוקול זה ניתן למצוא יישומים בתנאים אלו.
זהו הפרוטוקול הראשון לחקור את הביטוי ואת חלוקת FRB ב GCA. IHC המותר פנורמי של חתך הרוחב של תצוגות מרובות של ת א ומאפשר ניתוח ביחסים מספריים בין המערכת החיסונית לחדור את microenvironment עורקים. FRB כללה 30% של מקרופאגים הכולל שחדרו כל השכבות של הקיר כלי הדם, אבל מעניין, FRB היה לא נמצאו של אינטימה, מקומית רק adventitia ומדיה. דפוס זה של התפלגות עלול לגלות תובנות הרומן על FRB tropism מקרופאג להרכב קולגן דיפרנציאלית נמצאו שכבות adventitial25וכלי תקשורת. המערכת החיסונית לחדור כללה כ-60% לימפוציטים (כפי שהיא נמדדת פאן-לימפוציטים הסמן anti-CD3) ו 40% מקרופאגים (מסומן על ידי פאן-מקרופאג הסמן anti-CD68). מחקר שנערך לאחרונה בקורלציה CD3 עם רגישות גבוהה יותר לאבחון GCA בזמן אחר המקושר CD68 ביטוי פעילות המחלה גבוהה יותר. לכן, אנו מציעים כי חצרו GCA המערכת החיסונית כלי דם מוקדם מתחיל עם יחס מתקפל 60: 40 של לימפוציטים: המקרופאגים עם 30% מקרופאגים להיות FRB חיובי. זה דבר נכון גם לגבי, הדגימו באופן עקבי בחולים עם מחלה מוקדמת נוספת ניסויים עתידיים המאומת ורעיונותיהם. אם התפלגות זו לחדור הסלולר מחזיק באופן עקבי, הוא עשוי ואז לשמש סמן מורכב עבור פעילות המחלה GCA.
לסיכום, פרוטוקול זה הוכיח בפעם הראשונה הנוכחות של חדירה FRB בתקשורת ו- adventitia של העורקים טמפורלית GCA. מקרופאגים FRB ייצג כשליש מאוכלוסיית מקרופאג הכולל המוקדמות, פעיל microenvironment GCA המורכב מקרופאגים לימפוציטים בשיעור של 40%-60%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו התאפשרה בעזרת התמיכה של ד ר דאגלס מדרגות, מריאן קלינגר, אן Benko, חלוקה של ראומטולוגיה/המחלקה לרפואה ואת מולקולרית, Histopathologic הליבה מעבדה, פן סטייט הספר לרפואה של אוניברסיטת, הרשי פנסילבניה
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N.
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
- Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
