Summary
Des modèles in vitro d’angiogenèse coronaire peuvent être utilisés pour la découverte des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire. Les cultures d’explantation in vitro des tissus sinus venosus et endocardium montrent une croissance robuste en réponse au VEGF-A et affichent un modèle similaire d’expression DEMENT-TFII comme in vivo.
Abstract
Ici, nous décrivons un essai in vitro de culture pour étudier l’angiogenèse coronaire. Les vaisseaux coronaires nourrissent le muscle cardiaque et sont d’importance clinique. Les défauts dans ces vaisseaux représentent des risques graves pour la santé tels que dans l’athérosclérose, qui peut mener aux infarctus du myocarde et aux insuffisances cardiaques chez les patients. Par conséquent, la maladie coronarienne est l’une des principales causes de décès dans le monde. En dépit de son importance clinique, relativement peu de progrès ont été réalisés sur la façon de régénérer les artères coronaires endommagées. Néanmoins, des progrès récents ont été réalisés dans la compréhension de l’origine cellulaire et des voies de différenciation du développement des vaisseaux coronaires. L’avènement d’outils et de technologies qui permettent aux chercheurs d’étiqueter fluorescentement les cellules progénitrices, de suivre leur destin et de visualiser les descendants in vivo ont joué un rôle déterminant dans la compréhension du développement des vaisseaux coronaires. Les études in vivo sont précieuses, mais ont des limites en termes de vitesse, d’accessibilité et de flexibilité dans la conception expérimentale. Alternativement, des modèles in vitro précis de l’angiogenèse coronaire peuvent contourner ces limitations et permettre aux chercheurs d’interroger d’importantes questions biologiques avec rapidité et flexibilité. L’absence de systèmes modèles in vitro appropriés peut avoir entravé les progrès dans la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance des vaisseaux coronaires. Ici, nous décrivons un système de culture in vitro pour cultiver des vaisseaux coronaires du sinus venosus (SV) et de l’endocardium (Endo), les deux tissus progéniteurs à partir desquels de nombreux vaisseaux coronaires surgissent. Nous avons également confirmé que les cultures récapitulent avec précision certains des mécanismes in vivo connus. Par exemple, nous montrons que les germes angiogéniques dans la culture de SV déréglementent l’expression COUP-TFII semblable à ce qui est observé in vivo. En outre, nous montrons que VEGF-A, un facteur angiogénique bien connu in vivo, stimule vigoureusement l’angiogenèse des cultures SV et Endo. Collectivement, nous avons conçu un modèle précis de culture in vitro pour étudier l’angiogenèse coronaire.
Introduction
Les vaisseaux sanguins du cœur sont communément appelés vaisseaux coronaires. Ces vaisseaux sont composés d’artères, de veines et de capillaires. Pendant le développement, des capillaires fortement ramifiés sont établis d’abord, qui se transforment ensuite en artères coronaires et veines1,2,3,4,5. Ces capillaires initiaux sont construits à partir de cellules progénitrices endothéliales trouvées dans le proépicardium, sinus venosus (SV), et endocardium (Endo) tissus1,6,7,8. SV est l’organe d’afflux de cœur embryonnaire et Endo est la doublure intérieure du lumen de coeur. Les cellules progénitrices endothéliales trouvées dans le SV et l’Endo construisent la majorité de la vascularisation coronaire, tandis que le proépicardium contribue à une partie relativement faible decelui-ci 2. Le processus par lequel le réseau capillaire des vaisseaux coronaires se développe dans le cœur à partir de ses cellules précurseurs préexistantes est appelé angiogenèse coronaire. La maladie coronarienne est l’une des principales causes de décès dans le monde et pourtant un traitement efficace pour cette maladie fait défaut. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires détaillés de l’angiogenèse coronaire peut être utile dans la conception de thérapies nouvelles et efficaces pour réparer et régénérer les artères coronaires endommagées.
Récemment, une augmentation de notre compréhension de la façon dont les vaisseaux coronariens se développent a été en partie réalisée grâce au développement de nouveaux outils et technologies. En particulier, l’étiquetage in vivo de lignée et les technologies d’imagerie de pointe ont été très utiles pour découvrir l’origine cellulaire et les voies de différenciation des vaisseaux coronaires9,10,11,12. Malgré les avantages de ces outils in vivo, il y a des limites en termes de rapidité, de flexibilité et d’accessibilité. Par conséquent, des systèmes modèles in vitro robustes peuvent compléter les systèmes in vivo pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière à haut débit.
Ici, nous décrivons un modèle in vitro de l’angiogenèse coronaire. Nous avons développé un système de culture d’explation in vitro pour cultiver des vaisseaux coronaires à partir de deux tissus progéniteurs, SV et Endo. Avec ce modèle, nous montrons que les cultures d’explants de tissu in vitro cultivent des germes de vaisseau coronaires lorsqu’elles sont stimulées par le milieu de croissance. En outre, les cultures explantées se développent rapidement par rapport au contrôle lorsqu’elles sont stimulées par le facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGF-A), une protéine angiogénique très puissante. En outre, nous avons constaté que les germes angiogéniques de la culture SV subissent la dénodéliation veineuse (perte de l’expression COUP-TFII), un mécanisme similaire à l’angiogenèse SV in vivo1. Ces données suggèrent que le système de culture explantée in vitro rétablisse fidèlement les événements angiogéniques qui se produisent in vivo. Collectivement, les modèles in vitro de l’angiogenèse qui sont décrits ici sont idéaux pour sonder les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière élevée et accessible.
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Protocol
L’utilisation de tous les animaux dans ce protocole a suivi les lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels de l’Université d’État de Ball State (IACUC).
1. Établir des éleveurs de souris et détecter les prises vaginales pour les grossesses chronométrées
- Installez une cage de reproduction de souris avec des souris mâles et femelles de type sauvage. Assurez-vous que l’âge des souris reproductrices est compris entre 6 et 8 semaines. Installez une paire (1 mâle et 1 femelle) soit en trio (1 mâle et 2 femelles) pour l’élevage.
- Vérifiez s’il y a un bouchon vaginal le lendemain matin. Utilisez une sonde métallique inclinée pour détecter une prise en profondeur en l’insérant dans l’ouverture vaginale. Désignez le matin d’un bouchon vaginal positif pour être le jour embryonnaire 0,5 (e0,5).
REMARQUE : Une prise vaginale peut être superficielle (qui est facilement visible, voir la figure 1) ou profonde (ce qui n’est pas facilement visible). La présence d’une prise en profondeur bloquera l’insertion complète de la sonde tandis que l’absence d’un bouchon permettra une insertion complète sans résistance. - Maintenir la grossesse chronométrée jusqu’à ce que les embryons atteignent e11.5 au cours de laquelle ils seront récoltés. Pour confirmer la grossesse avant la récolte des embryons, enregistrez le poids des souris femelles entre e7,5 et e11.5.
REMARQUE : L’augmentation quotidienne du poids de la mère indiquera une grossesse réussie, alors qu’aucun changement de poids n’indiquera une grossesse ratée.
2. Récolte d’embryons de souris enceintes
REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : une chambre d’euthanasie CO2, 70 % d’éthanol, des serviettes en papier, des forceps réguliers, des forceps fins, des ciseaux, un salin stérile de phosphate (PBS), des plats De Petri stériles de 10 cm, un contenant avec de la glace, une cuillère perforée, un stéréomicroscope de dissection.
- Placez une souris enceinte e11.5 dans une chambre d’euthanasie propre DE CO2 pour la sacrifier. Fermez le couvercle de la chambre pour empêcher la souris de s’échapper.
- Une fois que la souris est fixée dans la chambre d’euthanasie, allumez le CO2. Assurez-vous de réguler le débit de CO2 par recommandations de l’IACUC (c.-à-d. 10-30% de déplacement par minute). Une fois que la souris est complètement euthanasié, effectuez une dislocation cervicale pour assurer la mort.
- Vaporiser la souris avec 70% d’éthanol. Soulevez la peau sur le ventre à l’aide de forceps, faites une petite incision à l’aide d’une paire de ciseaux et prolongez l’incision latéralement. Agrandir l’incision antérieurement jusqu’au diaphragme et exposer la corne utérine contenant les embryons(figure 2).
- Retirez la chaîne d’embryons (corne utérine et embryons) en saisissant l’utérus et en le coupant librement. Placer la chaîne d’embryons dans le 1x PBS stérile glacé.
- Disséquer les embryons individuels de la corne de l’utérus en épluchant le muscle utérin, le sac jaune et l’amnion un par un(figure 3A-F) sous un stéréomicroscope. Transférer les embryons nettoyés à l’aide d’une cuillère perforée dans un plat Petri contenant stérile 1x PBS sur la glace. Assurez-vous de garder les embryons froids.
3. Isoler les cœurs des embryons e11.5
REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : forceps réguliers, forceps fins, PBS stérile de 1x, plat de Petri stérile de 10 cm, plat de Petri stérile de 6 cm, récipient avec glace, cuillère perforée, stéréomicroscope de dissection.
- Installez un nouveau plat Petri avec 1x PBS stérile glacé sous un stéréomicroscope. Transférer un embryon de l’étape 2.5 dans le plat Petri pour disséquer le cœur.
- Retirez la tête de l’embryon à l’aide de forceps. Tout d’abord, presser la tête entre les forceps d’une main, puis retirer la tête en la grattant avec l’autre main à l’aide de forceps fermés(figure 4A-C).
- Après avoir enlevé la tête, orientez l’embryon avec son côté ventral vers le haut en tenant l’embryon avec des forceps à son ventre d’une main (figure 4D).
- D’autre part, ouvrez la paroi thoracique de l’embryon en faisant d’abord une petite incision dans la poitrine légèrement au-dessus du diaphragme à l’aide de forceps fins. Ensuite, agrandir l’incision très soigneusement en insérant des forceps fermés et en déchirant la paroi thoracique en ouvrant les forceps. Assurez-vous de ne pas pousser trop profondément, ce qui peut endommager le cœur. Avec l’aide des forceps, gardez la paroi thoracique grande ouverte pour exposer le cœur et les poumons dans la cavité thoracique(figure 4E).
- À l’aide de forceps fins, déplacez doucement le cœur antérieurement (90 degrés) et exposez l’aorte/veine dorsale. Sortez le cœur/poumons antérieurement en capturant l’aorte/veine dorsale à la base du cœur(figure 4F-H).
REMARQUE : Soyez doux tout en tirant le cœur/poumons pour éviter de déchirer le SV, qui est situé sur le côté dorsal du cœur. - Rincer le cœur/poumons avec le PBS 1x froid pour enlever les cellules sanguines.
- Répétez les étapes 3.1-3.6 pour enlever le cœur/poumons des embryons restants. Assurez-vous de garder le cœur/poumons isolés sur la glace.
4. Isoler les SVs et les Ventricules de e11.5 Embryonic Mouse Hearts
- Placer le plat Petri avec le cœur/poumons de l’étape 3.7 sous un stéréomicroscope pour isoler les SVs et les ventricules entiers. Épluchez les lobes attachés des poumons un par un de leur racine à l’aide de forceps fins.
- Orientez le cœur sur son côté dorsal et retirez l’oreilleria et le tissu adjacent qui entoure le SV antérieurement sans déchirer le SV. Retirez l’oreillerie gauche et droite du cœur en tenant à sa base et en le grattant à l’aide de forceps fins(figure 5B). Enlever le tissu adjacent entourant le SV à l’aide d’une technique similaire(figure 5C).
REMARQUE : Gardez à l’esprit que l’oreillette droite est attachée au SV, alors veillez à ne retirer que l’atrium. - Pour isoler le SV, d’abord orienter le cœur avec son côté dorsal face vers le haut (parce que le SV est sur le côté dorsal) et garder le cœur encore dans cette position en tenant doucement le cœur à ses ventricules avec des forceps.
REMARQUE : Le SV est un organe d’afflux d’un cœur embryonnaire qui se trouve entre les oreillettes du côté dorsal du cœur. - Retirez le SV en l’épluchant soigneusement du cœur où il est attaché ou en tenant le SV à la base de son attachement avec de fines forceps et en le grattant avec des forceps fermés(figure 5D,E).
- Transférer le SV isolé dans un nouveau plat Petri de 6 cm avec un 1x PBS stérile glacé sur la glace à l’aide d’une pipette de transfert stérile et étiqueter le plat Petri comme SV.
- Pour isoler les ventricules entiers, retirer le tractus sortant (aorte et tronc pulmonaire) du cœur après l’enlèvement du SV(figure 5F,G).
- Transférer les ventricules entiers dans un nouveau plat Petri de 6 cm contenant stérile 1x PBS sur la glace à l’aide d’une pipette de transfert stérile et étiqueter le plat Petri comme ventricules. Gardez le SV et les ventricules isolés sur la glace.
- Répétez les étapes 4.1-4.7 pour isoler les SVs et les ventricules des cœurs restants.
5. Mise en place de plaques de culture tissulaire avec inserts et revêtement de matrice extracellulaire
REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : solution commerciale de matrice extracellulaire (ECM ; par exemple, Matrigel), 8,0 M de polyéthylène teréphtalate (PET) inserts de culture, 24 plaques de puits, 37 oC, 5% de CO2 incubateur.
- Laissez la solution ECM décongeler sur la glace. Maintenez la solution ECM sur la glace pour éviter la solidification.
- Placez les inserts de culture de membrane PET (taille de pore ' 8.0 'm, zone de filtration '0.3 cm2, diamètre de filtre '6.5 mm) dans les puits de la culture non tissulaire traitée 24 plaques de puits. Étiquetez les plaques sous forme de SV ou de ventricules pour le SV ou les essais d’angiogenèse endocardiale, respectivement.
REMARQUE : Configurez les inserts dans des plaques séparées pour le SV et les ventricules lors de l’exécution simultanée des deux cultures. Assurez-vous de mettre en place suffisamment de puits pour tous les échantillons expérimentaux et les contrôles. - Une fois que la solution ECM est décongelée, diluer immédiatement ECM 1:2 dans le milieu basal précolé (c.-à-d., milieu basal EBM-2, voir Tableau des matériaux) à un volume suffisant (100 l/insert x nombre d’inserts).
REMARQUE : Par exemple, s’il y a six inserts, le volume total sera de 100 l x 6 x 6 x 600 lL. Ajouter 200 l d’ECM en 400 ll de milieu basal. - Enrober les inserts de 100 l d’ECM fraîchement dilué en l’ajoutant directement sur la membrane. Incuber la plaque à 37 oC pendant au moins 30 minutes pour permettre à l’ECM de se solidifier.
REMARQUE : Ceci doit être effectué sous un capot de culture de tissu de flux laminaire pour éviter la contamination.
6. Les SVs et les cultures de ventricules entiers
REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : 70% d’éthanol, pipette de transfert, stéréomicroscope, forceps, capuchon de culture tissulaire à débit laminaire, kit microvasculaire de supplément de cellules endothéliales(tableau des matériaux), milieu basal, PBS stérile 1x). La figure 6 montre le flux de travail de la culture SV et ventricule.
- Décongeler le contenu de la trousse de supplément sur la glace. Préparer le milieu complet en ajoutant tout le contenu du kit de supplément en 500 ml de milieu basal sous une hotte certifiée de culture de tissu à débit laminaire. Mélanger le milieu bien et distribuer dans 50 mL aliquots.
- Stériliser la base du stéréomicroscope et la zone de travail environnante avec 70% d’éthanol.
- Obtenir les plaques de culture tissulaire de l’étape 5.4. À l’aide d’une pipette de transfert, transférer soigneusement les explants de l’étape 4.7 sur la membrane d’insertion. Sous un stéréomicroscope et à l’aide de forceps propres, placez les explants au centre des inserts pour s’assurer qu’ils ne sont pas coincés dans le coin des inserts ou attachés aux parois latérales.
- Une fois que les explants sont placés et centrés sur les inserts, retirez soigneusement tout PBS supplémentaire des inserts et fermez les couvercles des plaques.
- Sous un capot de culture tissulaire à débit laminaire, ajouter 100 l du milieu complet préenchaillé sur le dessus des inserts et 200 l dans les puits pour la culture les explants à l’interface air-liquide de telle sorte que la surface basale de l’insert est en contact avec le milieu , mais la surface supérieure est exposée à l’air.
REMARQUE : Assurez-vous d’ajuster le volume pour obtenir une interface air-liquide si vous utilisez des inserts/plaques de puits de taille différente. - Ajouter 300 L de PBS dans les puits inutilisés des 24 plaques de puits et couvrir avec le couvercle. Incuber la plaque dans un incubateur de 37 oC, 5% de CO2, et développer les cultures pendant 5 jours.
- Dans les jours suivants, observez régulièrement les cultures sous un microscope léger inversé pour évaluer l’état des cultures explantées. Assurez-vous que les explants présentent des battements contractuels et que toutes les explantations sont fixées au fond de la membrane intégrée à l’ECM. Prenez note de toutes les explants flottants.
REMARQUE : La contraction périodique des explants indique qu’ils sont vivants. Les explants flottants doivent être omis de l’analyse. - Après avoir évalué le statut de la culture, remettre l’assiette de culture dans l’incubateur et continuer à développer la culture jusqu’à 5 jours.
7. Traitement des cultures avec VEGF-A (contrôle positif)
REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : capuchon de culture de tissu à débit laminaire, 1x PBS, milieu basal - 1% sérum bovin fœtal (FBS), milieu basal - VEGF-A, pipettes, et pipette pointes.
- Préparer le milieu basal de 1% FBS et le milieu basal ' VEGF-A.
- Pour préparer le milieu basal de 1 % de FBS, déterminez d’abord le nombre de puits de commande nécessaires. Par exemple, s’il y a trois puits de commande, alors 300 L/puits x 3 à 900 l’un est le volume total nécessaire. Ajoutez 9 L de FBS en 891 L de milieu basal pour faire le milieu basal de 1% FBS.
- Pour préparer le milieu basal et le VEGF-A, déterminez d’abord le nombre total de puits nécessitant un milieu VEGF-A. S’il y a trois puits, alors 300 L/puits x 3 x 900 l est le volume total et 50 ng/puits x 3 ' 150 ng VEGF-A. Ajoutez 150 ng de VEGF-A dans 900 L de milieu basal pour faire le milieu basal - VEGF-A.
REMARQUE : Assemblez cette solution à un volume plus important que prévu pour assurer un nombre suffisant d’aliquots plus petits pour chaque expérience.
- Le jour 2, retirez les médias des deux chambres (les inserts et les puits). Laver les cultures avec 300 L de 1x PBS en ajoutant 100 l aux inserts et 200 l dans les puits. Remuez fermement les plaques à quelques reprises et retirez le PBS.
- Ajouter 300 L de milieu basal à 1 % de FBS (100 ll dans l’insert et 200 l dans les puits) pour affamer les cultures pendant 24 h.
- Le jour 3, après la famine, ajouter 300 L de milieu basal - 1% FBS (100 'L dans l’insert et 200 'L dans les puits) dans les puits de contrôle et le milieu basal - VEGF-A (50 ng/puits) dans les puits de traitement, respectivement.
- Après le traitement, continuer à cultiver les cultures dans l’incubateur.
8. Fixation et immunostachation
REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : 4 % de paraformaldéhyde (PFA), 1x PBS, anticorps primaires et secondaires, shaker, 0,5 % de surfactant non ionique dans PBS (PBT).
- Le sixième jour de la culture, enlever le milieu et laver les cultures avec 1x PBS à température ambiante (RT).
- Réparez les cultures en ajoutant 200 L de la solution PFA de 4 % dans les puits et de 100 l dans les inserts. Fixez les cultures en 4 oC pendant 20 minutes pendant le basculement.
- Après fixation de 20 min, retirez PFA des cultures dans un capot de fumée et lavez les cultures avec 1x PBS en ajoutant 200 L dans les puits et 100 l dans les inserts.
- Répéter les lavages 3x, 10 min chacun, tout en bascule. Ensuite, procéder à l’immunostaining.
REMARQUE : Toutes les étapes de lavage sont effectuées sur un banc à RT.
- Diluer les anticorps primaires (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) dans la solution de blocage (sérum d’âne de 5%, 0,5% PBT). Ajouter 300 L de solution d’anticorps primaires (200 l dans les puits inférieurs et 100 l dans les inserts). Incuber les cultures dans les anticorps primaires pendant la nuit à 4 oC tout en bascule.
REMARQUE : L’anti-VE-Cadherin est utilisé pour étiqueter la membrane de cellules endothéliales et anti-ERG 1/2/3 est utilisé pour étiqueter le noyau de cellules endothéliales afin de visualiser les germes angiogéniques des cellules endotéliales. - Le lendemain, laver et bercer les plaques de culture 10x en 0,5% PBT, en changeant PBT toutes les 10 minutes.
- Diluer les anticorps secondaires (âne anti-rat Alexa Fluor 488 et âne anti-lapin Alexa Fluor 555) en bloquant la solution. Ajoutez 300 l d’anticorps secondaires comme à l’étape 8.2 et incuber les cultures pendant la nuit à 4 oC tout en se balançant. Le lendemain, laver les anticorps secondaires 10x en PBT, en changeant PBT toutes les 10 minutes.
REMARQUE : Laver un minimum de 10x, mais plus de lavages sont meilleurs. Une fois les lavages terminés, les cultures peuvent être stockées avec 1x PBS jusqu’à ce qu’elles soient montées sur des toboggans.
9. Montage des cultures sur les diapositives, l’imagerie et l’analyse
REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : forceps fins, diapositives, milieu de montage avec 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), coverlips, et microscope confocal. Après la coloration secondaire des anticorps, monter les cultures sur des diapositives pour l’imagerie en utilisant les étapes suivantes.
- Décollez soigneusement la membrane de l’insert à l’aide de forceps fins et transférez-le sur les diapositives en posant le côté de la membrane vers le bas et en plaçant les cultures explantées vers le haut. Placez les échantillons de réplique dans les mêmes diapositives et étiquetez les diapositives comme commandeur ou VEGF-A. Ajouter quelques gouttes de support de montage avec DAPI directement sur la membrane et couvrir les diapositives avec des feuillets de couverture.
REMARQUE : Assurez-vous d’éviter les bulles d’air tout en plaçant les coverlips. - Sceller les bords des toboggans avec du vernis à ongles clair et laisser sécher.
REMARQUE : Les diapositives peuvent être stockées dans -20 oC pour le stockage à long terme. - Diapositives d’image utilisant un microscope confocal.
- Effectuez l’analyse pour mesurer la longueur de la excroissance angiogénique. Quantifier la longueur de la excroissance angiogénique en mesurant la distance des cellules endothéliales (Ve-CadherinMD/ERG 1/2/3) étendues à partir de la limite intérieure des cellules ERG 1/2/3 dans les cultures ventricules et à partir du centre des explantations SV dans les cultures SV.
- Pour effectuer la quantification à l’aide de FIJI/ImageJ, téléchargez d’abord le logiciel FIJI.
- Fichiers d’images ouvertes dans FIJI: aller au fichier (fr) Ouvert Dossier Nom de fichier (fr) Ouvrez.
- Aller à l’analyse (fr) Mesures d’ensemble Sélectionnez Perimeter.
- Sélectionnez l’outil Straight Line à partir de la fenêtre principale.
- Tracez une ligne sur toute la longueur d’un germe tel que suggéré dans l’étape 9.4.
- Aller à l’analyse (fr) Mesure.
REMARQUE : Des mesures de longueur sont affichées dans la nouvelle fenêtre. - Effectuez la quantification dans des images qui représentent au moins trois champs de vision choisis au hasard. Moyenne des mesures de longueur des germes et les signaler comme moyen d’écart standard.
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Representative Results
Une des caractéristiques les plus frappantes de l’angiogenèse SV in vivo est qu’il suit une voie spécifique et implique la dénduisation cellulaire et les événements de redifferentiation qui se produisent à des moments stéréotypés et les positions1. Au fur et à mesure que les cellules SV initiales se développent sur le ventricule cardiaque, elles cessent de produire des marqueurs veineux tels que LE COUP-TFII(figure 7). Par la suite, les germes coronariens prennent deux chemins de migration, soit sur la surface du cœur ou profondément dans le myocarde. Les vaisseaux de surface finissent par devenir des veines tandis que les navires envahisseurs deviennent des artères et des capillaires1,6,7. Cette distinction est préservée à mesure que le cœur grandit et que la vascularisation coronaire s’étend.
Pour faciliter la découverte des fondements moléculaires du développement coronaire, nous avons conçu un modèle in vitro de germination de SV qui peut être utilisé pour des expériences de perte de fonction et de gain-of-function. Les tissus de SV des coeurs embryonnaires de souris sont disséqués, placés sur le dessus de l’ECM dilué (qui est disponible dans le commerce, voir tableau des matériaux), et maintenu à l’interface air-liquide dans le milieu de croissance de cellules endothéliales. Le myocarde SV continue de battre tout au long de la période de culture. Après 2 jours en culture, les cellules épicardiques qui tapent le tissu quittent l’explant et migrent sur la matrice. Après 5 jours, les cellules endothéliales SV germent et migrent sur le tissu épicardique(figure 8A, pointes noires). Collectivement, ce processus récapitule les aspects angiogéniques du développement coronarien.
Les germes de SV cultivés subissent également la dénodélérente veineuse. Comme dans le cœur embryonnaire, l’expression COUP-TFII est réduite à mesure que les vaisseaux migrent loin du SV(figure 8B, par rapport à la figure 7). Les vaisseaux témoins tels que les artères et les veines ombilicales ou jaunes peuvent produire des vaisseaux de germination. Cependant, ils sont moins nombreux et de longueur plus courte et ne changent pas leur identité artérielle ou veineuse (non montrée). Ainsi, la reprogrammation veineuse est spécifique à la germination de SV et non à une caractéristique générale de l’angiogenèse ou à une réponse aux composants d’ECM. Ces données indiquent également que les types de cellules contenus dans le SV lui-même sont nécessaires et suffisants pour induire la différent.
Il est bien connu que le facteur de croissance endothéliale vasculaire A (VEGF-A) est un puissant inducteur de l’angiogenèse7,13,14,15,16,17,18. Des études antérieures ont montré que le myocardique VEGF-A stimule l’angiogenèse endocardiale pour développer des vaisseaux coronaires7. En outre, les cellules coronaires endothéliales ont été montrées pour exprimer le récepteur VEGF-A, et les vaisseaux coronaires dérivés de SV dans le myocarde pourraient se développer en réponse à VEGF-A in vivo2. Pour montrer que notre modèle in vitro d’angiogenèse coronaire répond fidèlement au VEGF-A, nous avons stimulé les cultures SV et Endo avec VEGF-A. Comme prévu, nos résultats ont montré que SV et Endo sont très sensibles à VEGF-A. Les cultures stimulées par le VEGF-A montrent une croissance accrue des germes angiogéniques à la fois en densité et en longueur(figure 9A,C). Les cultures SV stimulées par VEGF-A montrent une augmentation de près de trois fois la longueur des germes par rapport au contrôle(figure 9B). Ces résultats suggèrent que les germes endothéliaux de SV et Endo répondent à des indices semblables qui sont connus in vivo.
Prises ensemble, nos données suggèrent que ces cultures d’explants in vitro partagent des événements cellulaires et moléculaires similaires qui se produisent pendant le développement coronaire in vivo, y compris la dénodélérentation veineuse et la croissance robuste en réponse à la stimulation DE VEGF-A. Par conséquent, nos données suggèrent que ces modèles de culture explant sont utiles pour étudier l’angiogenèse coronaire in vitro.
Figure 1 : Identification vaginale de la prise. (A) Une prise vaginale (tache blanche). (B) Vue agrandie de la région en boîte, y compris la prise vaginale (indiquée par flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Accès à la chaîne d’embryons dans l’utérus d’une souris enceinte. Une souris enceinte euthanasié est positionnée avec sa surface ventrale vers le haut et pulvérisée avec 70% d’éthanol à la peau humide pour la dissection. La peau est tirée vers le haut à la région pelvienne utilisant des forceps et une petite incision est faite. L’incision est prolongée latéralement. Une incision supplémentaire est faite antérieurement jusqu’au diaphragme. Dans l’utérus, une chaîne d’embryons est visible (indiquée par des pointes de flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Dissection et enlèvement des embryons de l’utérus. (A) Image montrant l’utérus contenant une chaîne d’embryons. La membrane du côté dorsale de l’embryon (en face du côté où se trouve le placenta) est décollée. (B) L’embryon dans le sac jaune devient visible après avoir décollé la membrane de l’utérus. (C,D) L’embryon attaché au placenta avec le cordon ombilical est visible après avoir enlevé le sac de jaune. Amnion est décollé si elle est encore présente. (E) Image montrant un embryon attaché au placenta par le cordon ombilical. (F) Image montrant le détachement de l’embryon du placenta en tirant sur le cordon ombilical (Umb. Cordon) à l’aide de forceps. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : L’ablation du cœur/poumons arrache des embryons. (A,B) La tête est retirée de l’embryon en capturant le cou et en la grattant. (C) Image montrant l’enlèvement de la tête du corps. (D) Le positionnement correct de l’embryon pour la dissection cardiaque. L’embryon est placé avec le côté ventral jusqu’à avoir un accès facile à la cavité thoracique pour l’enlèvement du cœur. Une fois que l’embryon est positionné comme indiqué dans D, la cavité thoracique est ouverte avec des forceps. (E) Image montrant la cavité thoracique ouverte avec le cœur exposé sur son côté ventral. (F) Pour enlever le cœur sans endommager le SV, le cœur est retourné antérieurement, et l’aorte dorsale devient visible. (G) Image montrant la position à la base du cœur /poumons où l’aorte dorsale / veine est capturée avec des forceps et le cœur / poumons arracher est tiré antérieurement. (H) L’image montre le cœur/poumons e11.5 cueillir retiré de l’embryon. V. coeur et coeur ventral; d. coeur et coeur dorsal ; d. aorta et aorte dorsale; LA - atrium gauche; RA et atrium droit; LV - ventricule gauche; RV et ventricule droit. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Isoler le SV et les ventricules des cœurs embryonnaires. (A) Image montrant la vue dorsale du cœur/poumons isolés cueillir de l’embryon e11.5. L’emplacement du SV dans le cœur est indiqué. (B) Image du cœur après que les bourgeons pulmonaires ont été enlevés. (C) Atria et tissus adjacents entourant le SV sont enlevés, révélant l’aorte. L’emplacement du SV est étiqueté. (D) Image montrant la suppression du SV. À l’aide de forceps, le SV est saisi à sa base et est gratté du cœur. (E) SV enlevé du cœur est montré avec le tissu restant du cœur. L’aorte et le tronc pulmonaire (PT), collectivement appelé le tractus sortant (OFT), deviennent visibles dans le cœur après SV est enlevé. Le SV sera utilisé pour la culture in vitro, tel que décrit dans la figure 6 (panneau gauche). (F) La position de l’OFT à disséquer est marquée par une ligne blanche pointillée. (G) Aorta/PT (écoulement) est retiré des ventricules par dissection à la position indiquée dans le panneau F. Les ventricules restants sans l’OFT sont utilisés pour les cultures ventricules comme le montre la figure 6 (panneau droit). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Schéma montrant le flux de travail de la culture SV et ventricule. Gauche: Procédure pour la culture SV. Tout d’abord, le SV est retiré des cœurs e11.5 et placé sur un insert de culture. L’insert contient une membrane poreuse au fond (pore de 8 m) et est recouvert d’ECM réduit par le facteur de croissance. Les inserts sont placés dans les puits d’une plaque de 24 puits. Le milieu est ajouté à la fois dans la chambre inférieure et supérieure sans couvrir l’explant. La culture est cultivée pendant 5 jours. Après 5 jours, la membrane est retirée de l’insert et est montée sur les diapositives pour l’imagerie et l’analyse. Droite: Procédure pour la culture ventricule. Ventricules sans le SV, atria, et OFT sont retirés des coeurs e11.5 et sont cultivés comme décrit ci-dessus pour le SV. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : L’expression DES-TFII est perdue dans les germes de SV in vivo. (A) Dorsal vue des cœurs e11.5. Image confocale du marqueur endothélial (rouge) qui étiquette le sinus venosus (SV), les germes coronariens (cs, ligne pointillée), et l’endocardium (endo) tapissant le lumen de coeur. (B) Le fabricant veineux COUP-TFII (vert), un facteur de transcription veineux (trx), exprimé dans le SV est progressivement perdu que les germes quittent le SV et poussent sur le ventricule. Droite: Grossissement plus élevé de la pousse coronaire montrée dans la région en boîte du panneau A. Barre d’échelle 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Modèles in vitro d’identité veineuse et de reprogrammation. (A) Image Brightfield du tissu SV cultivé. Les germes vasculaires (pointes de flèche) poussent à partir de l’explant original (ligne pointillée noire) sur le substrat ECM. (B) Immunofluorescence des cultures SV étiquetées avec des anticorps qui marquent la surface de cellules endothéliales (VE-Cadherin), les noyaux de cellules endothéliales (ERG 1/2/3), et les noyaux veineux et épicardiques (COUP-TFII). Les noyaux sont positifs pour ERG 1/2/3 et COUP-TFII au SV, mais ERG 1/2/3 seulement dans les germes migrer sur l’ECM. Barre d’échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9 : SV et endocardium répondent au VEGF-A in vitro. (A) Image confocale du contrôle de 5 jours et de la culture d’explantité SV traitée par VEGF-A. Les cellules endothéliales sont immunostained avec VE-cadherin (vert), noyaux de cellules endothéliales tachés avec ERG 1/2/3 (rouge) anticorps, et noyaux cellulaires avec DAPI (bleu). (B) La excroissance angiogénique des cellules endothéliales est quantifiée en mesurant la longueur de l’extension de germe (la distance migrée par les cellules endothéliales ERG 1/2/3 de l’explant, indiquée par les lignes solides blanches dans les panneaux de fond de (A). (C) Image confocale d’une culture vieille de 5 jours d’un contrôle et des ventricules traités par le VEGF-A. Les cellules endothéliales sont immunostained avec VE-cadherin (vert) et les noyaux de cellules endothéliales sont tachés avec des anticorps ERG 1/2/3 (bleu). Les points sont des mesures individuelles et les barres d’erreur sont moyennes - SD. Barre d’échelle de 200 m(A,C). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Quelques-unes des étapes les plus critiques pour la croissance réussie des vaisseaux coronaires des tissus progéniteurs SV et Endo sont : 1) Identifier correctement et isoler le tissu SV pour la culture SV ; 2) en utilisant des ventricules d’embryons âgés de 11 à 11,5 ans pour une culture précise d’Endo; 3) maintenir des conditions stériles tout au long de la période de dissection et garder les tissus froids en tout temps; et 4) garder les explants attachés à la membrane enduite ECM pour éviter que les tissus flottent dans le milieu.
Tout d’abord, l’isolement des tissus SV peut être difficile. Il est important de se rendre compte que le SV se trouve sur le côté dorsal du cœur entre les oreillettes gauche et droite cachées dans les lobules pulmonaires. Par conséquent, il est difficile de se séparer et d’isoler. Au lieu de cela, le cœur entier / poumons cueillir doit être extrait en premier. Le SV est ensuite isolé de la pincée en enlevant soigneusement les lobules pulmonaires et en nettoyant les tissus adjacents à l’aide de forceps fins. En outre, il faut être très prudent tout en nettoyant les tissus adjacents pour ne pas perdre le SV.
Deuxièmement, pour une angiogenèse endocardiale précise, il est important de culture ventricules à partir d’embryons pas plus âgés que e11.5. Chez les embryons e12.5 et plus, les coronaires du SV se développent en une proportion significative des ventricules. Par conséquent, les vaisseaux coronaires qui poussent à partir de ventricules plus anciens peuvent être composés à la fois des vaisseaux coronaires dérivés de SV et d’Endo1,2,10,19,20. Pour cette raison, pour évaluer avec précision la croissance du vaisseau coronaire de l’Endo, il est essentiel pour les ventricules de culture (moins SV et le tractus) de e11,5 embryons20. En outre, le SV est relativement plus grand et est plus facile à isoler à e11.5.
Troisièmement, parce que le protocole implique une quantité importante de travail en dehors du capot de culture tissulaire, il est essentiel de maintenir un environnement de travail stérile. Il est important de stériliser les outils de dissection (forceps, ciseaux, etc.) et les plaques de culture tissulaire et d’éviter tout contact avec des zones non stériles en tout temps. Il est important de pulvériser la zone de travail et la portée de dissection avec 70% d’éthanol. Pour éviter la contamination, il est important d’effectuer la procédure de dissection rapidement et de minimiser le travail en dehors du capot de la culture tissulaire.
Quatrièmement, pour obtenir des cultures explantées saines, il est important que les explants restent attachés à la base de la membrane en tout temps. Les explants flottants dans le milieu doivent être évités pour cultiver avec succès les cultures explantantes. Pour éviter de flotter, il est essentiel de maintenir une interface air-liquide où la surface basale de l’insert est en contact avec le milieu, mais la surface supérieure est exposée à l’air. Une telle interface est obtenue lorsque l’explant est suffisamment recouvert par le milieu, mais n’est pas entièrement submergé. Il est important de surveiller le volume du milieu tous les jours, car le volume peut être perdu à l’évaporation. Pour éviter cela, la plaque de culture peut être humidifiée en ajoutant PBS dans les puits inutilisés des plaques de culture.
Des cultures explantées similaires de SV et d’Endo sont décrites ailleurs20. Dans ces méthodes, les explants ont été cultivés directement dans les puits des plaques de culture tissulaire, ce qui limite l’imagerie confocale haute résolution. Les images capturées dans ce cadre sont relativement peu de qualité par rapport à la méthode proposée ici, limitant les analyses microscopiques détaillées. Pour contourner cela, nous avons utilisé des inserts de culture à partir desquels les membranes contenant la culture peuvent être décollées et montées sur les toboggans en verre pour l’imagerie. Cela permet l’imagerie confocale haute résolution où les détails cellulaires tels que les modèles d’expression et la morphologie peuvent être consultés. En outre, la culture directement sur les plaques nécessite un protocole de coloration séparé pour DAPI ou d’autres taches de marqueur pannucléaire. Ce protocole ne nécessite pas d’étapes de coloration séparées parce que les diapositives peuvent être montées avec le milieu de montage contenant DAPI. En outre, le montage sur les diapositives permet un stockage à long terme sans décoloration fluorescente, tandis que les cultures stockées dans des puits à moyen liquide se traduiront par une décoloration rapide et ne sont pas agréables au stockage et à l’imagerie à long terme.
Les modèles de culture in vitro décrits ici sont idéaux pour interroger les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière élevée et accessible. Ce système in vitro peut être utilisé pour dépister les médicaments potentiels ou les cibles moléculaires pour évaluer leur effet sur l’angiogenèse coronaire. En outre, ce système peut également être utilisé pour étudier le gain de fonction et la perte de fonction de divers gènes pour leur fonction autonome dans l’angiogenèse coronaire. Nous avons observé que les germes coronaires de SV ont suivi la migration épicardiale dans nos cultures in vitro, suggérant une interaction importante entre les cellules coronaires endothéliales et les cellules épicardiques. Il est bien connu que l’épicarde est une riche source de facteurs de croissance pour l’angiogenèse coronaire de la SV. Par exemple, il a déjà été démontré que des facteurs de croissance dérivés de l’épicardi tels que VEGF-C et ELABELA régulent l’angiogenèse coronarienne dérivée du SV2,19. Nous pouvons utiliser ce système de culture SV pour étudier plus avant l’interaction entre l’épicarde et les cellules coronariennes endothéliales et identifier de nouvelles voies moléculaires épicardiales dérivées de l’angiogenèse coronaire. En outre, nos données in vivo suggèrent que l’hypoxie myocardique peut être impliquée dans l’angiogenèse endocardiale19. Notre système de culture in vitro offre un excellent modèle pour étudier le rôle de l’hypoxie dans l’angiogenèse endocardiale en incuber les cultures dans des conditions hypoxiques ou normoxiques. Ce sont des expériences difficiles à mener in vivo parce qu’il faut une souris enceinte pour être placé dans une chambre hypoxique contrôlée. De notre propre expérience, il est très difficile d’obtenir des résultats cohérents et fiables à partir d’expériences in vivo. En résumé, notre modèle in vitro d’angiogenèse coronaire fournit un système fiable pour interroger un large éventail de questions relatives à la biologie cellulaire et moléculaire de l’angiogenèse coronaire.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les membres du laboratoire Sharma d’avoir fourni un environnement de recherche favorable. Nous tenons à remercier tout particulièrement Diane (Dee) R. Hoffman qui entretient et prend soin de notre colonie de souris. Nous tenons également à remercier les Drs Philip J. Smaldino et Carolyn Vann d’avoir soigneusement relu le manuscrit et d’avoir fourni des commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par des fonds du Ball State University Provost Office et du Department of Biology à B.S, des fonds de la subvention de recherche senior de l’Académie des sciences de l’Indiana à B.S. et des NIH (RO1-HL128503) et des fonds de la New York Stem Cell Foundation à K.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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