Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En frys-upptining metod för att förbereda Chitosan-poly (vinyl alkohol) hydrogels utan crosslinking agenter och diflunisal release studier

Published: January 14, 2020 doi: 10.3791/59636
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Polymers and Materials Research, University of Sonora, 2Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Navarra

Summary

Frysning-upptining metoden används för att producera Chitosan-poly (vinyl alkohol) hydrogeler utan crosslinking agenter. För denna metod är det viktigt att beakta frys förhållandena (temperatur, antal cykler) och polymerförhållande, vilket kan påverka egenskaperna och tillämpningarna hos de erhållna hydrogelerna.

Abstract

Chitosan-poly (vinyl alkohol) hydrogeler kan framställas genom frysning-upptining metod utan att använda giftiga tvärbindningsmedel. Applikationerna av dessa system begränsas av deras kännetecken (e.g., porositet, böjlighet, bulnadkapacitet, drog laddning och drog frigör kapacitet), som beror på frysnings förhållandena och sorten och förhållandet av polymerer. Detta protokoll beskriver hur man förbereder hydrogeler från Chitosan och poly (vinylalkohol) vid 50/50 w/w% av polymersammansättningen och varierande frystemperatur (-4 ° c,-20 ° c,-80 ° c) och frys-upptining cykler (4, 5, 6 frysnings cykler). FT-IR Spectra, SEM Mikrograf och porosimetridata av hydrogeler erhölls. Också, svullnad kapacitet och drog lastning och frisättning av mefenaminsyra bedömdes. Resultat från SEM-mikrografer och porosimetri visar att porstorleken minskar, samtidigt som portionositeten ökar vid lägre temperaturer. Svullnaden procent var högre vid den mindre Frystemperaturen. Frisättning av mefenaminsyra från hydrogeler har studerats. Alla nätverk upprätthåller drogen release för 30 h och det har observerats att en enkel diffusion mekanism reglerar mefenaminsyra release enligt korsmeyer-Peppas och Higuchi modeller.

Introduction

Nyligen har hydrogeler väckt stort intresse för det biomedicinska området eftersom de är tredimensionella nätverk med högvatten halt och är mjuka och flexibla, så att de kan efterlikna naturliga vävnader lätt1. Också, de löses inte upp i vattenhaltigt medium vid fysiologisk temperatur och pH men uppvisar en stor svullnad2. Hydrogels kan fungera som vävnadstekniska ställningar, hygienprodukter, kontaktlinser och sårförband; eftersom de kan fälla och släppa aktiva föreningar och droger, de används som läkemedel leveranssystem3. Beroende på deras tillämpning, hydrogeler kan göras från naturliga eller syntetiska polymerer, eller en kombination av båda, för att få de bästa egenskaperna4.

Hydrogeler egenskaper är en följd av många fysikaliska och kemiska faktorer. På den fysiska nivån, deras struktur och morfologi beror på deras porositet, por storlek och pore distribution5. På kemisk och molekylär nivå, polymertyp, hydrofila gruppen innehållet i polymerkedjan, tvär bindnings punkt typ, och tvärbindningstäthet är de faktorer som avgör svullnad kapacitet och de mekaniska egenskaperna6,7.

Enligt den typ av tvärbindningsmedel som används för att bilda nätet, är hydrogeler klassificeras som kemiska hydrogeler eller fysiska hydrogeler. Kemiska hydrogeler förenas av kovalenta interaktioner mellan deras kedjor, som bildas genom UV-och Gammabestrålning eller med hjälp av en crosslinking agent7,8. Kemiska hydrogeler är vanligtvis starka och resistenta, men i allmänhet är crosslinking agent giftigt för cellerna och dess avlägsnande är svårt, så dess tillämpning är begränsad. Å andra sidan, fysiska hydrogeler bildas genom anslutning av polymeren kedjor genom icke-kovalenta interaktioner, undvika användning av tvärbindningsmedel4,9. De viktigaste icke-kovalenta interaktioner i nätverket är hydrofoba interaktioner, elektrostatiska krafter, kompletterande och väte gränser7.

Poly (vinyl Alcohol) (PVA, figur 1a) är en syntetisk och vattenlöslig polymer med utmärkt mekanisk prestanda och biokompatibilitet som kan från Crosslink agent-fria hydrogeler genom frys-upptining metod10,11. Denna polymer har kapaciteten att bilda koncentrerat zonplanerar av Väteförbindelser mellan-OH-grupper av deras kedjar (crystalline zonplanerar), när de fryser12. Dessa kristallina zoner fungerar som crosslinking punkter i nätverket, och de främjas av två händelser: närmar sig polymerkedjorna när kristallvattnet expanderar och PVA överensstämmande förändringar från isotactic till syndiotaktisk PVA under frys13. På grund av frystorkning, är vattenkristaller sublimeras, lämnar tomrum utrymmen som är porerna i hydrogel14. För att få hydrogeler med bättre egenskaper kan PVA enkelt kombineras med andra polymerer.

I den meningen utgör Chitosan ett alternativ eftersom det är den enda Biopolymeren från naturliga källor med positiva laddningar. Det erhålls genom deacetylering av chitinen och det består av slumpmässiga kombinationer av β-1,4 länkade d-glukosamin (deacetylerad enhet) och N-acetyl-D-glukosamin (Acetylerad enhet)15,16 (figur 1b). Chitosan är biologiskt nedbrytbart av humana enzymer och det är biokompatibelt. Också, genom sin katjoniska natur, det kan interagera med den negativa laddningen av cellytan, och denna egenskap har förknippats med dess antimikrobiella aktivitet17. Denna polymer är lätt att bearbeta; men deras mekaniska egenskaper är inte tillräckliga och vissa material har tillsatts för att bilda komplex med bättre egenskaper.

Med hänsyn till särdragen hos Chitosan och PVA har den framgångsrika tillverkningen av hydrogeler uppnåtts genom frys upptinnings metoden2,18 för att undvika användning av giftiga tvärbindningsmedel. I Chitosan-PVA hydrogels, de kristallina zonerna av PVA bildas också, och Chitosan kedjor är trängt igenom och bildar enkla vätebindningar med-NH2 grupper och-OH grupper i PVA. Den sista Chitosan-PVA hydrogel är mekaniskt stabil, med hög svullnad och låg toxicitet, och med antibakteriell effekt18. Beroende på de frys förhållanden som används vid beredningen (temperatur, tid och antal cykler) kan dock de slutgiltiga egenskaperna ändras. Vissa studier rapporterar att öka antalet frysnings cykler minskar svullnad grad och ökar draghållfasthet19,20. För att stärka nätverket, andra agenter såsom gamma och UV-strålning och kemiska bindare har använts dessutom efter frysning-tinade beredning21,22,23. Hydrogels med en högre Chitosan andel har en mer porösa nätverk och hög svullnad kapacitet men mindre styrka och termisk stabilitet. I detta sammanhang är det viktigt att överväga förberedelse villkoren för att få lämpliga hydrogeler för sin mål tillämpning.

Syftet med detta arbete är att i detalj presentera Hur frys förhållandena (frystemperatur och antal cykler) påverkar de slutliga egenskaperna hos CS-PVA-hydrogels. FT-IR-spektra, morfologiska och porositet egenskaper och svullnad kapacitet utvärderades, liksom drog lastning och frisättning kapacitet. I release studierna, mefenaminsyra (figur 1c) användes som modell drog, på grund av dess storlek lämpar sig för hydrogel struktur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av kitosan-PVA-hydrogeler

  1. Förbered 2% (w/w) Chitosan och 10% (w/w) PVA lösningar. Lös 0,2 g Chitosan i 10 mL 0,1 M CH3COOH-lösning (tidigare filtrerad) vid rumstemperatur och upprätthåll kontinuerlig mekanisk omrörning över natten. Lös 1 g PVA i 10 mL destillerat vatten och rör vid 80 ° c i 1 h.
  2. Blanda båda lösningarna 1:1 med hjälp av en magnetisk omrörare tills de är homogena vid rumstemperatur, och häll blandningar på petriskålar. Lämna proverna för 2 h vid atmosfärstryck till Degas.
  3. Frys hydrogeler vid-4 ° c,-20 ° c eller-80 ° c i 20 h och 4 cykler (prov CP4-4, CP4-20 respektive CP4-80). Frys en annan hydrogel vid-80 ° c i 20 timmar med 5 eller 6 frysnings cykler (proverna CP5-80 och CP6-80). Efter den tredje frys cykeln, tvätta hydrogeler med avjoniserat vatten. I slutet, frys-torka hydrogeler vid-46 ° c för 48 h och förvara för ytterligare karakterisering (metodik anpassad från2).

2. FT-IR karaktärisering

  1. Placera en liten bit (1 x 2 mm) hydrogel i FT-IR-spektrometern i ATR-läge. Ta FT-IR Spectra från 4000 till 600 cm-1 (2 cm-1 upplösning och genomsnitt av 32 skanningar).

3. svullnad analyser

  1. Klipp ut skivor (13 mm i diameter och 10 mm i höjd) från Hydrogelen och väg dem. Inkubera skivorna i 50 mL avjoniserat vatten med skakning vid 25 ° c. Upprepa tre gånger.
  2. Varje 30 min ta bort provet från mediet, läskpapper att eliminera överskottet av vatten, och väger. Beräkna svullnad grad med hjälp av ekvationen 1 och beräkna balansen tillstånd av svullnad, Equation 1 vid 24 h med hjälp av ekvationen 2.
    Equation 2)
    Var Equation 3 är vikten av den torra hydrogel och Equation 4 är vikten av våt hydrogel.
    Equation 5

4. elektronisk mikroskopi

  1. Täck en liten bit av hydrogel med ett tunt guldskikt (30 s och 10 mA) i en spotta coater.
  2. Sätt provet i ett Scanningelektronmikroskop (SEM). Analysera proverna under vakuum vid 20 kV och ta bilderna med en 500x och 1500x förstoring.

5. porosimetri

  1. Placera skivorna 15 mm i diameter som väger runt 0,26 g i penetrrometern (en solid penetrrometer, med en bulkvolym på 0,3660 mL och 5,7831 mL stamvolym). Analysera porositet och por storlek genom kvicksilver intrång Porosimetri (MIP).
  2. Genomför experimentet i hysteres-läget (intrångs extrudering). Mät den totala intrångs volymen (mL/g), total porarea (m2/g), pordiameter (μm), porositet (%), permeabilitet (mDarcy) och tortuositet. Upprepa två gånger.

6. Drug lastning och utsläpp

  1. Före lastning, Förbered 4 L av 15 mg/L mefenaminsyra lösning och rör över natten. Bekräfta koncentrationen av lösningen med UV-VIS-spektroskopi (Initial koncentration). I själva verket sväller 400 mg frystorkade prover av hydrogel i 6 mL destillerat vatten för 24 h.
  2. För lastning, Fyll en kolv med 50 ml mefenaminsyra lösning och behåll vid 25 ° c med ständig omrörning. Sänk samman varje svällda hydrogel i kolven.
    1. Ta alikvoter av kvarvarande mefenaminsyra lösning (2 ml) vid olika tidpunkter för att bestämma platån regionen av kurvan, till exempel: 3, 6, 24, 27, 30 och 48 h. Efter 24 h Ersätt lösningen med en ny.
  3. Mät absorbansen vid 252 nm i varje alikvot och bestäm koncentrationen av mefenaminsyra som finns i lösningen med hjälp av en kalibreringskurva för mefenaminsyra. Beräkna mängden mefenaminsyra som behålls i Hydrogelen vid 24 och 48 h, som skillnaden mellan initiala och slutliga koncentrationer, med hänsyn tagen till den totala volymen (56 ml).
    1. Bestäm inkapslingen effektivitet (EE) med hjälp av ekvation 3.
      Equation 6
    2. Frys de lastade hydrogeler vid-80 ° c och frystorkade dem vid-50 ° c.
  4. För läkemedelsfrisättning, dränera 300 mg frystorkad mefenaminsyra laddade hydrogeler i 50 ml fosfatbuffert (pH 7,4) vid 25 ° c. Upprätthåll ständig omrörning. Dra upp alikvoter på 2 mL vid olika tidpunkter och Ersätt med färskt medium för att hålla en konstant volym.
    1. Bestäm mefenaminsyra frisläppt spektrofotometriskt vid 252 nm, enligt en kalibreringskurva.
  5. Härleda den dominerande Drug release mekanismen i hydrogeler justera drogen release data som motsvarar den första 60%, till korsmeyer-Peppas-modellen (ekvation 4), för att erhålla Kinetic (k) och diffusion (n) konstanter. N -värdena indikerar mekanismen för läkemedelsfrisättning24,25. Sedan, n värden nära 0,5 är relaterade till fickian diffusion, under tiden värden på 0.5-1.0 för avvikande transport, där är inblandade diffusion och avslappning kedjor, och slutligen, värden på 1,0 är relaterade till fall II transport.
    Equation 7
    1. För att bekräfta resultaten, Använd modellerna Higuchi, First order och Zero order matematiska (ekvationer 5 till 7) och välj bättre passform.
    2. Equation 8
      Equation 9
      Equation 10
      där t representerar release tiden, MT mängden läkemedel som levereras vid en given tidpunkt, och M∞ den totala mängden läkemedel som levereras i slutet av processen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hydrogels beredning
Hydrogeler av Chitosan-PVA erhölls vid-4 ° c,-20 ° c och-80 ° c med 4 frysnings cykler och vid-80 ° c med 5 och 6 frysnings cykler med den tidigare rapporterade frys upptinnings metoden2. Alla hydrogeler var homogena, semi-transparenta, flexibla och resistenta mot manipulation.

FT-IR karaktärisering
FT-IR-spektrat visas i figur 2. Sju kännetecken signalerar av Chitosan och PVA-polymrer upptäcktes: på 3286 cm-1 det sträckning vibration funktionsläget av PVA-hydroxylgrupp (-OH) och på 2918 cm-1 sträcknings vibrationsläget av-CH grupp26,27. Signalerna från amidgrupper, representativa för Chitosan struktur, hittades på 1652 cm-1 till stretching vibrationsläge C = O (Amid I), vid 1560 cm-1 till reflektioner vibration läge N-H (Amid II) och 1325 cm-1 till vibrationen av Amid III28,29,30. Andra signaler, vid 1418 cm-1 till reflektioner vibrationsläge c-H och vid 1086 cm-1 till stretching vibrationsläge c-O grupper, båda av PVA, upptäcktes27,31,32.

Elektronisk mikroskopi
Alla CS-PVA hydrogeler visade en mycket porös yta (figur 3, från vänster till höger) och distinkta förändringar observerades enligt förberedelse villkoren. Hydrogeler som preparerade vid-4 ° c (CP4-4) presenterade större porer än de hydrogeler som preparerade vid-80 ° c (CP4-80). Det sistnämnda förefaller dessutom ha ett mer poröst nät. Denna effekt kan bero på det faktum att vid lägre temperatur, var vattnet kristall bildning snabbare och många små kristaller uppstod och sublimeras under frystorkning processen, lämnar tomrum porer14,33. Samtidigt verkar effekten av antalet frysnings cykler för att främja mer definierade och cirkulära porer i hydrogeler CP6-80 (figur 3, uppifrån och ned).

Porosimetri
Proverna CP4-4, CP4-80 och CP6-80 presenterade mer uttalade förändringar; för att komplettera informationen om morfologi analyserades de av MIP (tabell 1). Jämförelsen mellan hydrogeler CP4-4 och CP4-80 (figur 3a) visade att hydrogeler, vid en lägre temperatur av frysning, utvecklade ett mer poröst nätverk, vilket presenterade en stor total intrångs volym och en högre total porareal. Emellertid, hydrogeler CP6-80 visade mindre permeabilitet än CP4-80 (figur 3b), förmodligen på grund av deras höga tortuosity, vilket också återspeglas i en lägre total intrångs volym. Figur 3 visar de olika porstorlekarna på dessa hydrogels. Två porstorlekar utmärkte sig, en mellan 0,3-5,0 μm och andra mellan 5,0-30 μm. I hydrogeler CP4-80 och CP6-80, det porösa nätverket hade ett större antal små porer än stora, jämfört med CP4-4 hydrogel. Dessa resultat liknade de som observerats av SEM mikrografer och föreslog att vid lägre temperatur större interaktioner mellan PVA kedjorna gynnades och mer kristallina zoner bildades. På så sätt, bildandet av kristallina zoner av PVA kedjor, stimulerades vid låg temperatur.

Svullnad analyser
Den svullnad beteende CS-PVA hydrogeler kan ses i figur 4. De absorberas snabbt stora mängder vatten; för de första 5 timmarna de behöll 10X sin vikt, och efter 20 timmar de behåller upp till 15x sin vikt (jämvikt punkt). När det gäller hydrogeler som bereds vid samma antal frysnings cykler uppvisade hydrogel CP4-80 dock mindre svullnad under de första 5 timmarna till följd av den temperatur som användes vid beredningen (-80 ° c). När det gäller hydrogeler som bereds med olika antal frysnings cykler (CP4-80, CP5-80 och CP6-80) sågs inga skillnader när som helst. Förmodligen, den minskade svullnad kapacitet observerades i hydrogeler beredd på-80 ° c orsakades av den lilla porstorleken av hydrogel nätet.

Drug lastning och frisättning
För att utvärdera kapaciteten hos CS-PVA hydrogeler som system för läkemedelsleverans, var den antiinflammatoriska drogen mefenaminsyra laddad i nätverket och släpptes därefter. Inkapslingen effektivitet (EE) i alla dessa system var cirka 70%; emellertid, den CP4-80 hydrogel presenteras mer något EE på 73% (tabell 2). Under tiden, den releasing kinetik av mefenaminsyra från CS-PVA hydrogeler upprätthölls för ca 30 h i alla fall. Den CP4-80 hydrogel släppte den högsta mängden mefenaminsyra (figur 5). Detta kan bero på det faktum att denna hydrogel visade en mer porös struktur i jämförelse med de andra två typer av hydrogel. Denna funktion tillät den lilla molekyl av läkemedel för att enkelt komma in i hydrogel nätet och, då, att släppas. Mellan CP4-80 och CP6-80 hydrogeler observerades inga skillnader under release tider (figur 6). Ingen burst effekt observerades i någon av CS-PVA hydrogels, som är lovande för farmaceutiska tillämpningar. Matematiska modeller användes för att bestämma den viktigaste frigörningsmekanism i CS-PVA hydrogels. Resultaten justerades till olika matematiska modeller (tabell 3) och enligt n -värdena konstaterades att fick diffusion dominerar drogen releaseprocessen.

Figure 1
Figur 1: Kemisk struktur för PVA (a), Chitosan (b) och mefenaminsyra (c). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: FT-IR Spectra av ren Chitosan och PVA och, Chitosan-PVA hydrogeler beredd vid olika förhållanden för frysning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: SEM mikrografer av Chitosan-PVA hydrogeler på 1500x förstoring. Porstorlek fördelning av Chitosan-PVA hydrogeler: a) hydrogeler beredda med 4 cykler av frysning och vid-4 ° c och-80 ° c. b) hydrogeler som bereds vid-80 ° c och, 4 och 6 cykler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Svullnad kinetik av Chitosan-PVA hydrogeler: a) hydrogeler med 4 cykler av frysning och b) hydrogeler beredda vid-80 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Diflunisal release profiler i mg (a) och MT/Equation 11 (b) för hydrogeler CP4-4 och CP4-80. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Diflunisal release profiler i mg (a) och MT/Equation 11 (b) för hydrogeler CP4-80 och CP6-80. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Hydrogel Totalt intrångs volym (mL/g) Total porareal (m2/g) Porositet (%) Permeabilitet (mdarcy) Tortuosity
CP4-4 5,16 10,19 67,13 132,43 10,46
CP4-80 7,36 15,14 85,95 151,16 5,83
CP6-80 6,69 12,86 84,82 129,28 12,2

Tabell 1: Porosimetri parametrar av den porösa strukturen av Chitosan-PVA hydrogels.

Prov Diflunisal laddad Diflunisal släppt
mg/g hydro gel Inkapslingen effektivitet (%) % frisläppt avseende inläst
CP4-4 3,05 ± 0,09 71 79 ± 3,33
CP4-80 3,22 ± 0,47 73 86 ± 0,4
CP6-80 3,19 ± 0,05 68 80 ± 3,9

Tabell 2: Inkapsling och frisättning effektivitet för Chitosan-PVA hydrogels.

Prov Korsmeyer-Peppas Higuchi Första beställningen Nollordning
kKP x 102 N R2 kH x 102 R2 k1 x 102 R2 k0 x 102 R2
(min-n) (min-0,5) (min-1) (min-1)
CP4-4 4,3 ± 0,39 0,44 ± 0,02 0,99 3,1 ± 0,1 0,98 0,29 ± 0,03 0,803 0,18 ± 0,02 0,54
CP4-80 3,6 ± 0,33 0,50 ± 0,02 0,99 3,7 ± 0,1 0,99 0,42 ± 0,03 0,894 0,27 ± 0,02 0,7
CP6-80 2,3 ± 0,24 0,54 ± 0,02 0,99 2,9 ± 0,1 0,99 0,27 ± 0,02 0,925 0,17 ± 0,01 0,77
k= kinetisk konstant; n= diffusions konstant.

Tabell 3: Kinetiska parametrar för mefenaminsyra frisättning från Chitosan-PVA hydrogels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Frys-upptinning metoden är en lämplig process för att förbereda biokompatibla hydrogeler fokuserade på biomedicinska, farmaceutiska eller kosmetiska tillämpningar34,35,36. Den viktigaste fördelen med denna metod, jämfört med andra välkända metoder för att förbereda hydrogels, är att crosslinking agent användning undviks, vilket kan orsaka en inflammatorisk reaktion eller negativa effekter i den mänskliga kroppen34. Detta är en mångsidig metod eftersom det ger möjlighet att förbereda hydrogeler från PVA eller deras blandningar med olika polymerer11,37 på ett sådant sätt att nya egenskaper från de andra polymererna kan erhållas i det nya materialet (t. ex. stor kapacitet att absorbera vatten, antimikrobiella eller antioxiderande egenskaper2,18,35). Det är dock viktigt att tänka på att införlivandet av andra polymerer kan minska styrkan av hydrogeler19,37.

De viktigaste parametrarna att beakta i frys upptining metoden är frysnings temperaturen, tiden och antalet frysnings cykler, och även polymerkvoten (i fråga om polymerblandningar)2,19,20. Ett brett spektrum av svullnad, morfologiska och mekaniska egenskaper kan erhållas med denna metod när frys förhållandena kontrolleras. Dessa parametrar påverkar direkt den tredimensionella nätverkskonfigurationen i Chitosan-PVA-hydrogeler eftersom frys förhållandena främjar arrangemangen i PVA-kedjor, som förenas av fysiska interaktioner, s.k. kristallina zoner12,38. Dessa kristallina zoner är koncentrerade regioner av vätebindningar som fungerar som tvär bindnings punkter i hydrogeler, som upprätthåller och bildar den tredimensionella nätverk och det är en upprullningskraft när hydrogeler är i svullnad tillstånd2,39,40.

I denna studie utvärderade vi effekten av ett nytt sortiment av frys-upptinnings temperaturer (-4 ° c,-20 ° c och-80 ° c) kombinerat med ett annat antal frysnings cykler (4, 5 och 6) men samma tid för frysning (20 h), för att förbereda 1:1 Chitosan-PVA hydrogels. Den lägsta svullnad kapaciteten observerades vid den lägsta temperaturen (-80 ° c). Faktum är att hydrogeler vid denna lägsta temperatur erhålls de mindre porerna och de mer porösa näten. Dessa skillnader i Chitosan-PVA hydrogeler är användbara för olika tillämpningar såsom läkemedelsleverans system eller ställningar. I allmänhet, Chitosan-PVA hydrogeler presentera höga frekvenser av svullnad, på grund av Chitosan hydrofila grupper (-NH2)41,42, och de är mjuka, flexibla, lätt att hantera och motstå manipulation på grund av PVA egenskaper. I den meningen är frys-upptinning metod lätt, billig och snabb att producera Chitosan-PVA hydrogeler med olika egenskaper, undvika giftiga crosslinking.

Även om frysning-upptinning är en enkel och vänlig metod, har vissanackdelar. En fullständig homogenisering av Chitosan, i detta fall, och av polymerblandningar är mycket viktigt. Hydrogels kan presentera mer ömtåliga zoner och en oregelbunden porös struktur. Dessutom är det nödvändigt att göra en korrekt upplösning av PVA i vatten genom upphettning vid 70-80 ° c42,43 för 1 h under magnetisk omrörning. Kylning av denna PVA-lösning måste vara långsam med ständig omrörning för att förhindra bildandet av ett solitt skikt av PVA.

En begränsning av denna metod, för cellkulturer analyser, är bildandet av vitaktig eller halvtransparent hydrogels. I detta fall kan tillämpningen av glycerol eller DMSO (giftig förening vid rumstemperatur) användas för att förbättra utseendet på hydrogel23,44. Den frystorkning steg av frys-upptinning metod för att förbereda CS-PVA hydrogeler är ett kritiskt steg, eftersom hydrogeler kunde presentera en sammandragning i mittzonen, vilket kompliserar arbetet och karakterisering. För att undvika detta måste provet hållas helt fryst före frystorkade. När det gäller läkemedels belastning och frisättning, är det mycket viktigt att se till att det inte finns någon interferens med signalerna från hydrogel komponenterna och drogen som skall kvantifieras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma för C. Luzuriaga för stöd i porosimetri mätningar. Författarna tackar också Ministerio de Economía y Competitividad i Spanien för ekonomiskt stöd (projekt MAT2014-59116-C2-2-R) och PIUNA (Ref. 2018-15). Författarna vill också erkänna Dr Amir Maldonado från Departamento de Física-UNISON för stöd och hjälpsamma kommentarer och Dr. SE Burruel-Ibarra från DIPM-UNISON för SEM bilder och Rubio Pharma y Asociados S. A. de C. V. för finansiellt stöd. Jag Martínez-Barbosa skulle vilja tacka CONACyT (México) projekt nr 104931 och nr 256753, förutom det ekonomiska stödet från Red Temática de Nanociencias y Nanotecnología del programa de Redes Temáticas del CONACyT. Och även projekt USO316001081. MD Figueroa-Pizano skulle vilja erkänna CONACyT för ekonomiskt stöd (stipendium 373321).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials:
Chitosan medium molecular weight Sigma-Aldrich 448877 Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid) Merck
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 1005706
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich 341584 Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto TED PELLA INC
Cryodos Lyophilizator Telstar
Falcon tubes Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopy Nicolet iS50 in ATR mode
Lyophilizator LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500 Micromeritics
Scanning electron microscope Pemtron SS-300LV
UV-visible spectrophotometer Agilent 8453

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gyles, D. A., Castro, L. D., Silva, J. O. C., Ribeiro-Costa, R. M. A review of the designs and prominent biomedical advances of natural and synthetic hydrogel formulations. European Polymer Journal. 88 (01), 373-392 (2017).
  2. Abdel-Mohsen, aM., Aly, aS., Hrdina, R., Montaser, aS., Hebeish, a Eco-Synthesis of PVA/Chitosan Hydrogels for Biomedical Application. Journal of Polymers and the Environment. 19, 1005-1012 (2011).
  3. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. European Polymer Journal. 65, 252-267 (2015).
  4. Ahmadi, F., Oveisi, Z., Samani, M., Amoozgar, Z. Chitosan based hydrogels: Characteristics and pharmaceutical applications. Research in Pharmaceutical Sciences. 10 (1), 1-16 (2015).
  5. Siepmann, J., Siegel, R. A., Rathbone, M. J. Fundamentals and applications of controlled release drug delivery. Fundamentals and Applications of Controlled Release Drug Delivery. , (2012).
  6. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, O. G. Hydrogels: Methods of Preparation, Characterisation and Applications. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications. , 117-146 (2011).
  7. Ahmed, E. M. Hydrogel: Preparation, characterization, and applications. Journal of Advanced Research. 6 (2), 105-121 (2015).
  8. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sensors and Actuators, B: Chemical. 147 (2), 765-774 (2010).
  9. Patel, A., Mequanint, K. Hydrogel Biomaterials. Biomedical Engineering - Frontiers and Challenges. , 275-296 (2012).
  10. Kenawy, E., Kamoun, E. A., El-meligy, M. A., Mohy, M. S. Physically crosslinked poly ( vinyl alcohol ) - hydroxyethyl starch blend hydrogel membranes Synthesis and characterization for biomedical applications. Arabian Journal of Chemistry. 7 (3), 372-380 (2014).
  11. Kamoun, E. A., Kenawy, E. R. S., Chen, X. A review on polymeric hydrogel membranes for wound dressing applications: PVA-based hydrogel dressings. Journal of Advanced Research. 8 (3), 217-233 (2017).
  12. Hassan, C. M., Peppas, N. A. Structure and Morphology of Freeze / Thawed PVA Hydrogels. Macromolecules. 33, 2472-2479 (2000).
  13. Tsou, Y. H., Khoneisser, J., Huang, P. C., Xu, X. Hydrogel as a bioactive material to regulate stem cell fate. Bioactive Materials. 1 (1), 39-55 (2016).
  14. Kumar, A., Mishra, R., Reinwald, Y., Bhat, S. Cryogels: Freezing unveiled by thawing. Materials Today. 13 (11), 42-44 (2010).
  15. Wu, T., Li, Y., Lee, D. S. Chitosan-based composite hydrogels for biomedical applications. Macromolecular Research. 25 (6), 480-488 (2017).
  16. Dutta, P. K., Dutta, J., Tripathi, V. S. Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications. Journal of Scientific and Industrial Research. 63, 20-31 (2004).
  17. Szymańska, E., Winnicka, K. Stability of Chitosan—A Challenge for Pharmaceutical and Biomedical Applications. Marine Drugs. 13, 1819-1846 (2015).
  18. Yang, X., Liu, Q., Chen, X., Yu, F., Zhu, Z. Investigation of PVA/ws-chitosan hydrogels prepared by combined gamma-irradiation and freeze-thawing. Carbohydrate Polymers. 73 (3), 401-408 (2008).
  19. Mathews, D. T., Birbey, Y. A., Cahill, P. A., McGuinness, G. B. Mechanical and Morphological Characteristics of Poly(vinyl alcohol)/Chitosan Hydrogels. Journal of Applied Polymer Science. 109, 1129-1137 (2008).
  20. Hosseini, M. S., Amjadi, I., Haghighipour, N. Preparation of Poly(vinyl alcohol)/Chitosan-Blended Hydrogels: Properties, in Vitro Studies and Kinetic Evaluation. Journal of Biomimetics, Biomaterials, and Tissue Engineering. 15, 63-72 (2012).
  21. Afshari, M. J., Sheikh, N., Afarideh, H. PVA/CM-chitosan/honey hydrogels prepared by using the combined technique of irradiation followed by freeze-thawing. Radiation Physics and Chemistry. 113, 28-35 (2015).
  22. Agnihotri, S., Mukherji, S. S., Mukherji, S. S. Antimicrobial chitosan-PVA hydrogel as a nanoreactor and immobilizing matrix for silver nanoparticles. Applied Nanoscience. 2 (3), 179-188 (2012).
  23. Yang, X., et al. Cytotoxicity and wound healing properties of PVA/ws-chitosan/glycerol hydrogels made by irradiation followed by freeze-thawing. Radiation Physics and Chemistry. 79 (5), 606-611 (2010).
  24. Machín, R., Isasi, J. R., Vélaz, I. Hydrogel matrices containing single and mixed natural cyclodextrins. Mechanisms of drug release. European Polymer Journal. 49 (12), 3912-3920 (2013).
  25. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A Simple Equation for Description of Solute Release. Journal of Controlled Release. 5, 37-42 (1987).
  26. Abureesh, M. A., Oladipo, A. A., Gazi, M. Facile synthesis of glucose-sensitive chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogel: Drug release optimization and swelling properties. International Journal of Biological Macromolecules. 90, 75-80 (2016).
  27. Mansur, H. S., Sadahira, C. M., Souza, A. N., Mansur, A. A. P. FTIR spectroscopy characterization of Poly(vinyl alcohol) hydrogel with different hydrolysis degree and chemically crosslinked with glutaraldehyde. Materials Science and Engineering C. 28 (4), 539-548 (2008).
  28. Parida, U. K., Nayak, A. K., Binhani, B. K., Nayak, P. L. Synthesis and Characterization of Chitosan-Polyvinyl Alcohol Blended with Cloisite 30B for Controlled Release of the Anticancer Drug Curcumin. Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology. 02 (04), 414-425 (2011).
  29. Zu, Y., et al. Preparation and characterization of chitosan-polyvinyl alcohol blend hydrogels for the controlled release of nano-insulin. International Journal of Biological Macromolecules. 50 (1), 82-87 (2012).
  30. Lejardi, A., Hernández, R., Criado, M., Santos, J. I., Etxeberria, A., Sarasua, J. R. Novel hydrogels of chitosan and poly ( vinyl alcohol ) -g-glycolic acid copolymer with enhanced rheological properties. Carbohydrate Polymers. , 267-273 (2014).
  31. dos Reis, E. F., et al. Synthesis and characterization of Poly(vinyl alcohol) hydrogels and hybrids for rMPB70 protein adsorption. Materials Research. 9 (2), 185-191 (2006).
  32. Thanyacharoen, T., Chuysinuan, P., Techasakul, S., Nooeaid, P., Ummartyotin, S. Development of a gallic acid-loaded chitosan and polyvinyl alcohol hydrogel composite: Release characteristics and antioxidant activity. International Journal of Biological Macromolecules. 107, 363-370 (2018).
  33. Lozinsky, V. I., et al. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. Trends in Biotechnology. 21 (10), 445-451 (2003).
  34. Liu, Y., Vrana, N. E., Cahill, P. A., McGuinness, G. B. Physically crosslinked composite hydrogels of PVA with natural macromolecules: Structure, mechanical properties, and endothelial cell compatibility. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 90 (2), 492-502 (2009).
  35. Yang, W., et al. Polyvinyl alcohol/chitosan hydrogels with enhanced antioxidant and antibacterial properties induced by lignin nanoparticles. Carbohydrate Polymers. 181 (August 2017), 275-284 (2018).
  36. Park, H., Kim, D. Swelling and mechanical properties of glycol chitosan/poly(vinyl alcohol) IPN-type superporous hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 78 (4), 662-667 (2006).
  37. Zhang, H., Zhang, F., Wu, J. Physically crosslinked hydrogels from polysaccharides prepared by freeze-thaw technique. Reactive and Functional Polymers. 73 (7), 923-928 (2013).
  38. Hassan, C. M., Peppas, N. A. Structure and Applications of Poly ( vinyl alcohol ) Hydrogels Produced by Conventional Crosslinking or by Freezing / Thawing Methods. Advances in Polymer Science. 153, 37-65 (2000).
  39. Sung, J. H., et al. Gel characterisation and in vivo evaluation of minocycline-loaded wound dressing with enhanced wound healing using polyvinyl alcohol and chitosan. International Journal of Pharmaceutics. 392 (1-2), 232-240 (2010).
  40. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: Network design and mathematical modeling. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (12-13), 1379-1408 (2006).
  41. Fan, L., Yang, H., Yang, J., Peng, M., Hu, J. Preparation and characterization of chitosan/gelatin/PVA hydrogel for wound dressings. Carbohydrate Polymers. 146, 427-434 (2016).
  42. Islam, A., et al. Evaluation of selected properties of biocompatible chitosan / poly ( vinyl alcohol) blends. International Journal of Biological Macromolecules. 82, 551-556 (2016).
  43. Physical Montaser, A. S. mechanical and antimicrobial evaluations of physically crosslinked PVA/chitosan hydrogels containing nanoparticles. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 6 (5), 1-6 (2016).
  44. Hou, Y., Chen, C., Liu, K., Tu, Y., Zhang, L., Li, Y. Preparation of PVA hydrogel with high-transparence and investigations of its transparent mechanism. RSC Advances. 5 (31), 24023-24030 (2015).

Tags

Bioteknik utgåva 155 Chitosan-poly (vinyl Alcohol) hydrogels frys-upptining diflunisal Drug lastning och frisättning studier nätverk karakterisering Porosimetri
En frys-upptining metod för att förbereda Chitosan-poly (vinyl alkohol) hydrogels utan crosslinking agenter och diflunisal release studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa-Pizano, M. D., Vélaz,… More

Figueroa-Pizano, M. D., Vélaz, I., Martínez-Barbosa, M. E. A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Poly(vinyl alcohol) Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies. J. Vis. Exp. (155), e59636, doi:10.3791/59636 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter