Summary
Este protocolo descreve um modelo do rato da fibrose intestinal conduzida salmonela que se assemelha a características patológicas chaves de Crohn ' doença de s que inclui a inflamação e a fibrose transmural. Este método pode ser usado para avaliar os fatores hospedeiros que alteram os desfechos fibróticos usando camundongos mutantes mantidos em um fundo genético C57Bl/6.
Abstract
A fibrose tecidual caracterizada pelo acúmulo patológico de matriz extracelular, como o colágeno, é o desfecho de inflamação persistente e reparo disregulado. Na doença inflamatória intestinal (DII), a fibrose leva a formações críticas recorrentes para as quais não há nenhuma terapia eficaz além da ressecção cirúrgica. Devido ao seu início tardio, os processos que impulsionam a fibrose são menos estudados e em grande parte desconhecidos. Conseqüentemente, as complicações fibrótica representam um desafio principal no IBD. Neste protocolo, um modelo in vivo robusto de fibrose intestinal é descrito em que o pré-tratamento com estreptomicina de camundongos C57Bl/6 seguidos por gavagem oral com o mutante de Salmonella typhimurium ΔAroA de grau vacinal leva à colonização persistente do patógeno e fibrose do cálio. Metodologias para a preparação de S. O δaroa de typhimurium para a inoculação, quantificando cargas do micróbio patogénico no ceco e no spleen, e avaliando a deposição do colagénio em tecidos intestinais é explicado. Este modelo de doença experimental é útil para examinar os fatores hospedeiros que aumentam ou exacerbam a fibrose intestinal semelhante a um CD.
Introduction
A colite ulcerosa (UC) e a doença de Crohn (DC) são as duas principais formas de DII e são caracterizadas como distúrbios inflamatórios crônicos e recidivantes do trato gastrointestinal 1,2. Estes distúrbios têm um grande impacto na qualidade de vida dos pacientes. Os sintomas de DII incluem dor abdominal, diarreia, náuseas, perda de peso, febre e fadiga3. Estudos recentes identificaram fatores genéticos e ambientais que contribuem para a patogênese da doença; Pensa-se que tais fatores de risco contribuem para a ruptura da barreira epitelial, resultando na translocação ou Superamostragem de antígenos luminais4. Como consequência, isso inicia uma resposta inflamatória aberrante à flora comensal mediada pelas células imunológicas intestinais4. As características das complicações associadas ao IBD podem estender-se a sítios além do trato gastrointestinal que afetam váriosórgãos, incluindoarticulações, pele e fígado1,2. As características da UC incluem inflamação severa e difusa tipicamente localizada no cólon1. A patologia da doença afeta a mucosa e a submucosa do intestino, resultando em ulcerações mucosas superficiais1. Por outro lado, a DC pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal, embora a evidência de doença seja comumente encontrada no cólon e no íleo distal2. Além disso, a inflamação em CD é transmural, afetando todas as camadas da parede intestinal2.
Vários genes de suscetibilidade ao IBD que foram identificados indicariam que a desregulação da barreira epitelial ou imunidade são contribuintes críticos para a progressão da doença5. As mutações no domínio 2 do oligomerização do nucleotide (NOD2) expressada por monócitos foram encontradas para ser associadas com a susceptibilidade aumentada ao CD; Isto destaca uma ligação entre a deteção imune inata alterada de componentes bacterianos e a doença6. Os estudos mais recentes da associação do genoma-largo (GWAS) revelaram as vias adicionais envolvidas potencial na patogénese de IBD que incluem variações genéticas em: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R caminhos dependentes ligada à imunidade adaptativa , MUC1, MUC19, e PTGER4 na manutenção da barreira intestinal, e autofagia mediada por ATG16L7,8,9. Embora estes estudos de genética de base populacional tenham melhorado a nossa compreensão do IBD, os alelos de susceptibilidade sozinhos são provavelmente insuficientes para iniciar e sustentar a doença crónica3. Outros fatores não genéticos, incluindo alterações na composição do microbioma intestinal e redução da diversidade, têm sido associados à inflamação intestinal. No entanto, não está claro se a disbiose intestinal precede ou é a consequência de respostas imunes disreguladas3. Embora a etiologia do IBD permaneça obscura, nossa compreensão da patogénese da doença foi aumentada por modelos experimentais do rato da inflamação intestinal10,11. Esses modelos individualmente não representam plenamente a complexidade da doença humana, mas são valiosos para elucidar as vias fisiopatológicas que podem ser relevantes para o DII e para a validação de estratégias terapêuticas tentativas10, o 11. Tais modelos de mouse tipicamente dependem do início da inflamação por indução química ou infecção, transferência de células imunes, ou manipulação genética. Além disso, essas estratégias geralmente envolvem perturbações na integridade epitelial ou modulação da imunidade inata ou adaptativa.
Salmonella enterica Sorovares são patógenos intestinais que podem infectar humanos e camundongos. Após a ingestão, Salmonella pode colonizar o intestino por invasão direta de epithelia, células M, ou antígeno apresentando células12. Camundongos infectados por via oral com S. Typhimurium conduz à colonização primeiramente de locais sistemáticos tais como o spleen e os nós de linfa mesentérica com abundância relativamente baixa no intervalo do soldado12. No entanto, o pré-tratamento de camundongos com estreptomicina aumenta a eficiência da colonização de Salmonella do intestino diminuindo os efeitos protetores do hospedeiro da microbiota normal13. As características patológicas deste modelo incluem o rompimento ou o ulceração da barreira epithelial, do recrutamento do granulocyte, e do edema severo13. Alternativamente, a infecção com a vacina grau S. O mutante de typhimurium δaroa conduz à colonização crônica do ceco e dos dois pontos que persiste até o dia 40 após a infecção14. O S. A estirpe de typhimurium ΔAroA tem um defeito na biossíntese de aminoácidos aromáticos; Isto rende a estirpe do mutante avirulent e pode ser utilizado como uma vacina altamente eficaz15. A infecção oral nos ratos conduz a uma resposta inflamatório associada Th1-e Th17-cytokine, a remodelação extensiva do tecido, e ao depósito do colagénio. A patologia tecidual está associada a níveis elevados de fator pró-fibrótico, como TGF-β1, CTGF e IGF14. A cicatriz fibrótica transmural relatada neste modelo é reminiscente das formações de estenose observadas frequentemente em IBD. A indução de fibrose por Salmonella requer virulência codificada pelas ilhas de patogenicidade de Salmonella (SPI)-1 e 2 12. É importante, este S. O modelo de infecção por tymphimurium ΔAroA é um sistema útil para o estudo de respostas fibróticas em camundongos mutantes mantidos em um fundo C57/Bl6. A cepa C57/Bl6 é extremamente sensível a S. Infecção de typhiumurim SL1344 devido a uma mutação da perda--função no gene que codifica a proteína de macrófago resistência-associada natural (nramp)-116,17. Nós encontramos que as pilhas lymphoid inata Il-17a e rorα-dependentes são contribuintes importantes à patogénese neste modelo18.
Uma complicação importante do CD é o depósito disregulado e excessivo da matriz extracelular (ECM) que inclui o colagénio2,19. Embora o trato gastrointestinal tenha uma capacidade relativamente alta de regeneração, a cicatrização fibrótica pode surgir devido a respostas decicatrização deferidas não resolvidasque estão associadas à inflamação crônica e severa20,21. Em CD, isso resulta em efeitos deletérios na arquitetura tecidual, levando a comprometimento significativode órgãos21,22. A natureza transmural da inflamação observada em CD, em última análise, precede o espessamento da parede intestinal associada à estenose sintomática ou à formação de estenoses21. Cerca de um terço dos pacientes com CD necessitam de ressecção intestinal para esta complicação22. Não existem terapias antifibróticas efetivas no IBD, dado que o uso de imunossupressores como a azatioprina ou antitnfα biológica não tem impacto ou apenas reduziu modestamente a exigência de intervenções cirúrgicas19,20 . Quando a fibrose for pensada ser a conseqüência da inflamação crônica, as pilhas da origem mesenquimais tais como fibroblasto e pericitos são pensadas para ser as fontes celulares preliminares do ECM em cicatrizes fibrótica21,24. Crônica S. A infecção por ΔAroA de typhimurium é um modelo robusto do rato da fibrose intestinal que pode oferecer introspecções na patogénese de características CD-like.
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Protocol
Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade da Colúmbia Britânica.
1. preparação de culturas de Salmonella typhimurium ΔAroA para gavagem oral de camundongos
- De um estoque congelado de glicerol de S. Typhimurium ΔAroA, prepare uma placa de raia usando o agar LB contendo 100 μg/mL de estreptomicina com um laço de inocular estéril. Incubar durante a noite a 37 ° c. As placas de raia podem ser armazenadas até uma semana a 4 ° c.
- Um dia antes da infecção, prepare antibiótico dissolvendo 0,5 g de estreptomicina em 2,5 mL de água. Após o filtro que esterilização a solução da estreptomicina, gavagem oral os ratos usando uma agulha da gavagem 22g bulbo-derrubada e uma seringa de 1 ml com 100 μl da solução da estreptomicina (20 mgs estreptomicina/dose). Usando um laço de inocular, inocular 3 mL de caldo LB (50 μg/mL de estreptomicina) em um tubo de cultura com uma única colônia. Incubar a cultura das salmonelas aerobiamente em 37 ° c durante a noite com agitação em 200 rpm.
- No dia da infecção, prepare a dose final da infecção realizando 2 diluições 1/10 consecutivas de culturas de Salmonella overnight em PBS estéril. Isto resultaria num 100 μL de inum contendo aproximadamente 3 x 106 CFU.
- Usando uma agulha de gavagem 22G com ponta de bulbo e uma seringa de 1 mL, gavagem cada rato com 100 μL da salmonela preparada.
Nota: Prepare culturas de salmonelas usando técnicas assépticas. A concentração final da inoculação de Salmonella pode ser verificada por diluições seriadas em agar LB com estreptomicina. A estirpe de S. typhimurium ΔAroA pode ser obtida contactando o professor McNagny (kelly@brc.ubc.ca).
2. avaliação dos encargos das salmonelas nos tecidos
- Prepare 2 mL de bloqueio seguro, microtubos de fundo redondo com 1 mL de PBS estéril e um talão de aço inoxidável autoclavado. Pré-pesar os tubos antes da colheita do tecido.
- Resect cecal e tecidos esplênico de camundongos eutanasiados por exposição a dióxido de carbono. Colete o tecido de animais individuais em tubos separados. Pesar os tubos para determinar os pesos dos tecidos.
- Homogeneizar usando um aparelho misturador moinho para 15 min em 30 Hz. transferir 900 μL de PBS por poço em um megablock de 2 mL de 96-bem. Pipetar 100 μL de homogeneatos de tecido para o primeiro poço, misturar bem e realizar diluições seriadas adicionando 100 μL a poços subsequentes até obter uma diluição de 10-6 . Placa 10 μL de cada diluição em triplicados para o agar LB contendo 100 μg/mL de streptomcyin.
- Conte e multiplique CFU médio por um fator de 100 desde que 10 μL da amostra 1000 μL foram chapeados, e o fator apropriado da diluição. Divida o peso total do tecido CFU por pesos teciduais para determinar CFU por grama de tecido.
Nota: manter todas as amostras no gelo ou a 4 ° c durante o processamento do tecido. Use pontas da pipeta do largo-orifício ao executar diluições seriais com homogenates do tecido. Prepare a 96-bem megablock contendo PBS com antecedência.
3. picrosirius coloração vermelha e quantificação de colágeno.
- Fixar tecidos cecais durante a noite em formalina tamponada a 10% e preparar para a incorporação de parafina. Corte cortes de 5 μm para coloração de Picrosirius Red como descrito anteriormente25.
- Capture imagens compostas de seções transversais cecal inteiras em um microscópio do brightfield.
- Abra Fiji (ImageJ) e arraste e solte o arquivo de imagem. tif na barra de ferramentas.
- Na barra de menus, selecione imagem ≫ tipo ≫ pilha RGB para dividir a imagem em canais vermelhos, verdes e azuis. Deslize a barra horizontal na parte inferior do painel para definir o canal para verde.
- Abrir imagem ≫ ajustar > ferramenta limite . Ajuste os limites mínimos e máximos para eliminar quaisquer sinais de fundo. Depois que o limite desejado for definido, feche a ferramenta de limite e vá para analisar ≫ definir medições. Marque área, fração de área, limite paralimite e rótulo de exibição.
- Porta a seção de tecido com seleções de FreeHand ou ferramenta de seleções de polígono e medir a área% positiva para colágeno clicando em analisar > medida.
- Normalize a área absoluta positiva para o colagénio que mancha à área do tecido.
Nota: Fiji (ImageJ) é um programa de código aberto que pode ser baixado em https://fiji.sc. As imagens com as mesmas condições de captura (por exemplo, brilho e foco) devem ter limites de limiar idênticos para quantificação exata. Se houver qualquer coloração de fundo dentro do tecido selecionado, medir a área absoluta e subtrair-lo da área positiva para o colágeno de todo o tecido.
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Representative Results
Tratamento com estreptomicina seguido de infecção oral por S. O δaroa de typhimurium conduz à inflamação e à fibrose intestinais robustas especialmente no ceco (Figura 1). Os fardos patogénicos típicos de 108 a 109 UFC por 1 g de ceco e 104 CFU por 1 g de baço podem ser recuperados de animais infectados (Figura 2). A avaliação da fibrose em secções cecais coradas de picrosirius indica fibrose de pico 21 dias após a infecção, enquanto grande parte da patologia é resolvida por dia 42 PI (Figura 3 e Figura 4). A deposição de colágeno é mais pronunciada na submucosa do intestino, enquanto a fibrose na mucosa é mais suave.
Figura 1. Diagrama do seccionamento cecal para a histologia, a avaliação da carga das salmonelas , e a quantificação do citocinas.
O segmento 1 que representa a ponta cecal pode ser usado para a análise da expressão gênica, enquanto o segmento 2 será fixado em formalina tamponada a 10% para histologia e o segmento 3 será homogeneizado para enumeração bacteriana.
Figura 2. Cargas patogênicos em CECA e baços.
Salmonella CFU por peso de tecido durante o curso da infecção. Este valor foi modificado de lo et al.26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Seções transversais manchadas vermelhas de picrosirius do tecido intestinal.
Imagens de campo brilhantes de CECA de animais e animais não infectados 21 e 42 dias após S. Infecção por typhimurium ΔAroA. Barra de escala, 200 μm. Este valor foi modificado de lo et al.26.
Figura 4. Quantificação da deposição de colágeno por análises morfométricas.
(A) PSR + coloração normalizada para a área tecidual. Significância determinada pelo teste One-Way ANOVA Kruskal-Wallis com teste post de Dunns. * *, P < 0, 1, N.S., p > 0, 5. Este valor foi modificado de lo et al.26. (B) exemplo de quantificação de colágeno em tecido cecal utilizando Fiji. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nossa compreensão da patogénese de IBD foi aumentada extremamente por modelos do rato da inflamação intestinal. Embora tais modelos individuais não Recapitulem todas as características da doença humana complexa e multifatorial, têm sido úteis na identificação de características-chave da progressão da doença. As estenoses fibrotic associadas com o IBD remanesce uma necessidade clínica não atendidas principal porque os tratamentos atuais são ineficazes em inverter o desenvolvimento da doença. Além disso, a fibrose intestinal é difícil de estudar em um ambiente laboratorial devido a limitações nos modelos animais atuais. A exposição crônica a tnbs em camundongos Balb/c foi mostrada para induzir a deposição robusta de colágeno nos dois pontos que é impulsionado pela sinalização IL-13 e TGF-B127,28. Entretanto, a fibrose intestinal não é observada geralmente em outros modelos rotineiramente usados do laboratório da colite tais como o tratamento de DSS, o IL-10-deficiente, ou os modelos adoptivos da transferência da pilha de T. Grassl et al. demonstraram que a infecção gastrointestinal crônica de C57Bl6 com a cepa atenuada ΔAroA mutante Salmonella resulta em fibrose robusta nas regiões mucosa e submucosa do cálio12. Relataram que a fibrose máxima ocorreu três semanas após a infecção e foi associada com a imunidade Th1 e Th17 e os fatores pro-fibrotic elevados TGF-B1, CTGF, e IGF-112. Esta patologia é uma reminiscência de CD como a inflamação severa e fibrose é transmural. Embora o IBD seja tipicamente progressivo, uma limitação importante do modelo crônico de infecção por Salmonella é a natureza transitória da Imunopatologia fibrótica. Em camundongos C57Bl/6, a doença intestinal é tipicamente resolvida pela semana seis após a infecção. Apesar dessa lacuna, os últimos estágios deste modelo de infecção podem ser utilizados para identificar fatores ou processos envolvidos na promoção da remissão da doença26.
Embora os modelos patogénicos-dirigidos bacterianos da colite sejam bem estudados, não há nenhuma associação entre Salmonella e CD. No entanto, tem sido proposto que a magnitude da doença fibrótica durante os últimos estágios da colonização crônica por Salmonella não se correlaciona diretamente com os encargos patogênicos, sugerindo que a patologia é "autopropagando-se" uma vez que o intestino severo inflamação é iniciada por Salmonella29. Em contrapartida, a Escherichia coli aderente-invasiva (AIEC) patvar tem sido fortemente ligada ao desenvolvimento de CD por causa de sua alta prevalência na mucosa ileal de pacientes30. Além, a colonização persistente de AIEC (até 9 semanas) do íleo, o ceco e os dois pontos de diversas tensões do rato que incluem C57Bl/6 conduzem à acumulação robusta da matriz no intestino através da expressão do flagelina que demonstra assim o potencial de indução fibrogênicas deste pathobiont31,32. O desenvolvimento recente de modelos conduzidos infecção da fibrose intestinal forneceu modelos experimentais robustos de IBD. Estes forneceram sistemas novos para dissecar a relação entre a espécie bacteriana enteric que inclui seus fatores da virulência, e os fatores da susceptibilidade do anfitrião que podem realçar nossa compreensão da fibrose IBD-associada.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos financeiros de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Ingrid Barta pelos serviços de histologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 ml round bottom safe lock tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| Large-Orifice Pipet Tips | Fisher | 2707134 | |
| 2 mL megablock plates | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| Gavage needles | FST | 18061-22 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Mixer mill | Retsch | MM |
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