Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Замораживание-Thawing Метод для подготовки Chitosan-Поли (виниловый спирт) Гидрогели без перекрестных агентов и Diflunisal релиз исследований

Published: January 14, 2020 doi: 10.3791/59636
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Polymers and Materials Research, University of Sonora, 2Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Navarra

Summary

Метод замораживания-оттаивания используется для производства гидрогелей хитозано-поли (виниловый спирт) без перекрестных агентов. Для этого метода важно учитывать условия замерзания (температура, количество циклов) и соотношение полимеров, которые могут повлиять на свойства и применение полученных гидрогелей.

Abstract

Гидрогели хитозан-поли (виниловый спирт) могут быть произведены методом замораживания-оттаивания без использования токсичных перекрестных агентов. Применение этих систем ограничено их характеристиками (например, пористость, гибкость, отек потенциала, загрузка наркотиков и способность к выпуску лекарств), которые зависят от условий замораживания и вида и соотношения полимеров. В этом протоколе описывается, как готовить гидрогели из хитозана и поли (виниловый спирт) на 50/50 вт/ч% полимерного состава и изменяя температуру замерзания (-4 кВ, -20 градусов по Цельсию, -80 градусов по Цельсию) и циклы замораживания (4, 5, 6 циклов замораживания). Были получены спектры FT-IR, микрограф SEM и данные порисиметрии гидрогелей. Кроме того, были оценены отек и загрузка наркотиков и высвобождение дифлюнисала. Результаты микрографов SEM и порисиметрии показывают, что размер пор уменьшается, в то время как пористость уменьшается при более низких температурах. Процент отеков был выше при незначительной температуре замерзания. Изучен асеификаль из гидрогелей. Все сети поддерживают выпуск препарата в течение 30 ч, и было отмечено, что простой механизм диффузии регулирует дифлюнизал релиз в соответствии с Korsmeyer-Peppas и Хигути моделей.

Introduction

В последнее время гидрогели вызвали большой интерес в биомедицинской области, потому что они являются трехмерными сетями с высоким содержанием воды и мягкие и гибкие, поэтому они могут легко имитировать естественные ткани1. Кроме того, они не растворяются в вавочной среде при физиологической температуре и рН, но представляют собой большой отек2. Гидрогель может выступать в качестве тканевых инженерных лесов, средств гигиены, контактных линз и раневых повязок; потому что они могут ловушки и выпуска активных соединений и наркотиков, они используются в качестве системы доставки лекарств3. В зависимости от их применения, гидрогели могут быть сделаны из натуральных или синтетических полимеров, или сочетание обоих, для того, чтобы получить лучшие характеристики4.

Свойства гидрогелей являются следствием многих физических и химических факторов. На физическом уровне их структура и морфология зависят от их пористости, размера пор и распределения пор5. На химическом и молекулярном уровне, тип полимера, содержание гидрофильной группы вполимернойцепи, тип перекрестного точечного типа, и плотность перекрестного соединения являются факторами, которые определяют отек потенциала и механические свойства6,7.

В зависимости от типа перекрестного агента, используемого для формирования сети, гидрогели классифицируются как химические гидрогели или физические гидрогели. Химические гидрогели соединяются ковалентными взаимодействиями между их цепями, которые образуются в результате УФ-излучения и гамма-облучения или с помощью перекрестного агента7,8. Химические гидрогели обычно сильны и устойчивы, но, как правило, перекрестный агент токсичен для клеток и его удаление затруднено, поэтому его применение ограничено. С другой стороны, физические гидрогели образуются путем соединения полимерных цепей через нековалентные взаимодействия, избегая использования перекрестных агентов4,9. Основными нековалентными взаимодействиями в сети являются гидрофобные взаимодействия, электростатические силы, взаимодополняющие и водородные границы7.

Поли (виниловый спирт) (PVA, Рисунок 1a) является синтетическим и водорастворимым полимером с отличной механической производительностью и биосовместимостью, которая может от кросслинков без гидрогелей через метод замораживания оттаивания10,11. Этот полимер имеет возможность формировать концентрированные зоны водородных связей между -OH групп их цепей (кристаллических зон), когда они замораживают12. Эти кристаллические зоны выступают в качестве перекрестных точек в сети, и они способствуют два события: приближение полимерных цепей, когда кристаллическая вода расширяется и PVA конформационных изменений от изотаксических к синдиотаксической ПВА во время замораживания13. Из-за замораживания сушки, кристаллы воды сублимируются, оставляя пустоты пространства, которые являются порами в гидрогеле14. Для получения гидрогелей с лучшими свойствами, ПВА можно легко комбинировать с другими полимерами.

В этом смысле хитозан представляет собой вариант, поскольку он является единственным биополимером из природных источников с положительными зарядами. Он получается путем деацетилирования хитина и состоит из случайных комбинаций из 1,4 связанных D-глюкозамина (деацетилированной единицы) и N-ацетил-D-глюкозамина (ацетилированный блок)15,16 (Рисунок 1b). Хитозан биоразлагается человеческими ферментами и биосовместим. Кроме того, по своей катионной природе, он может взаимодействовать с отрицательным зарядом поверхности клетки, и это свойство было связано с его антимикробной активности17. Этот полимер прост в обработке; однако их механических свойств недостаточно, и некоторые материалы были добавлены в комплексы с лучшими характеристиками.

Учитывая специфические характеристики хитозана и ПВА, успешное производство гидрогелей было достигнуто методом замораживания оттаивания2,18, чтобы избежать использования токсичных перекрестных агентов. В гидрогелях хитозана-ПВА также образуются кристаллические зоны ПВА, а цепи хитозана взаимопронижаются и образуют простые водородные связи с группами -NH2 и -OH-группами в ПВА. Окончательный гидрогель хитозана-ПВА механически стабилен, с высокими показателями отеков и низкой токсичности, и с антибактериальным эффектом18. Однако, в зависимости от условий замораживания, используемых в подготовке (температура, время и количество циклов), конечные характеристики могут меняться. Некоторые исследования сообщают, что увеличение числа циклов замораживания уменьшает степень отеки и увеличивает прочность растяжения19,20. Для укрепления сети, другие агенты, такие как гамма и УФ-излучения и химических кросслинкеров были использованы дополнительно после замораживания оттаять подготовки21,22,23. Гидрогели с более высокой пропорцией хитозана имеют более пористую сеть и высокую мощность отеков, но меньшую прочность и тепловую стабильность. В этом контексте важно рассмотреть условия подготовки к получению подходящих гидрогелей для их целевого применения.

Цель этой работы состоит в том, чтобы подробно представить, как условия замораживания (температура замерзания и количество циклов) влияют на конечные характеристики гидрогелей CS-PVA. Были оценены спектры FT-IR, характеристики морфологических и пористости и отековая способность, а также способность к погрузке и высвобождению лекарств. В исследованиях выпуска, diflunisal(Рисунок 1c) был использован как снадобье модели, из-за своего размера пригодного к структуре гидрогеля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление гидрогелей хитозана-ПВА

  1. Подготовка 2% (w/w) хитозана и 10% (w/w) PVA решений. Растворите 0,2 г хитозана в 10 мл раствора 0,1 М СЧ3COOH (ранее фильтруемый) при комнатной температуре и поддерживайте непрерывное механическое перемешивание на ночь. Растворите 1 г ПВА в 10 мл дистиллированной воды и перемешайте при 80 градусах по Цельсию в течение 1 ч.
  2. Смешайте оба раствора 1:1 с помощью магнитного мешалки, пока они не будут однородными при комнатной температуре, и залить смеси на блюда Петри. Оставьте образцы на 2 ч при атмосферном давлении дегаз.
  3. Заморозить гидрогели при -4 градусах По цельсии, -20 градусов по Цельсию или -80 градусов по Цельсию на 20 ч и 4 цикла (образцы CP4-4, CP4-20 и CP4-80, соответственно). Заморозить другой гидрогель при -80 градусов по Цельсию в течение 20 ч с помощью 5 или 6 циклов замораживания (образцы CP5-80 и CP6-80). После третьего цикла замораживания промойте гидрогель деионизированной водой. В конце, заморозить сухой гидрогелей при -46 C для 48 ч и хранить для дальнейшей характеристики (методология адаптирована из2).

2. характеристика FT-IR

  1. Поместите маленький кусочек (1 мм х 2 мм) гидрогеля в спектрометре FT-IR в режиме ATR. Возьмите спектрFT-IR от 4000 до 600 см-1 (2 см-1 разрешения и в среднем 32 сканирования).

3. Анализы отеков

  1. Вырезать диски (13 мм в диаметре и 10 мм в высоту) из гидрогеля и взвесить их. Инкубировать диски в 50 мл деионированной воды с тряской при 25 градусах Цельсия. Повторите три раза.
  2. Каждые 30 минут удалить образец из среды, blotter устранить избыток воды, и весят. Рассчитайте степень отека с помощью уравнения Equation 1 1 и вычислить равновесное состояние отеков, , на 24 ч с помощью уравнения 2.
    Equation 2)
    Где Equation 3 вес сухого гидрогеля Equation 4 и вес мокрого гидрогеля.
    Equation 5

4. Электронная микроскопия

  1. Накройте маленький кусочек гидрогеля тонким золотым слоем (30 с и 10 мА) в распылительной шерсти.
  2. Поместите образец в сканирующий электронный микроскоп (SEM). Проанализируйте образцы под вакуумом при 20 кВ и возьмите изображения с 500x и 1500x увеличение.

5. Поросиметрия

  1. Поместите диски диаметром 15 мм весом около 0,26 г в пенетрометр (твердый пенетрометр, имеющий объем отсылки 0,3660 мл и 5,7831 мл стволового тома). Проанализируйте пористость и размер пор по Меркурию Вторжение Поросиметрии (MIP).
  2. Проведите эксперимент в режиме истерики (вторжение-экструзия). Измерьте общий объем вторжения (мл/г), общую площадь пор (м2/г),диаметр пор (мкм), пористость (%), проницаемость (мдарити) и тортуоз. Повторите дважды.

6. Загрузка и высвобождение наркотиков

  1. Перед погрузкой приготовьте 4 л из 15 мг/л раствора дифлюнисала и перемешайте на ночь. Подтвердить концентрацию раствора с помощью УФ-виш-спектроскопии (первоначальная концентрация). Действительно, набухают 400 мг лиофилизированных образцов гидрогеля в 6 мл дистиллированной воды на 24 ч.
  2. Для погрузки заполните колбу 50 мл раствора дифлунисаля и поддерживайте при 25 градусах Цельсия при постоянном перемешивании. Погрузите каждый набухающий гидрогель в колбу.
    1. Возьмите aliquots оставшегося раствора diflunisal (2 мл) в разное время для того, чтобы определить область плато кривой, например: 3, 6, 24, 27, 30 и 48 ч. После 24 ч замените раствор свежим.
  3. Измерьте абсорбцию на уровне 252 нм каждого aliquot, и определить концентрацию diflunisal присутствует в растворе, используя калибровку кривой diflunisal. Рассчитайте количество дифлюнисала, удерживаемого в гидрогеле на уровне 24 и 48 ч, как разница начальных и конечных концентраций, с учетом общего объема (56 мл).
    1. Определите эффективность инкапсуляции (EE) с помощью уравнения 3.
      Equation 6
    2. Заморозить загруженные гидрогели при -80 градусах по Цельсию и лиофилизировать их при -50 градусов по Цельсию.
  4. Для высвобождения препарата погрузите 300 мг лиофилизированных дифлюнисаловых гидрогелей в 50 мл фосфатного буфера (рН 7,4) при 25 градусах Цельсия. Поддерживайте постоянное перемешивание. Снимите aliquots 2 мл в разное время и замените свежей средой, чтобы сохранить постоянный объем.
    1. Уничтожай дифлюнизал, выделяемый спектрофотометрически на уровне 252 нм, в соответствии с кривой калибровки.
  5. Вывод преобладающий механизм выпуска препарата в гидрогелях корректировки данных о выпуске препарата, соответствующих первым 60%, к модели Корсмейер-Пеппас (Equation 4), для получения кинетической(k) и диффузии(n) константы. Значения n указывают механизм выпуска препарата24,25. Затем значения n, близкие к 0,5, связаны с фиккиане, между тем значения 0,5-1,0 для аномального транспорта, где задействованы диффузии и релаксации цепи, и, наконец, значения 1,0 связаны с случаем II транспорта.
    Equation 7
    1. Чтобы подтвердить результаты, используйте математические модели Higuchi, First order и Нулевой порядок (Equations 5 to 7) и выберите более подходящие модели.
    2. Equation 8
      Equation 9
      Equation 10
      где t представляет время отпуска, Mt количество снадобья поставленного на данном времени, и Mй общее количество снадобья поставленного на конце процесса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подготовка гидрогелей
Гидрогели Chitosan-PVA были получены при -4 градусах по Цельсию, -20 градусов по Цельсию и -80 градусов с 4 циклами замораживания и при -80 градусов по Цельсию с 5 и 6 циклами замораживания методом замораживания2. Все гидрогели были однородными, полупрозрачными, гибкими и устойчивыми к манипуляциям.

Характеристика FT-IR
Спектры FT-IR показаны на рисунке 2. Обнаружено семь характеристик полимеров хитозана и ПВА: на 3286 см-1 режим растяжения гидроксиловой группы ПВА (-OH) и на 2918 см-1 режим растяжения вибрации -CH группы26,27. Сигналы амид групп, представитель структуры хитозана, были обнаружены на 1652 см-1 в режиме растяжения вибрации C'O (амиде I), на 1560 см-1 к режиму вибрации флекции N-H (амиде II) и 1325 см-1 к вибрации амида III28,29,30. Другие сигналы, на 1418 см-1 в режиме вибрации флекции C-H и на 1086 см-1 к режиму растяжения вибрации групп C-O, как ПВА, были обнаружены27,31,32.

Электронная микроскопия
Все гидрогели CS-PVA показали очень пористую поверхность(рисунок 3,слева направо) и отличительные изменения наблюдались в соответствии с условиями подготовки. Гидрогели, приготовленные при -4 градусах по Цельсию (CP4-4), представляли более крупные поры, чем гидрогели, подготовленные при -80 градусах по Цельсию (CP4-80). Кроме того, последний, как представляется, имеет более пористую сеть. Этот эффект может быть связан с тем, что при более низкой температуре образование кристалла воды было быстрее и многие мелкие кристаллы появились и были сублимированы в процессе замораживания сушки, оставляя пустые поры14,33. Между тем, эффект от количества циклов замораживания, как представляется, способствуют более определенным и круговые поры в гидрогелях CP6-80(рисунок 3, сверху вниз).

Поросиметри
Образцы CP4-4, CP4-80 и CP6-80 представили более выраженные изменения; для того, чтобы дополнить информацию о морфологии, они были проанализированы MIP (Таблица 1). Сравнение гидрогелей CP4-4 и CP4-80(рисунок 3a)показало, что при более низкой температуре замораживания гидрогели создали более пористую сеть, которая представляла большой общий объем вторжения и более высокую общую область пор. Тем не менее, гидрогели CP6-80 показали меньшую проницаемость, чем CP4-80(Рисунок 3b),вероятно, из-за их высокой сложности, которая также была отражена в более низком общем объеме вторжения. На рисунке 3 представлены различные размеры пор этих гидрогелей. Были различимы два размера пор, один из них между 0,3-5,0 мкм, а другой - 5,0-30 мкм. В гидрогелях CP4-80 и CP6-80 пористая сеть имела большее количество мелких пор, чем крупные, по сравнению с гидрогелем CP4-4. Эти результаты были аналогичны тем, которые наблюдались на микрографах SEM, и показали, что при более низкой температуре более высокие взаимодействия между цепями ПВА были благоприятствования и более кристаллических зон были сформированы. Таким образом, формирование кристаллических зон цепями ПВА стимулировалось при низкой температуре.

Анализы отеков
На рисунке 4можно увидеть отекгидровидное поведение гидрогелей CS-PVA. Они быстро поглощают большое количество воды; в течение первых 5 часов они сохраняли свой вес в 10 раз, а через 20 часов сохраняли до 15-ти своего веса (точку равновесия). Однако в отношении гидрогелей, подготовленных в том же количестве циклов замораживания, гидрогель CP4-80 показал меньшую способность отеков в первые 5 часов в результате температуры, которая была использована для его подготовки (-80 градусов по Цельсию). В случае гидрогелей, подготовленных при различном количестве циклов замораживания (CP4-80, CP5-80 и CP6-80), никаких различий не было обнаружено в любое время. Вероятно, снижение отеков, наблюдаемых в гидрогелях, подготовленных при -80 градусах Цельсия, было вызвано небольшим размером пор гидрогеля.

Загрузка и высвобождение лекарств
Для оценки потенциала гидрогелей CS-PVA как систем доставки лекарств противовоспалительный препарат дифлюнисал был загружен в сеть и впоследствии выпущен. Эффективность инкапсуляции (EE) во всех этих системах составила около 70%; однако гидрогель CP4-80 представлен более незначительно EE на 73%(таблица 2). Между тем, высвобождая кинетика diflunisal от гидрогелей CS-PVA были поддержаны на около 30 h в всех случаях. Гидрогель CP4-80 выпустил наибольшее количество дифлюнисала(рисунок 5). Это может быть связано с тем, что этот гидрогель показал более пористую структуру по сравнению с двумя другими типами гидрогеля. Эта функция позволила небольшой молекуле препарата легко войти в сеть гидрогеля, а затем выпустить. Между CP4-80 и CP6-80 гидрогели не различия наблюдались во время выпуска времени(рисунок 6). Ни в одном из гидрогелей CS-PVA, который является перспективным для фармацевтического применения, не наблюдался эффект всплеска. Математические модели использовались для определения основного механизма высвобождения гидрогелей CS-PVA. Результаты были скорректированы с различными математическими моделями(Таблица 3) и в соответствии с n значения, было установлено, что диффузии Fick доминирует в процессе выпуска препарата.

Figure 1
Рисунок 1: Химическая структура ПВА(a),хитозан(b) и diflunisal(c). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: СПЕКТРы FT-IR из чистого хитозана и ПВА и гидрогели хитозана-ПВА, приготовленные в различных условиях замораживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: SEM микрографы гидрогелей хитозана-ПВА при увеличении 1500x. Распределение размеров гидрогелей хитозана-ПВА: гидрогели, приготовленные с 4 циклами замораживания и при -4 градусах по Цельсию и -80 градусов по Цельсию. б)Гидрогели готовятся при -80 градусах Цельсия и 4 и 6 циклах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Отек кинетики гидрогелей хитозана-ПВА: гидрогели с 4 циклами замораживания и b) гидрогели, приготовленные при -80 градусах Цельсия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Профили высвобождения Дифлюнисал вEquation 11 мг(a)и Mt/(b)для гидрогелей CP4-4 и CP4-80. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Профили высвобождения Дифлюнисал вEquation 11 мг(a)и Mt/(b)для гидрогелей CP4-80 и CP6-80. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Гидрогель Общий объем вторжения (мЛ/г) Общая площадь пор (м2/g) Пористость (%) Проницаемость (мдарити) Тортуозия
CP4-4 5.16 10.19 67.13 132.43 10.46
CP4-80 7.36 15.14 85.95 151.16 5.83
CP6-80 6.69 12.86 84.82 129.28 12.2

Таблица 1: Поросизетрия параметров пористой структуры гидрогелей хитозана-ПВА.

Образец Дифлунисал загружен Дифлюнисал освобожден
мг/г гидрогеля Эффективность инкапсуляции (%) % освобождены уважение к загружены
CP4-4 3,05 евро 0,09 71 79 х 3,33
CP4-80 3,22 и 0,47 73 86 и 0,4
CP6-80 3,19 х 0,05 68 80 и 3,9

Таблица 2: Инкапсуляция и эффективность выпуска гидрогелей хитозана-ПВА.

Образец Корсмайер-Пеппас Хигути Первый заказ Нулевой порядок
kKP x 102 N R2 kH x 102 R2 k1 x 102 R2 k0 x 102 R2
(мин-н) (мин-0,5) (мин-1) (мин-1)
CP4-4 4,3 и 0,39 0,44 и 0,02 0.99 3,1 и 0,1 0.98 0,29 и 0,03 0.803 0,18 евро 0,02 0.54
CP4-80 3,6 и 0,33 0,50 и 0,02 0.99 3,7 и 0,1 0.99 0,42 и 0,03 0.894 0,27 и 0,02 0.7
CP6-80 2,3 и 0,24 0,54 и 0,02 0.99 2,9 и 0,1 0.99 0,27 и 0,02 0.925 0,17 и 0,01 0.77
kк кинетическая константа; nдиффузия постоянная.

Таблица 3: Кинетические параметры дифлюнизалисального выброса из гидрогелей хитозана-ПВА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод замораживания-оттаивания является подходящим процессом для подготовки биосовместимых гидрогелей, сосредоточенных в биомедицинских, фармацевтических или косметических приложений34,35,36. Наиболее важным преимуществом этого метода, по сравнению с другими известными методами для подготовки гидрогелей, является то, что использование перекрестных агентов избежать, что может вызвать воспалительные реакции или неблагоприятные последствия в организме человека34. Это универсальный метод, поскольку он предлагает возможность подготовить гидрогели из ПВА или их смеси с различными полимерами11,37 таким образом, что новые характеристики из других полимеров могут быть получены в новом материале (например, основные возможности для поглощения воды, противомикробные или антиоксидантные свойства2,18,35). Однако важно учитывать, что включение других полимеров может уменьшить прочность гидрогелей19,37.

Основными параметрами, которые следует учитывать в методе замораживания, являются температура замораживания, время и количество циклов замораживания, а также соотношение полимеров (в случае полимерных смесей)2,19,20. Широкий спектр отек, морфологические и механические свойства могут быть получены с помощью этого метода, когда условия замораживания контролируются. Эти параметры непосредственно влияют на трехмерную конфигурацию сети в гидрогелях хитозана-ПВА, поскольку условия замораживания способствуют расположению цепей ПВА, к которым присоединяются физические взаимодействия, называемые кристаллическими зонами12,38. Эти кристаллические зоны являются концентрированными регионами водородных связей, которые выступают в качестве перекрестных точек в гидрогелях, которые поддерживают и образуют трехмерную сеть, и это втягивающая сила, когда гидрогели находятся в состоянии отек2,39,40.

В этом исследовании мы оценили эффект от нового диапазона температур замерзания (-4 градуса по Цельсию, -20 градусов по Цельсию и -80 градусов по Цельсию) в сочетании с различным количеством циклов замораживания (4, 5 и 6), но в то же время замораживания (20 ч), чтобы подготовить 1:1 гидрогели хитозана-ПВА. Самая низкая отековая способность наблюдалась при самой низкой температуре (-80 градусов по Цельсию). Действительно, гидрогели при такой низкой температуре получали меньшие поры и более пористые сети. Эти различия в гидрогелях хитозана-ПВА полезны для различных применений, таких как системы доставки лекарств или леса. В целом, гидрогели хитозана-ПВА представляют высокие показатели отеков, из-за хитозана гидрофильных групп (-NH2)41,42, и они мягкие, гибкие, просты в обращении и противостоять манипуляции из-за характеристик ПВА. В этом смысле метод замораживания оттаивания прост, дешев и быстр для производства гидрогелей хитозана-ПВА с различными свойствами, избегая токсичных перекрестных ссылок.

Хотя замораживание оттаивания является простым и дружественным методом, он имеет некоторые недостатки. Полная гомогенизация хитозана, в данном случае, и полимерных смесей очень важна. Гидрогель может представлять более хрупкие зоны и нерегулярную пористую структуру. Также необходимо сделать правильное растворение ПВА в воде при нагревании при 70-80 градусахПосЕС 42,43 за 1 ч при магнитном перемешивании. Охлаждение этого решения ПВА должно быть медленным при постоянном перемешивании, чтобы предотвратить образование твердого слоя ПВА.

Ограничением этого метода для анализов клеточной культуры является образование беловатых или полупрозрачных гидрогелей. В этом случае применение глицерола или ДМСО (токсическое соединение при комнатной температуре) может быть использовано для улучшения внешнего вида гидрогеля23,44. Шаг замораживания сушки замораживания метода для подготовки CS-PVA гидрогелей является критическим шагом, потому что гидрогели могут представлять сужение в средней зоне, которые усложняют работу и характеристики. Чтобы избежать этого, образец должен быть полностью заморожен до лиофилизации. Что касается погрузки и высвобождения препарата, то очень важно обеспечить, чтобы не было вмешательства в сигналы от компонентов гидрогеля и препарат, который должен быть количественно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарны C. Luzuriaga за поддержку в измерениях порисиметрии. Авторы также благодаря Министрио де Экономия и Competitividad Испании за финансовую поддержку (Проект MAT2014-59116-C2-2-R) и PIUNA (ref. 2018-15). Авторы также хотели бы поблагодарить д-ра Амира Мальдонадо из Departamento де Фесика-UNISON за поддержку и полезные комментарии и д-р SE Burruel-Ибарра из DIPM-UNISON для SEM изображений и Рубио Фарма и Asociados S. A. de C. V. за финансовую поддержку. ME Мартинес-Барбоза хотел бы поблагодарить CONACyT (Мексика) проекты No 104931 и No 256753, помимо финансовой поддержки от Красного Тематика де Nanociencias у Nanotecnologa дель программу де Редес Тематичас дель ConACyT. А также проект USO316001081. MD Фигероа-Пизано хотел бы отметить CONACyT за финансовую поддержку (стипендия 373321).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials:
Chitosan medium molecular weight Sigma-Aldrich 448877 Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid) Merck
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 1005706
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich 341584 Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto TED PELLA INC
Cryodos Lyophilizator Telstar
Falcon tubes Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopy Nicolet iS50 in ATR mode
Lyophilizator LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500 Micromeritics
Scanning electron microscope Pemtron SS-300LV
UV-visible spectrophotometer Agilent 8453

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gyles, D. A., Castro, L. D., Silva, J. O. C., Ribeiro-Costa, R. M. A review of the designs and prominent biomedical advances of natural and synthetic hydrogel formulations. European Polymer Journal. 88 (01), 373-392 (2017).
  2. Abdel-Mohsen, aM., Aly, aS., Hrdina, R., Montaser, aS., Hebeish, a Eco-Synthesis of PVA/Chitosan Hydrogels for Biomedical Application. Journal of Polymers and the Environment. 19, 1005-1012 (2011).
  3. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. European Polymer Journal. 65, 252-267 (2015).
  4. Ahmadi, F., Oveisi, Z., Samani, M., Amoozgar, Z. Chitosan based hydrogels: Characteristics and pharmaceutical applications. Research in Pharmaceutical Sciences. 10 (1), 1-16 (2015).
  5. Siepmann, J., Siegel, R. A., Rathbone, M. J. Fundamentals and applications of controlled release drug delivery. Fundamentals and Applications of Controlled Release Drug Delivery. , (2012).
  6. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, O. G. Hydrogels: Methods of Preparation, Characterisation and Applications. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications. , 117-146 (2011).
  7. Ahmed, E. M. Hydrogel: Preparation, characterization, and applications. Journal of Advanced Research. 6 (2), 105-121 (2015).
  8. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sensors and Actuators, B: Chemical. 147 (2), 765-774 (2010).
  9. Patel, A., Mequanint, K. Hydrogel Biomaterials. Biomedical Engineering - Frontiers and Challenges. , 275-296 (2012).
  10. Kenawy, E., Kamoun, E. A., El-meligy, M. A., Mohy, M. S. Physically crosslinked poly ( vinyl alcohol ) - hydroxyethyl starch blend hydrogel membranes Synthesis and characterization for biomedical applications. Arabian Journal of Chemistry. 7 (3), 372-380 (2014).
  11. Kamoun, E. A., Kenawy, E. R. S., Chen, X. A review on polymeric hydrogel membranes for wound dressing applications: PVA-based hydrogel dressings. Journal of Advanced Research. 8 (3), 217-233 (2017).
  12. Hassan, C. M., Peppas, N. A. Structure and Morphology of Freeze / Thawed PVA Hydrogels. Macromolecules. 33, 2472-2479 (2000).
  13. Tsou, Y. H., Khoneisser, J., Huang, P. C., Xu, X. Hydrogel as a bioactive material to regulate stem cell fate. Bioactive Materials. 1 (1), 39-55 (2016).
  14. Kumar, A., Mishra, R., Reinwald, Y., Bhat, S. Cryogels: Freezing unveiled by thawing. Materials Today. 13 (11), 42-44 (2010).
  15. Wu, T., Li, Y., Lee, D. S. Chitosan-based composite hydrogels for biomedical applications. Macromolecular Research. 25 (6), 480-488 (2017).
  16. Dutta, P. K., Dutta, J., Tripathi, V. S. Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications. Journal of Scientific and Industrial Research. 63, 20-31 (2004).
  17. Szymańska, E., Winnicka, K. Stability of Chitosan—A Challenge for Pharmaceutical and Biomedical Applications. Marine Drugs. 13, 1819-1846 (2015).
  18. Yang, X., Liu, Q., Chen, X., Yu, F., Zhu, Z. Investigation of PVA/ws-chitosan hydrogels prepared by combined gamma-irradiation and freeze-thawing. Carbohydrate Polymers. 73 (3), 401-408 (2008).
  19. Mathews, D. T., Birbey, Y. A., Cahill, P. A., McGuinness, G. B. Mechanical and Morphological Characteristics of Poly(vinyl alcohol)/Chitosan Hydrogels. Journal of Applied Polymer Science. 109, 1129-1137 (2008).
  20. Hosseini, M. S., Amjadi, I., Haghighipour, N. Preparation of Poly(vinyl alcohol)/Chitosan-Blended Hydrogels: Properties, in Vitro Studies and Kinetic Evaluation. Journal of Biomimetics, Biomaterials, and Tissue Engineering. 15, 63-72 (2012).
  21. Afshari, M. J., Sheikh, N., Afarideh, H. PVA/CM-chitosan/honey hydrogels prepared by using the combined technique of irradiation followed by freeze-thawing. Radiation Physics and Chemistry. 113, 28-35 (2015).
  22. Agnihotri, S., Mukherji, S. S., Mukherji, S. S. Antimicrobial chitosan-PVA hydrogel as a nanoreactor and immobilizing matrix for silver nanoparticles. Applied Nanoscience. 2 (3), 179-188 (2012).
  23. Yang, X., et al. Cytotoxicity and wound healing properties of PVA/ws-chitosan/glycerol hydrogels made by irradiation followed by freeze-thawing. Radiation Physics and Chemistry. 79 (5), 606-611 (2010).
  24. Machín, R., Isasi, J. R., Vélaz, I. Hydrogel matrices containing single and mixed natural cyclodextrins. Mechanisms of drug release. European Polymer Journal. 49 (12), 3912-3920 (2013).
  25. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A Simple Equation for Description of Solute Release. Journal of Controlled Release. 5, 37-42 (1987).
  26. Abureesh, M. A., Oladipo, A. A., Gazi, M. Facile synthesis of glucose-sensitive chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogel: Drug release optimization and swelling properties. International Journal of Biological Macromolecules. 90, 75-80 (2016).
  27. Mansur, H. S., Sadahira, C. M., Souza, A. N., Mansur, A. A. P. FTIR spectroscopy characterization of Poly(vinyl alcohol) hydrogel with different hydrolysis degree and chemically crosslinked with glutaraldehyde. Materials Science and Engineering C. 28 (4), 539-548 (2008).
  28. Parida, U. K., Nayak, A. K., Binhani, B. K., Nayak, P. L. Synthesis and Characterization of Chitosan-Polyvinyl Alcohol Blended with Cloisite 30B for Controlled Release of the Anticancer Drug Curcumin. Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology. 02 (04), 414-425 (2011).
  29. Zu, Y., et al. Preparation and characterization of chitosan-polyvinyl alcohol blend hydrogels for the controlled release of nano-insulin. International Journal of Biological Macromolecules. 50 (1), 82-87 (2012).
  30. Lejardi, A., Hernández, R., Criado, M., Santos, J. I., Etxeberria, A., Sarasua, J. R. Novel hydrogels of chitosan and poly ( vinyl alcohol ) -g-glycolic acid copolymer with enhanced rheological properties. Carbohydrate Polymers. , 267-273 (2014).
  31. dos Reis, E. F., et al. Synthesis and characterization of Poly(vinyl alcohol) hydrogels and hybrids for rMPB70 protein adsorption. Materials Research. 9 (2), 185-191 (2006).
  32. Thanyacharoen, T., Chuysinuan, P., Techasakul, S., Nooeaid, P., Ummartyotin, S. Development of a gallic acid-loaded chitosan and polyvinyl alcohol hydrogel composite: Release characteristics and antioxidant activity. International Journal of Biological Macromolecules. 107, 363-370 (2018).
  33. Lozinsky, V. I., et al. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. Trends in Biotechnology. 21 (10), 445-451 (2003).
  34. Liu, Y., Vrana, N. E., Cahill, P. A., McGuinness, G. B. Physically crosslinked composite hydrogels of PVA with natural macromolecules: Structure, mechanical properties, and endothelial cell compatibility. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 90 (2), 492-502 (2009).
  35. Yang, W., et al. Polyvinyl alcohol/chitosan hydrogels with enhanced antioxidant and antibacterial properties induced by lignin nanoparticles. Carbohydrate Polymers. 181 (August 2017), 275-284 (2018).
  36. Park, H., Kim, D. Swelling and mechanical properties of glycol chitosan/poly(vinyl alcohol) IPN-type superporous hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 78 (4), 662-667 (2006).
  37. Zhang, H., Zhang, F., Wu, J. Physically crosslinked hydrogels from polysaccharides prepared by freeze-thaw technique. Reactive and Functional Polymers. 73 (7), 923-928 (2013).
  38. Hassan, C. M., Peppas, N. A. Structure and Applications of Poly ( vinyl alcohol ) Hydrogels Produced by Conventional Crosslinking or by Freezing / Thawing Methods. Advances in Polymer Science. 153, 37-65 (2000).
  39. Sung, J. H., et al. Gel characterisation and in vivo evaluation of minocycline-loaded wound dressing with enhanced wound healing using polyvinyl alcohol and chitosan. International Journal of Pharmaceutics. 392 (1-2), 232-240 (2010).
  40. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: Network design and mathematical modeling. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (12-13), 1379-1408 (2006).
  41. Fan, L., Yang, H., Yang, J., Peng, M., Hu, J. Preparation and characterization of chitosan/gelatin/PVA hydrogel for wound dressings. Carbohydrate Polymers. 146, 427-434 (2016).
  42. Islam, A., et al. Evaluation of selected properties of biocompatible chitosan / poly ( vinyl alcohol) blends. International Journal of Biological Macromolecules. 82, 551-556 (2016).
  43. Physical Montaser, A. S. mechanical and antimicrobial evaluations of physically crosslinked PVA/chitosan hydrogels containing nanoparticles. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 6 (5), 1-6 (2016).
  44. Hou, Y., Chen, C., Liu, K., Tu, Y., Zhang, L., Li, Y. Preparation of PVA hydrogel with high-transparence and investigations of its transparent mechanism. RSC Advances. 5 (31), 24023-24030 (2015).

Tags

Биоинженерия Выпуск 155 Chitosan-Poly (виниловый спирт) гидрогели замораживание-оттаивание Дифлюнисал Наркотики погрузки и релиз исследований Сетевая характеристика Porosimetry
Замораживание-Thawing Метод для подготовки Chitosan-Поли (виниловый спирт) Гидрогели без перекрестных агентов и Diflunisal релиз исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa-Pizano, M. D., Vélaz,… More

Figueroa-Pizano, M. D., Vélaz, I., Martínez-Barbosa, M. E. A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Poly(vinyl alcohol) Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies. J. Vis. Exp. (155), e59636, doi:10.3791/59636 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter