Summary
कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के इन विट्रो मॉडल का उपयोग कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सेलुलर और आणविक तंत्र की खोज के लिए किया जा सकता है। इन इन इनिनस वेनसस सऔर एंडोकार्डियम ऊतकों की संस्कृतियों को वीवेएफ-ए के जवाब में मजबूत वृद्धि दिखाती है और वीवो में तख्तापलट-टीएफआईआई अभिव्यक्ति का एक समान पैटर्न प्रदर्शित करती है।
Abstract
यहां, हम कोरोनरी एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो संस्कृति परख का वर्णन करते हैं। कोरोनरी जहाजदिल की मांसपेशी खिलाते हैं और नैदानिक महत्व के होते हैं। इन जहाजों में दोष गंभीर स्वास्थ्य जोखिमों का प्रतिनिधित्व करते हैं जैसे कि एथेरोस्क्लेरोसिस में, जो रोगियों में मायोकार्डियल इंफेक्शन और दिल की विफलताओं का कारण बन सकता है। नतीजतन, कोरोनरी धमनी रोग दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक है । इसके नैदानिक महत्व के बावजूद, क्षतिग्रस्त कोरोनरी धमनियों को पुनर्जीवित करने के तरीके पर अपेक्षाकृत कम प्रगति की गई है। फिर भी, कोरोनरी पोत विकास के सेलुलर मूल और भेदभाव रास्तों को समझने में हाल ही में प्रगति हुई है । उपकरणों और प्रौद्योगिकियों का आगमन जो शोधकर्ताओं को जनक कोशिकाओं को फ्लोरोसेंटी लेबल करने, उनके भाग्य का पालन करने और वीवो में संतानकी कल्पना करने की अनुमति देते हैं, कोरोनरी पोत विकास को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। वीवो अध्ययन में मूल्यवान हैं, लेकिन प्रयोगात्मक डिजाइन में गति, पहुंच और लचीलेपन के मामले में सीमाएं हैं। वैकल्पिक रूप से, कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सटीक इन विट्रो मॉडल इन सीमाओं को दरकिनार कर सकते हैं और शोधकर्ताओं को गति और लचीलेपन के साथ महत्वपूर्ण जैविक प्रश्नों से पूछताछ करने की अनुमति देसकते हैं। उपयुक्त इन विट्रो मॉडल प्रणालियों की कमी कोरोनरी पोत विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने में प्रगति में रुकावट हो सकती है । यहां, हम एक इन विट्रो संस्कृति प्रणाली का वर्णन करने के लिए सिनोस वेनसस (एसवी) और एंडोकार्डियम (Endo), दो जनक ऊतकों से कोरोनरी जहाजों के कई पैदा से कोरोनरी जहाजों विकसित हो जाना । हमने यह भी पुष्टि की है कि संस्कृतियों सही वीवो तंत्र में ज्ञात में से कुछ संक्षिप्त । उदाहरण के लिए, हम बताते हैं कि एसवी से संस्कृति में एंजियोजेनिक अंकुरित तख्तापलट-TFII अभिव्यक्ति को कम करते हैं जो वीवो में मनाया जाता है। इसके अलावा, हम बताते हैं कि वीवो में एक प्रसिद्ध एंजियोजेनिक कारक VEGF-A, एसवी और एंडो संस्कृतियों दोनों से एंजियोजेनेसिस को मजबूती से उत्तेजित करता है। सामूहिक रूप से, हमने कोरोनरी एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक सटीक इन विट्रो संस्कृति मॉडल तैयार किया है।
Introduction
दिल की रक्त वाहिकाओं को आमतौर पर कोरोनरी वाहिकाएं कहा जाता है। इन जहाजों में धमनियां, नसें और केशिकाएं शामिल हैं। विकास के दौरान, अत्यधिक शाखाओं वाले केशिकाओं को पहले स्थापित किया जाता है, जो तब कोरोनरी धमनियों और नसों1,2,3,4,5में फिर से तैयार होते हैं। ये प्रारंभिक केशिकाएं प्रोपिकार्डियम, सिनोस वेनसस (एसवी) और एंडोकार्डियम (एंडो)ऊतक1,6,7,8में पाए जाने वाले एंडोथेलियल प्रोजेनिटर कोशिकाओं से बनाई गई हैं। एसवी भ्रूणीय हृदय का प्रवाह अंग है और एंडो दिल के लुमेन की आंतरिक परत है। एसवी और एंडो में पाए जाने वाले एंडोथेलियल प्रोजेनिटर कोशिकाएं कोरोनरी वास्कुल्चर के बहुमत का निर्माण करती हैं, जबकि प्रोपिकार्डियम इसके अपेक्षाकृत छोटे हिस्से में योगदान देताहै। जिस प्रक्रिया से कोरोनरी जहाजों का केशिका नेटवर्क अपने पहले से मौजूद अग्रदूत कोशिकाओं से दिल में बढ़ता है, उसे कोरोनरी एंजियोजेनेसिस कहा जाता है। कोरोनरी धमनी रोग दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक है और अभी तक इस बीमारी के लिए एक प्रभावी उपचार की कमी है । कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के विस्तृत सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना क्षतिग्रस्त कोरोनरी धमनियों की मरम्मत और पुनर्जीवित करने के लिए उपन्यास और प्रभावी उपचार डिजाइन करने में उपयोगी हो सकता है।
हाल ही में, कैसे कोरोनरी जहाजों का विकास के बारे में हमारी समझ में वृद्धि नए उपकरणों और प्रौद्योगिकियों के विकास के माध्यम से हासिल भाग में किया गया है । विशेष रूप से, वीवो वंश लेबलिंग और उन्नत इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में कोरोनरी जहाजों9,10, 11,12के सेलुलर मूल और विभेदन रास्तों को उजागर करने में बहुत उपयोगी रहा है । वीवो टूल्स में इनके फायदों के बावजूद, गति, लचीलापन और पहुंच के मामले में सीमाएं हैं। इसलिए, मजबूत इन विट्रो मॉडल सिस्टम कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सेलुलर और आणविक तंत्र को उच्च-थ्रूपुट तरीके से स्पष्ट करने के लिए वीवो सिस्टम में पूरक हो सकते हैं।
यहां, हम कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के इन विट्रो मॉडल का वर्णन करते हैं। हमने दो जनक ऊतकों, एसवी और एंडो से कोरोनरी जहाजों को विकसित करने के लिए एक इन विट्रो एक्सप्लांट संस्कृति प्रणाली विकसित की है। इस मॉडल के साथ, हम बताते है कि इन विट्रो ऊतक एक्सप्लांट संस्कृतियों कोरोनरी पोत अंकुरित हो जाना जब विकास माध्यम से उत्तेजित । इसके अतिरिक्त, एक्सप्लांट संस्कृतियां नियंत्रण की तुलना में तेजी से बढ़ती हैं जब संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर ए (VEGF-A), एक अत्यधिक शक्तिशाली एंजियोजेनिक प्रोटीन द्वारा उत्तेजित होता है। इसके अलावा, हमने पाया कि एसवी संस्कृति से एंजियोजेनिक अंकुरित विषैले विडिशन (तख्तापलट-TFII अभिव्यक्ति की हानि) से गुजरते हैं, जो वीवो1में एसवी एंजियोजेनेसिस के समान तंत्र है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि इन विट्रो एक्सप्लांट कल्चर सिस्टम ईमानदारी से वीवो में होने वाली एंजियोजेनिक घटनाओं को बहाल करता है। सामूहिक रूप से, एंजियोजेनेसिस के इन विट्रो मॉडल जो यहां वर्णित हैं, कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच के लिए उच्च थ्रूपुट और सुलभ तरीके से आदर्श हैं।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में सभी जानवरों का उपयोग गेंद राज्य विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) दिशा निर्देशों का पालन किया ।
1. माउस ब्रीडर्स की स्थापना और समय पर गर्भधारण के लिए योनि प्लग का पता लगाने
- जंगली प्रकार के पुरुष और मादा चूहों के साथ माउस प्रजनन पिंजरे की स्थापना करें। सुनिश्चित करें कि प्रजनन चूहों की उम्र 6-8 सप्ताह के बीच है। या तो एक जोड़ी (1 पुरुष और 1 महिला) या प्रजनन के लिए एक तिकड़ी (1 पुरुष और 2 महिला) के रूप में स्थापित करें।
- अगले सुबह योनि प्लग की जांच करें। इसे योनि खोलने में डालकर एक गहरे प्लग का पता लगाने के लिए एक कोण धातु जांच का उपयोग करें। एक सकारात्मक योनि प्लग की सुबह निर्धारित भ्रूण दिन 0.5 (e0.5) हो।
नोट: एक योनि प्लग या तो सतही हो सकता है (जो आसानी से दिखाई देता है, चित्र 1देखें) या गहरा (जो आसानी से दिखाई नहीं देता है)। एक गहरे प्लग की उपस्थिति जांच के पूर्ण सम्मिलन को अवरुद्ध कर देगी जबकि प्लग की अनुपस्थिति प्रतिरोध के बिना पूर्ण प्रविष्टि की अनुमति देगी। - समय पर गर्भावस्था बनाए रखें जब तक भ्रूण e11.5 तक पहुंचने जिस पर वे काटा जाएगा । भ्रूण की कटाई से पहले गर्भावस्था की पुष्टि करने के लिए, e7.5 और e11.5 के बीच महिला चूहों के वजन को रिकॉर्ड करें।
नोटः मां के वजन में रोजाना बढ़ोतरी से एक सफल प्रेगनेंसी का संकेत मिलेगा, जबकि वजन में कोई बदलाव फेल प्रेगनेंसी का संकेत नहीं देगा।
2. गर्भवती चूहों से भ्रूण की कटाई
नोट: शुरुआत से पहले, निम्नलिखित उपकरण और अभिकर्मक ों को सुनिश्चित करें: एक सीओ2 इच्छामृत्यु कक्ष, 70% इथेनॉल, पेपर तौलिए, नियमित संदंश, ठीक संदंश, कैंची, 1x बाँझ फास्फेट-बफर लवण (पीबीएस), 10 सेमी बाँझ पेट्री व्यंजन, बर्फ के साथ कंटेनर, छिद्रित चम्मच, विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप।
- इसे बलिदान करने के लिए एक स्वच्छ सीओ2 इच्छामृत्यु कक्ष में एक e11.5 गर्भवती माउस रखें। माउस को बचने से रोकने के लिए चैंबर के ढक्कन को बंद कर दें।
- माउस इच्छामृत्यु कक्ष में सुरक्षित होने के बाद, सीओ2चालू करें। आईएसएसी सिफारिशों (यानी, 10-30% विस्थापन प्रति मिनट) की प्रवाह दर को विनियमित करना सुनिश्चित करें। माउस पूरी तरह से इच्छामृत्यु के बाद, मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करें।
- माउस को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। संदंश का उपयोग करपेट पर त्वचा को उठाएं, कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके एक छोटा सा चीरा बनाएं और चीरा को बाद में बढ़ाएं। चीरा पूर्व काल तक डायाफ्राम तक बड़ा करें और भ्रूण(चित्रा 2)युक्त गर्भाशय सींग का पर्दाफाश करें।
- गर्भाशय को लोभी और इसे मुक्त करके भ्रूण (गर्भाशय सींग + भ्रूण) की स्ट्रिंग को बाहर निकालें। भ्रूण की स्ट्रिंग को बर्फ-ठंडा बाँझ 1x पीबीएस में रखें।
- गर्भाशय की मांसपेशी, जर्दी थैली, और एमनियन को एक-एक करके छीलने से गर्भाशय के सींग से व्यक्तिगत भ्रूण को काटना(चित्रा 3ए-एफ)स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे। बर्फ पर बाँझ 1x PBS युक्त पेट्री डिश के लिए एक छिद्रित चम्मच का उपयोग कर साफ भ्रूण हस्तांतरण । भ्रूण को ठंडा रखना सुनिश्चित करें।
3. e11.5 भ्रूण से दिल अलग
नोट: शुरुआत से पहले, निम्नलिखित उपकरण और अभिकर्मक ों को सुनिश्चित करें: नियमित संदंश, ठीक संदंश, 1x बाँझ पीबीएस, 10 सेमी बाँझ पेट्री डिश, 6 सेमी बाँझ पेट्री डिश, बर्फ के साथ कंटेनर, छिद्रित चम्मच, विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप।
- एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत बर्फ-ठंड बाँझ 1x पीबीएस के साथ एक नई पेट्री डिश की स्थापना की। चरण 2.5 से पेट्री डिश में एक भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए दिल काटना।
- संदंश का उपयोग कर भ्रूण के सिर को हटा दें। सबसे पहले, एक हाथ से संदंश के बीच सिर निचोड़ें और फिर सिर को बंद संदंश(चित्रा 4ए-सी)का उपयोग करके दूसरे हाथ से दूर स्क्रैप करके हटा दें।
- सिर को हटाने के बाद, भ्रूण को एक हाथ से अपने पेट में संदंश के साथ भ्रूण को पकड़कर अपने वेंट्रल साइड के साथ उन्मुख(चित्रा 4डी)।
- दूसरे हाथ से, ठीक संदंश का उपयोग करके डायाफ्राम के थोड़ा ऊपर छाती में एक छोटा सा चीरा बनाकर भ्रूण की छाती की दीवार खोलें। फिर, बंद संदंश डालकर और संदंश खोलकर छाती की दीवार को फाड़कर चीरा को बहुत सावधानी से बड़ा करें। बहुत गहरा जोर न दें, जो दिल को नुकसान पहुंचा सकता है। संदंश की मदद से छाती की दीवार को छाती की गुहा(चित्र4ई)में दिल और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए खुला रखें।
- ठीक संदंश का उपयोग करके, धीरे-धीरे दिल को पूर्वकाल (90 डिग्री) ले जाएं और पृष्ठीय महाधमनी/नस का पर्दाफाश करें। दिल के आधार पर पृष्ठीय महाधमनी/नस पर कब्जा करके दिल/फेफड़ों को पूर्वकाल में बाहर निकालें(चित्रा 4एफ-एच)।
नोट: SV, जो दिल के पृष्ठीय पक्ष में स्थित है के फाड़ से बचने के लिए दिल/फेफड़ों को बाहर खींचते समय कोमल हो । - रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए ठंड 1x पीबीएस के साथ दिल/फेफड़ों को कुल्ला।
- शेष भ्रूणों से हृदय/फेफड़ों को हटाने के लिए चरण 3.1-3.6 दोहराएं। अलग दिल/फेफड़ों को बर्फ पर रखना सुनिश्चित करें।
4. E11.5 भ्रूणमाउस दिल से अलग SVs और Ventricles
- स्वी और पूरे वेंट्रिकल्स को अलग करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत चरण 3.7 से दिल/फेफड़ों के साथ पेट्री डिश रखें। फेफड़ों के संलग्न पालि को ठीक संदंश का उपयोग करके उनकी जड़ से एक-एक करके छील लें।
- अपने पृष्ठीय पक्ष पर दिल उन्मुख और अटरिया और आसन्न ऊतक है कि एसवी पूर्वकाल के चारों ओर से घेरे एसवी फाड़ के बिना हटा दें । अपने आधार पर पकड़ और यह खुरचन बंद ठीक संदंश(चित्रा 5बी)का उपयोग करके दिल से बाईं और सही अटरिया निकालें । इसी तरह की तकनीक(चित्रा 5सी)का उपयोग करके एसवी के आसपास के आसन्न ऊतकों को हटा दें।
नोट: ध्यान रखें कि सही एट्रियम एसवी से जुड़ा हुआ है, इसलिए केवल एट्रियम को हटाने के लिए सावधान रहें। - एसवी को अलग करने के लिए, पहले अपने पृष्ठीय पक्ष के साथ दिल को उन्मुख करें (क्योंकि एसवी पृष्ठीय पक्ष पर है) और दिल को धीरे से संदंश के साथ अपने वेंट्रिकल्स पर दिल को पकड़कर इस स्थिति में रखें।
नोट: एसवी एक भ्रूण दिल का एक अंतर्वाह अंग है जो दिल के पृष्ठीय पक्ष पर अटरिया के बीच में स्थित है। - ध्यान से इसे दिल से छीलने से एसवी निकालें, जहां यह संलग्न है या ठीक संदंश के साथ अपने लगाव के आधार पर एसवी पकड़ और इसे बंद संदंश के साथ बंद खुरचन(चित्रा 5डी, ई)।
- एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर बर्फ पर बर्फ ठंड बाँझ 1x PBS के साथ एक नया 6 सेमी पेट्री डिश में अलग एसवी हस्तांतरण और एसवी के रूप में पेट्री डिश लेबल ।
- पूरे वेंट्रिकल्स को अलग करने के लिए, एसवी को हटाने के बाद दिल से बहिर्वाह पथ (महाधमनी और फेफड़े के ट्रंक) को हटा दें(चित्र5एफ, जी)।
- पूरे वेंट्रिकल्स को एक नए 6 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके बर्फ पर बाँझ 1x पीबीएस होता है और पेट्री डिश को वेंट्रिकल्स के रूप में लेबल करें। अलग-थलग पड़े एसवी और वेंट्रिकल्स को बर्फ पर रखें।
- शेष दिलों से एसवी और वेंट्रिकल्स को अलग करने के लिए चरण 4.1-4.7 दोहराएं।
5. आवेषण और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स कोटिंग के साथ ऊतक संस्कृति प्लेटों की स्थापना
नोट: शुरुआत से पहले, निम्नलिखित उपकरण और अभिकर्मक ों को सुनिश्चित करें: वाणिज्यिक बाह्य मैट्रिक्स समाधान (ईसीएम; उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स, 8.0 माइक्रोन पॉलीथीन टेरेफ्थैलेट (पीईटी) संस्कृति आवेषण, 24 अच्छी तरह से प्लेटें, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर।
- ईसीएम समाधान बर्फ पर गल चलो। ठोसीकरण से बचने के लिए बर्फ पर ईसीएम समाधान रखें।
- पीईटी झिल्ली संस्कृति आवेषण (ताकना आकार = 8.0 माइक्रोन, निस्पंदन क्षेत्र = 0.3 सेमी2,फिल्टर व्यास = 6.5 मिमी) को गैर-ऊतक संस्कृति के कुओं में रखें 24 अच्छी तरह से प्लेटों का इलाज किया। प्लेटों को क्रमशः एसवी या एंडोकार्डियल एंजियोजेनेसिस परख के लिए एसवी या वेंट्रिकल्स के रूप में लेबल करें।
नोट: एक साथ दोनों संस्कृतियों का प्रदर्शन करते समय एसवी और वेंट्रिकल्स के लिए अलग प्लेटों में आवेषण स्थापित करें। सभी प्रयोगात्मक नमूनों और नियंत्रणों के लिए पर्याप्त कुओं की स्थापना करना सुनिश्चित करें। - ईसीएम समाधान गल जाने के बाद, प्रीकूल्ड बेसल मीडियम (यानी ईबीएम-2 बेसल मीडियम) में ईसीएम 1:2 को तुरंत पतला करें, सामग्री की तालिकादेखें) पर्याप्त मात्रा (100 माइक्रोन/डालने एक्स नंबर आवेषण) के लिए।
नोट: उदाहरण के लिए, यदि छह आवेषण हैं, तो कुल मात्रा 100 माइक्रोन एक्स 6 = 600 माइक्रोन होगी। 200 माइक्रोन को बेसल मीडियम के 400 माइक्रोन में जोड़ें। - झिल्ली के शीर्ष पर सीधे जोड़कर ताजा पतला ईसीएम के 100 माइक्रोन के साथ आवेषण को कोट करें। ईसीएम को जमना करने की अनुमति देने के लिए प्लेट को कम से कम 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: यह संदूषण से बचने के लिए एक लैमिनार प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड के तहत किया जाना चाहिए।
6. एसवीएस और पूरे वेंट्रिकल्स संस्कृतियां
नोट: शुरुआत से पहले, निम्नलिखित उपकरण और अभिकर्मक ों को सुनिश्चित करें: 70% इथेनॉल, ट्रांसफर पिपेट, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, संदंश, लैमिनार फ्लो टिश्यू कल्चर हुड, माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल सेल सप्लीमेंट किट(सामग्री की तालिका),बेसल मीडियम, 1x बाँझ पीबीएस)। चित्रा 6 एसवी और वेंट्रिकल संस्कृति के कार्यप्रवाह को दर्शाता है।
- बर्फ पर पूरक किट की सामग्री बाहर गल। एक प्रमाणित लैमिनार प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड के तहत बेसल माध्यम के 500 मीटर में पूरक किट की सभी सामग्री जोड़कर पूरा माध्यम तैयार करें। मध्यम को अच्छी तरह से मिलाएं और 50 मिलीसल एलिकोट में वितरित करें।
- 70% इथेनॉल के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और आसपास के कार्य क्षेत्र के आधार को स्टरलाइज करें।
- चरण 5.4 से ऊतक संस्कृति प्लेटें प्राप्त करें। स्थानांतरण पिपेट की सहायता से, पौधों को डालने झिल्ली के शीर्ष पर चरण 4.7 से सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत और स्वच्छ संदंश की सहायता से, आवेषण के केंद्र में एक्सप्लांट्स को यह सुनिश्चित करने के लिए स्थिति है कि वे आवेषण के कोने में फंस नहीं जाते हैं या साइड की दीवारों से जुड़े होते हैं।
- एक्सप्लांट ्स को आवेषण पर रखे जाने और केंद्रित होने के बाद, किसी भी अतिरिक्त पीबीएस को आवेषण से सावधानीपूर्वक हटा दें और प्लेटों के ढक्कन बंद करें।
- एक लैमिनार प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड के तहत, आवेषण के शीर्ष पर पूर्वगरम पूर्ण माध्यम के 100 μL जोड़ें और कुओं में 200 μL हवा तरल इंटरफेस पर explants संस्कृति के लिए इस तरह है कि डालने की बेसल सतह माध्यम के साथ संपर्क में है , लेकिन शीर्ष सतह हवा के संपर्क में है।
नोट: विभिन्न आकार आवेषण/अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करते समय एयर-लिक्विड इंटरफेस प्राप्त करने के लिए वॉल्यूम को समायोजित करना सुनिश्चित करें। - 24 अच्छी तरह से प्लेटों के अप्रयुक्त कुओं में PBS के 300 μL जोड़ें और ढक्कन के साथ कवर। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें और 5 दिनों तक संस्कृतियों को बढ़ाएं।
- अगले दिनों में, नियमित रूप से एक्सप्लांट संस्कृतियों की स्थिति का आकलन करने के लिए एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि एक्सप्लांट ्सइल बीटिंग का प्रदर्शन करते हैं और सभी एक्सप्लांट ईसीएम के साथ एम्बेडेड झिल्ली के नीचे से जुड़े होते हैं। किसी भी फ्लोटिंग एक्सप्लांट पर ध्यान दें।
नोट: एक्सप्लांट्स का आवधिक संकुचन इंगित करता है कि वे जीवित हैं। फ्लोटिंग एक्सप्लांट्स को विश्लेषण से छोड़ा जाना चाहिए। - संस्कृति की स्थिति का आकलन करने के बाद, संस्कृति की थाली को वापस इनक्यूबेटर में रखें और 5 दिनों तक संस्कृति को विकसित करना जारी रखें।
7. VEGF-A (सकारात्मक नियंत्रण) के साथ संस्कृतियों का उपचार
नोट: शुरुआत से पहले, निम्नलिखित उपकरण और अभिकर्मक ों को सुनिश्चित करें: लैमिनार प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड, 1x पीबीएस, बेसल मीडियम + 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), बेसल मीडियम + VEGF-A, पिपेट, और पिपेट टिप्स।
- बेसल मीडियम +1% एफबीएस और बेसल मीडियम + VEGF-A तैयार करें।
- बेसल मीडियम +1% एफबीएस तैयार करने के लिए सबसे पहले जरूरी कंट्रोल वेल की संख्या तय करें। उदाहरण के लिए, यदि तीन नियंत्रण कुएं हैं, तो 300 माइक्रोन/वेल एक्स 3 = 900 माइक्रोन कुल मात्रा की आवश्यकता है। बेसल मीडियम +1% एफबीएस बनाने के लिए बेसल मीडियम के 891 माइक्रोन में एफबीएस के 9 माइक्रोन जोड़ें।
- बेसल मीडियम + VEGF-A तैयार करने के लिए सबसे पहले वेजएफ-ए मीडियम की जरूरत वाले कुओं की कुल संख्या तय करें । यदि तीन कुएं हैं, तो 300 μL/अच्छी तरह से x 3 = 900 μL कुल मात्रा है और 50 एनजी/ बेसल मीडियम + VEGF-A बनाने के लिए बेसल मीडियम के 900 माइक्रोन में VEGF-A के 150 एनजी जोड़ें।
नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए पर्याप्त संख्या में छोटे एलिकोट्स का बीमा करने के लिए गणना की तुलना में इस समाधान को बड़ी मात्रा में इकट्ठा करें।
- 2 दिन, दोनों कक्षों (आवेषण और कुओं) से मीडिया को हटा दें। आवेषण में 100 माइक्रोन जोड़कर 1x पीबीएस के 300 माइक्रोन के साथ संस्कृतियों को धोएं और कुओं में 200 माइक्रोन डालें। मजबूती से कई बार प्लेटों को चक्कर लगाते हैं और पीबीएस को हटा दें।
- 24 घंटे के लिए संस्कृतियों को भूखा रखने के लिए बेसल मीडियम + 1% एफबीएस (डालने में 100 माइक्रोन और 200 माइक्रोन इन द बीव्स) के 300 माइक्रोन जोड़ें।
- 3 दिन, भुखमरी के बाद, बेसल माध्यम के 300 μL जोड़ें + 1% एफबीएस (डालने में 100 μL और कुओं में 200 μL) नियंत्रण कुओं और बेसल माध्यम + VEGF-A (50 एनजी/अच्छी तरह से) उपचार कुओं में क्रमशः।
- उपचार के बाद, इनक्यूबेटर में संस्कृतियों को विकसित करना जारी रखें।
8. निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग
नोट: शुरुआत से पहले, निम्नलिखित उपकरण और अभिकर्मक ों को सुनिश्चित करें: 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए), 1x पीबीएस, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी, एक शेखर, पीबीएस (पीबीटी) में 0.5% nonionic सर्फेक्टेंट।
- खेती के छठे दिन, कमरे के तापमान (आरटी) पर 1x पीबीएस के साथ मध्यम और धोने संस्कृतियों को हटा दें ।
- कुओं में 4% पीएफए समाधान के 200 माइक्रोन और आवेषण में 100 μL जोड़कर संस्कृतियों को ठीक करें। कमाल करते समय 20 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में संस्कृतियों को ठीक करें।
- 20 मिन निर्धारण के बाद, एक धुएं हुड में संस्कृतियों से पीएफए को हटा दें और कुओं में 200 माइक्रोन और 100 माइक्रोन को आवेषण में जोड़कर 1x पीबीएस के साथ संस्कृतियों को धोएं।
- कमाल करते समय दोहराएं 3x, 10 मिन प्रत्येक धोता है। फिर इम्यूनोस्टेनिंग करने के लिए आगे बढ़ें।
नोट: सभी धोने के कदम आरटी में एक बेंचटॉप पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
- समाधान को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-वीई-कैथेरिन, एंटी-ईआरजी 1/2/3) को अवरुद्ध करने में पतला करें (5% गधा सीरम, 0.5% पीबीटी)। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (नीचे के कुओं में 200 माइक्रोन और आवेषण में 100 माइक्रोन) के 300 माइक्रोन जोड़ें। कमाल करते समय 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट संस्कृतियों।
नोट: एंटी-वीई-कैथेरिन का उपयोग एंडोथेलियल सेल झिल्ली को लेबल करने के लिए किया जाता है और एंटी-ईआरजी 1/2/3 का उपयोग एंडोथेलियल कोशिकाओं के एंजियोजेनिक स्प्राउट्स की कल्पना करने के लिए एंडोथेलियल सेल न्यूक्लियस लेबल करने के लिए किया जाता है। - अगले दिन, धोने और 0.5% पीबीटी में संस्कृति प्लेटें 10x रॉक, PBT हर 10 मिन बदल रहा है।
- समाधान को अवरुद्ध करने में माध्यमिक एंटीबॉडी (गधा विरोधी चूहा एलेक्सा फ्लोर 488 और गधे विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 555) को पतला करें। 8.2 चरण के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी के 300 माइक्रोन जोड़ें और कमाल करते समय 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, पीबीटी में सेकेंडरी एंटीबॉडी 10x धोएं, हर 10 मिन में पीबीटी बदल ें।
नोट: कम से कम 10x धोलें लेकिन अधिक वॉश बेहतर हैं। वॉश पूरा होने के बाद, संस्कृतियों को 1x पीबीएस के साथ संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि वे स्लाइड पर नहीं चढ़ते हैं।
9. स्लाइड, इमेजिंग, और विश्लेषण पर बढ़ती संस्कृतियों
नोट: शुरुआत से पहले, निम्नलिखित उपकरण और अभिकर्मक ों को सुनिश्चित करें: ठीक संदंश, स्लाइड, 4',6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडॉल (DAPI), कवरस्लिप और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ बढ़ते माध्यम। माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला के बाद, निम्नलिखित चरणों का उपयोग करइमेजिंग के लिए स्लाइड पर संस्कृतियों माउंट।
- झिल्ली को ठीक संदंश का उपयोग करके डालने से सावधानी से छील ें और झिल्ली पक्ष को नीचे रखकर और एक्सप्लांट संस्कृतियों को ऊपर की ओर रखकर इसे स्लाइड पर स्थानांतरित करें। दोहराने के नमूनों को एक ही स्लाइड में रखें और स्लाइड को नियंत्रण या VEGF-A के रूप में लेबल करें। DAPI के साथ बढ़ते माध्यम की कुछ बूंदें सीधे झिल्ली पर जोड़ें और कवर स्लिप के साथ स्लाइड को कवर करें।
नोट: कवरस्लिप रखते समय हवा के बुलबुले से बचना सुनिश्चित करें। - स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ स्लाइड के किनारों से सील करें और सूखने दें।
नोट: स्लाइड ्स को लंबी अवधि के स्टोरेज के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में स्टोर किया जा सकता है। - इमेज स्लाइड्स में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करते हुए।
- एंजियोजेनिक आउटग्रोथ की लंबाई को मापने के लिए विश्लेषण करें। एंडोथेलियल कोशिकाओं (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) की दूरी को मापने के द्वारा एंजियोजेनिक आउटग्रोथ लंबाई की मात्रा वेंट्रिकल संस्कृतियों में ईआरजी 1/2/3 + कोशिकाओं की अंदर की सीमा से और एसवी संस्कृतियों में एसवी एक्सप्लांट्स के केंद्र से विस्तारित ।
- फिजी/इमेजजे का उपयोग करके क्वांटिफिकेशन करने के लिए, पहले फिजी सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें ।
- फिजी में खुली छवि फ़ाइलें: फ़ाइल पर जाएं। खुला । फ़ोल्डर । फाइलनाम । खुला।
- विश्लेषण करने के लिए जाओ । माप निर्धारित करें । परिधि का चयन करें।
- मुख्य खिड़की से सीधी रेखा उपकरण का चयन करें।
- चरण 9.4 में सुझाए गए अंकुर की लंबाई में एक रेखा खींचें।
- विश्लेषण करने के लिए जाओ । उपाय।
नोट: नई विंडो में लंबाई माप प्रदर्शित की जाती है। - छवियों में मात्राकरण करें जो कम से कम तीन बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों को देखने का प्रतिनिधित्व करते हैं। अंकुरित लंबाई माप औसत और उन्हें मतलब ± मानक विचलन के रूप में रिपोर्ट।
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Representative Results
वीवो में एसवी एंजियोजेनेसिस की सबसे उल्लेखनीय विशेषताओं में से एक यह है कि यह एक विशिष्ट मार्ग का अनुसरण करता है और इसमें सेल विभेदन और पुनर्विभेदन की घटनाएं शामिल हैं जो टकसाली समय और पदों पर होती हैं1। के रूप में प्रारंभिक एसवी कोशिकाओं दिल वेंट्रिकल पर बढ़ने, वे ऐसे तख्तापलट-TFII(चित्रा 7)के रूप में venous मार्कर का उत्पादन बंद करो । बाद में, कोरोनरी स्प्राउट्स दो माइग्रेशन पथ लेते हैं, या तो दिल की सतह पर या मायोकार्डियम के भीतर गहरे। सतही जलयान अंततः नसें बन जाती हैं जबकि जहाजों पर हमला करने से धमनियां और केशिकाएं बन जाती हैं1,6,7। यह अंतर संरक्षित है क्योंकि दिल बढ़ता है और कोरोनरी वास्कुलचर फैलता है।
कोरोनरी विकास के आणविक आधार की खोज को सुगम बनाने के लिए, हमने एसवी अंकुरण का एक इन विट्रो मॉडल तैयार किया है जिसका उपयोग कार्य और लाभ-कार्य प्रयोगों के लिए किया जा सकता है । भ्रूणीय माउस दिलों से एसवी ऊतक विच्छेदित होते हैं, जो पतला ईसीएम (जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, सामग्री की तालिकादेखें), और एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम में एयर-लिक्विड इंटरफेस पर बनाए रखा जाता है। एसवी मायोकार्डियम संस्कृति अवधि के दौरान हरा करने के लिए जारी है । संस्कृति में 2 दिनों के बाद, एपिकार्डियल कोशिकाएं जो ऊतक को लाइन करती हैं, एक्सप्लांट छोड़ देती हैं और मैट्रिक्स पर माइग्रेट करती हैं। 5 दिनों के बाद, एसवी एंडोथेलियल कोशिकाएं अंकुरित होती हैं और एपिडियल ऊतक(चित्रा 8ए,काले तीरसिर) पर स्थानांतरित हो जाती हैं। सामूहिक रूप से, यह प्रक्रिया कोरोनरी विकास के एंजियोजेनिक पहलुओं को फिर से पेश करती है।
संस्कारी एसवी स्प्राउट्स भी शिश्न विभेदन से गुजरते हैं। भ्रूणीय हृदय के रूप में, तख्तापलट-TFII अभिव्यक्ति कम हो जाती है क्योंकि जहाज एसवी(चित्रा 8बी, चित्रा 7की तुलना में) से दूर चले जाते हैं। नालों को नियंत्रित करें जैसे गर्भनाल या जर्दी थैली धमनियों और नसों अंकुरित जहाजों का उत्पादन कर सकते हैं। हालांकि, वे संख्या में कम और लंबाई में कम कर रहे है और उनकी धमनी या venous पहचान (नहीं दिखाया) बदल नहीं है । इस प्रकार, वेनस रीप्रोग्रामिंग एसवी अंकुरण के लिए विशिष्ट है न कि एंजियोजेनेसिस की एक सामान्य विशेषता या ईसीएम घटकों की प्रतिक्रिया। इन आंकड़ों से यह भी संकेत मिलता है कि एसवी के भीतर निहित सेल प्रकार ही आवश्यक हैं और विभेदन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं।
यह सर्वविदित है कि वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर ए (VEGF-A) एंजियोजेनेसिस7,13,14,15,16,17,18का शक्तिशाली प्रेरक है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मायोकार्डियल VEGF-A कोरोनरी जहाजों7विकसित करने के लिए एंडोकार्डियल एंजियोजेनेसिस को उत्तेजित करता है । इसके अलावा, कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाओं को VEGF-A रिसेप्टर व्यक्त करने के लिए दिखाया गया है, और मायोकार्डियम में एसवी-व्युत्पन्न कोरोनरी जहाजों वीवो2में VEGF-A के जवाब में बढ़ सकता है । यह दिखाने के लिए कि कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के हमारे इन विट्रो मॉडल ईमानदारी से VEGF-ए का जवाब देते हैं, हमने वीजीएफ-ए के साथ एसवी और एंडो संस्कृतियों को प्रेरित किया। जैसा कि उम्मीद थी, हमारे परिणामों से पता चला है कि एसवी और एंडो दोनों VEGF-ए के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं। VEGF-ए शो के साथ उत्तेजित संस्कृतियों घनत्व और लंबाई दोनों में एंजियोजेनिक अंकुरित की वृद्धि में वृद्धि(चित्र9ए, सी)। VEGF-A द्वारा उत्तेजित एसवी संस्कृतियों नियंत्रण की तुलना में अंकुर लंबाई में लगभग 3 गुना वृद्धि (चित्र 9बी)दिखाते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि एसवी और एंडो से एंडोथेलियल स्प्राउट्स इसी तरह के संकेतों का जवाब देते हैं जो वीवो में जाने जाते हैं।
एक साथ लिया, हमारे डेटा का सुझाव है कि इन विट्रो एक्सप्लांट संस्कृतियों इसी तरह की सेलुलर और आणविक घटनाओं है कि वीवो कोरोनरी विकास में के दौरान होते हैं, वेल्फ-एक उत्तेजना के जवाब में वेनस विडिग्रेशन और मजबूत विकास सहित साझा करें । इसलिए, हमारे डेटा का सुझाव है कि इन एक्सप्लांट संस्कृति मॉडल विट्रो में कोरोनरी एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं।
चित्रा 1: योनि प्लग पहचान। (A)एक योनि प्लग (सफेद स्थान)। (ख)योनि प्लग (तीर द्वारा इंगित) सहित बॉक्स्ड क्षेत्र का बढ़ाया दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: गर्भवती माउस के गर्भाशय में भ्रूण स्ट्रिंग तक पहुंचना। एक इच्छामृत्यु गर्भवती माउस अपनी वेंट्रल सतह के साथ तैनात है और विच्छेदन के लिए गीली त्वचा के लिए 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव किया जाता है। त्वचा संदंश का उपयोग करश्विक क्षेत्र में खींच लिया जाता है और एक छोटा सा चीरा बनाया जाता है। चीरा बाद में बढ़ाया जाता है। डायाफ्राम तक एक अतिरिक्त चीरा पूर्वकाल में बनाया जाता है। गर्भाशय में, भ्रूण की एक स्ट्रिंग दिखाई देती है (तीरसिर द्वारा इंगित)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: विच्छेदन और गर्भाशय से भ्रूण को हटाने। (A)भ्रूण की एक स्ट्रिंग युक्त गर्भाशय दिखा छवि। भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष पर झिल्ली (उस तरफ के विपरीत जहां प्लेसेंटा स्थित है) को छील दिया जाता है। (ख)जर्दी थैली में भ्रूण गर्भाशय झिल्ली को छीलने के बाद दिखाई देता है। (C,D) गर्भनाल के साथ अपरा से जुड़ा भ्रूण जर्दी थैली छीलने के बाद दिखाई देता है। अगर अभी भी मौजूद है तो एमनियन को छील दिया जाता है । (ई)गर्भनाल द्वारा अपरा से जुड़े भ्रूण को दिखाने वाली छवि। (एफ)गर्भनाल (Umb) पर खींच कर नाल से भ्रूण की टुकड़ी दिखा छवि । कॉर्ड) संदंश का उपयोग करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: भ्रूण से बांधना दिल/फेफड़ों को हटाने । (ए, बी) सिर को भ्रूण से गर्दन पर कब्जा कर के खुरचकर निकाल दिया जाता है। (ग)छवि शरीर से सिर को हटाने को दिखाती है। (D)हृदय विच्छेदन के लिए भ्रूण की सही स्थिति। भ्रूण दिल को हटाने के लिए छाती गुहा के लिए आसान पहुंच के लिए वेंट्रल पक्ष के साथ तैनात है । एक बार भ्रूण के रूप में डी में दिखाया गया है तैनात है, छाती गुहा संदंश के साथ खोला जाता है । (ई)छवि अपने वेंट्रल पक्ष पर उजागर दिल के साथ खुली छाती गुहा दिखा । (च)एसवी को नुकसान पहुंचाए बिना दिल को दूर करने के लिए दिल को पूर्वकाल से फ़्लिप किया जाता है और पृष्ठीय महाधमनी दिखाई देती है। (जी)हृदय/फेफड़ों के आधार पर स्थिति को दर्शाने वाली छवि जहां पृष्ठीय महाधमनी/नस को संदंश के साथ पकड़ा जाता है और हृदय/फेफड़ों को तोड़ना पूर्वकाल में बाहर निकाला जाता है । (ज)छवि e11.5 दिल/फेफड़ों भ्रूण से हटा बांधना से पता चलता है । V. दिल = वेंट्रल हार्ट; d. दिल = पृष्ठीय दिल; d. महाधमनी = पृष्ठीय महाधमनी; ला = बाएं एट्रियम; आरए = सही एट्रियम; एलवी = बाएं वेंट्रिकल; आरवी = सही वेंट्रिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: भ्रूणीय दिलों से एसवी और वेंट्रिकल्स को अलग करना। (क)छवि अलग दिल के पृष्ठीय दृश्य दिखा/ दिल में एसवी का स्थान दर्शाया गया है। (ख)फेफड़ों की कलियों को हटाने के बाद दिल की छवि। (ग)एट्रिया और एसवी के आसपास के ऊतकों को हटा दिया जाता है, महाधमनी का खुलासा । एसवी का स्थान लेबल है। (D)एसवी को हटाने वाली छवि। संदंश का उपयोग करना, एसवी अपने आधार पर सोचने के लिए उत्साहित है और दिल से बंद स्क्रैप है । (ई)दिल से हटाई गई एसवी को दिल के शेष ऊतकों के साथ दिखाया गया है। महाधमनी और पल्मोनरी ट्रंक (पीटी), जिसे सामूहिक रूप से बहिर्वाह पथ (ओएफटी) कहा जाता है, एसवी को हटाने के बाद दिल में दिखाई देता है। एसवी इन विट्रो संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, के रूप में चित्रा 6 (बाएं पैनल) में वर्णित है । (एफ)ओएफटी की स्थिति को विच्छेदित करने के लिए एक धराशायी सफेद रेखा द्वारा चिह्नित किया जाता है । (जी)ऑर्टा/पीटी (बहिर्वाह पथ) को पैनल एफ में दिखाए गए पद पर विच्छेदन द्वारा वेंट्रिकल्स से हटा दिया जाता है । ओएफटी के बिना शेष वेंट्रिकल्स का उपयोग वेंट्रिकल संस्कृतियों के लिए किया जाता है जैसा कि चित्रा 6 (दाएं पैनल) में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: योजनाबद्ध एसवी और वेंट्रिकल संस्कृति के कार्यप्रवाह दिखा । बाएं: एसवी संस्कृति के लिए प्रक्रिया। सबसे पहले, एसवी e11.5 दिलों से हटा दिया जाता है और एक संस्कृति डालने पर रखा जाता है । डालने में नीचे (8 माइक्रोन पोर) पर असुरक्षित झिल्ली होती है और विकास कारक कम ईसीएम के साथ लेपित होती है। आवेषण एक 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में रखा जाता है । एक्सप्लांट को कवर किए बिना मध्यम नीचे और शीर्ष कक्ष दोनों में जोड़ा जाता है। संस्कृति 5 दिनों के लिए उगाई जाती है। 5 दिनों के बाद, झिल्ली को डालने से हटा दिया जाता है और इमेजिंग और विश्लेषण के लिए स्लाइड पर रखा जाता है। सही: वेंट्रिकल संस्कृति के लिए प्रक्रिया। एसवी, अटरिया और ओफ्ट के बिना वेंट्रिकल्स को e11.5 दिलों से हटा दिया जाता है और एसवी के लिए ऊपर वर्णित के रूप में सुसंस्कृत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: तख्तापलट-TFII अभिव्यक्ति वीवो में एसवी अंकुरित में खो जाता है । (A)e11.5 दिलों का पृष्ठीय दृश्य। एंडोथेलियल मार्कर (लाल) की कॉन्फोकल छवि जो पापस वेनसस (एसवी), कोरोनरी स्प्राउट्स (सीएस, बिंदीदार रेखा) और एंडोकार्डियम (एंडो) को दिल के लुमेन को अस्तर पर लेबल करती है। (ख)एसवी में व्यक्त एक नस ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (टीआरएक्स) वेन ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (ग्रीन) शिराक ों को उत्तरोत्तर खो जाता है क्योंकि अंकुरित एसवी छोड़ देते हैं और वेंट्रिकल पर बढ़ते हैं । सही: पैनल ए स्केल बार = 100 माइक्रोन के बॉक्स्ड क्षेत्र में दिखाए गए कोरोनरी स्प्राउट का उच्च आवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 8: वेनस पहचान और रीप्रोग्रामिंग के इन विट्रो मॉडल। (A)सुसंस्कृत एसवी ऊतक की ब्राइटफील्ड छवि। वैस्कुलर स्प्राउट्स (एरोहेड्स) ईसीएम सब्सट्रेट पर मूल एक्सप्लांट (ब्लैक डॉटेड लाइन) से बाहर हो जाते हैं। (ख)एंटीबॉडी के साथ लेबल एसवी संस्कृतियों की इम्यूनोफ्लोरेसेंस जो एंडोथेलियल सेल सतह (VE-Cadherin), एंडोथेलियल सेल न्यूक्लिक (ईआरजी 1/2/3), और नस और एपिकार्डियल न्यूक्लियी (तख्तापलट-TFII) को चिह्नित करती है । नाभिक एसवी में ईआरजी 1/2/3 और तख्तापलट-टीएफआईआई दोनों के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन ईआरजी 1/2/3 केवल ईसीएम पर पलायन करने वाले अंकुरित स्प्राउट्स में । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 9: एसवी और एंडोकार्डियम वीजीएफ-ए इन विट्रो का जवाब देते हैं। (A)5 दिन पुराने नियंत्रण और VEGF-ए इलाज एसवी एक्सप्लांट संस्कृति की Confocal छवि । एंडोथेलियल कोशिकाओं को VE-cadherin (हरे), एंडोथेलियल सेल नाभिक ERG 1/2/3 (लाल) एंटीबॉडी के साथ दाग, और DAPI (नीले) के साथ सेल नाभिक के साथ इम्यूनोदागित कर रहे हैं । (ख)एंडोथेलियल कोशिकाओं के एंजियोजेनिक आउटग्रोथ को अंकुरित विस्तार की लंबाई को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है (ईआरजी 1/2/3 + एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा एक्सप्लांट से माइग्रेट की गई दूरी, जो(ए)के निचले पैनलों में सफेद ठोस रेखाओं द्वारा इंगित की गई है । (ग)नियंत्रण और VEGF-ए इलाज वेंट्रिकल्स की 5 दिन पुरानी संस्कृति की कॉन्फोकल छवि । एंडोथेलियल कोशिकाओं को वीई-कैडरिन (ग्रीन) के साथ इम्यूनोदाग किया जाता है और एंडोथेलियल सेल न्यूक्लिकी को ईआरजी 1/2/3 (ब्लू) एंटीबॉडी से दाग दिया जाता है। डॉट्स व्यक्तिगत माप रहे हैं और त्रुटि सलाखों का मतलब है ± एसडी. स्केल बार = 200 माइक्रोन(ए, सी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एसवी और एंडो प्रोजेनेटर ऊतकों से सफलतापूर्वक बढ़ते कोरोनरी जहाजों के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से कुछ हैं: 1) सही ढंग से पहचान और एसवी संस्कृति के लिए एसवी ऊतक अलग; 2) सटीक एंडो संस्कृति के लिए e11−11.5 की उम्र के बीच भ्रूण से वेंट्रिकल्स का उपयोग करना; 3) विच्छेदन अवधि के दौरान बाँझ स्थितियों को बनाए रखने और ऊतकों को हर समय ठंडा रखते हुए; और 4) माध्यम में तैरते ऊतक से बचने के लिए ईसीएम लेपित झिल्ली से जुड़े एक्सप्लांट्स को रखते हुए।
सबसे पहले, एसवी ऊतक का अलगाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह महसूस करना महत्वपूर्ण है कि एसवी फेफड़ों के लोबुल के भीतर छिपे बाएं और दाएं अटरिया के बीच दिल के पृष्ठीय पक्ष पर स्थित है। इसलिए अलग-अलग और अलग-थलग पड़ना मुश्किल है। इसके बजाय, पूरे दिल/फेफड़ों बांधना पहले निकाला जाना चाहिए । एसवी तो ध्यान से फेफड़ों lobules हटाने और ठीक संदंश की मदद से आसन्न ऊतकों को साफ करके बांधना से अलग है । इसके अलावा, एसवी को खोने के लिए आसन्न ऊतकों को साफ करते समय बहुत सावधान रहना चाहिए।
दूसरा, सटीक एंडोकार्डियल एंजियोजेनेसिस के लिए, यह e11.5 से अधिक पुराने भ्रूण से वेंट्रिकल्स संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है । e12.5 और पुराने भ्रूण में, एसवी से कोरोनरी वेंट्रिकल्स के एक महत्वपूर्ण अनुपात में विकसित होते हैं। इसलिए, पुराने वेंट्रिकल्स से बढ़ने वाले कोरोनरी जहाजों में एसवी और एंडो-व्युत्पन्न कोरोनरी दोनों जहाज शामिल हो सकते हैं1,2,10,19,20। इस कारण से, एंडो से कोरोनरी पोत के विकास को सही ढंग से परखने के लिए, यह e11.5 भ्रूण20से संस्कृति वेंट्रिकल्स (माइनस एसवी और बहिर्वाह पथ) के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एसवी अपेक्षाकृत बड़ा है और e11.5 पर अलग करना आसान है।
तीसरा, क्योंकि प्रोटोकॉल ऊतक संस्कृति हुड के बाहर काम की एक पर्याप्त राशि शामिल है, यह एक बाँझ काम के माहौल को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । विच्छेदन उपकरण (संदंश, कैंची, आदि) और ऊतक संस्कृति प्लेटों की नसबंदी करना और हर समय अस्टराइल क्षेत्रों के संपर्क से बचना महत्वपूर्ण है। 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र और विच्छेदन दायरे का छिड़काव करना महत्वपूर्ण है। संदूषण से बचने के लिए, विच्छेदन प्रक्रिया को जल्दी से करना और ऊतक संस्कृति हुड के बाहर काम को कम करना महत्वपूर्ण है।
चौथा, स्वस्थ एक्सप्लांट संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि एक्सप्लांट हर समय झिल्ली के आधार से जुड़े रहें। मध्यम में फ्लोटिंग एक्सप्लांट्स को सफलतापूर्वक एक्सप्लांट संस्कृतियों को विकसित करने से बचा जाना चाहिए। फ्लोटिंग से बचने के लिए, एक एयर-लिक्विड इंटरफेस बनाए रखना महत्वपूर्ण है जहां डालने की बेसल सतह माध्यम के संपर्क में है, लेकिन शीर्ष सतह हवा के संपर्क में है। इस तरह के एक इंटरफ़ेस प्राप्त किया जाता है जब एक्सप्लांट पर्याप्त रूप से माध्यम द्वारा कवर किया जाता है लेकिन पूरी तरह से जलमग्न नहीं होता है। दैनिक माध्यम की मात्रा की निगरानी करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वाष्पीकरण के लिए मात्रा खो सकती है। इसे रोकने के लिए कल्चर प्लेट को कल्चर प्लेटके अनुपयोगी कुओं में पीबीएस जोड़कर ह्यूमिडिफाई किया जा सकता है।
एसवी और एंडो की ऐसी ही एक्सप्लांट संस्कृतियों का वर्णन कहीं और20। इन तरीकों में, एक्सप्लांट्स को सीधे ऊतक संस्कृति प्लेटों के कुओं में सुसंस्कृत किया गया था, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग को सीमित करता है। इस सेटिंग में कैप्चर की गई छवियां यहां प्रस्तावित विधि की तुलना में गुणवत्ता में अपेक्षाकृत खराब हैं, विस्तृत सूक्ष्म विश्लेषण ों को सीमित करती हैं। इसे दरकिनार करने के लिए, हमने संस्कृति आवेषण का उपयोग किया जिसमें से संस्कृति युक्त झिल्ली को छीलकर इमेजिंग के लिए ग्लास स्लाइड पर रखा जा सकता है। यह उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुमति देता है जहां अभिव्यक्ति पैटर्न और आकृति विज्ञान जैसे सेलुलर विवरण देखे जा सकते हैं। इसके अलावा, प्लेटों पर सीधे खेती DAPI या अंय पैन परमाणु मार्कर धुंधला के लिए एक अलग धुंधला प्रोटोकॉल की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल में अलग-अलग धुंधला चरणों की आवश्यकता नहीं है क्योंकि स्लाइड ों को बढ़ते माध्यम के साथ रखा जा सकता है जिसमें डीपीआई होता है। इसके अलावा, स्लाइड पर बढ़ते फ्लोरोसेंट लुप्त होती बिना दीर्घकालिक भंडारण के लिए अनुमति देता है, जबकि तरल माध्यम के साथ कुओं में संग्रहीत संस्कृतियों जल्दी लुप्त होती में परिणाम होगा और दीर्घकालिक भंडारण और इमेजिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हैं ।
यहां वर्णित इन विट्रो संस्कृति मॉडल कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सेलुलर और आणविक तंत्र से उच्च थ्रूपुट और सुलभ तरीके से पूछताछ के लिए आदर्श हैं। इस इन विट्रो सिस्टम का उपयोग कोरोनरी एंजियोजेनेसिस पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए संभावित दवाओं या आणविक लक्ष्यों के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रणाली का उपयोग कोरोनरी एंजियोजेनेसिस में अपने स्वायत्त कार्य के लिए विभिन्न जीनों के लाभ-कार्य और हानि-कार्य का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। हमने देखा कि एसवी से कोरोनरी स्प्राउट्स ने हमारी इन विट्रो संस्कृतियों में एपिकार्डियल माइग्रेशन का पालन किया, जिसमें कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाओं और एपिकार्डियल कोशिकाओं के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत का सुझाव दिया गया। यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि एपिकार्डियम एसवी से कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के लिए विकास कारकों का एक समृद्ध स्रोत है। उदाहरण के लिए, एपिकार्डियल-व्युत्पन्न विकास कारक जैसे VEGF-C और ELABELA को पहले एसवी-व्युत्पन्न कोरोनरी एंजियोजेनेसिस2,19को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है । हम इस एसवी संस्कृति प्रणाली का उपयोग एपिकार्डियम और कोरोनरी एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच करने और कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के उपन्यास एपिकार्डियल-व्युत्पन्न आणविक रास्तों की पहचान करने के लिए कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, हमारे वीवो डेटा में सुझाव है कि मायोकार्डियल हाइपोक्सिया एंडोकार्डियल एंजियोजेनेसिस19में शामिल हो सकता है। हमारी इन विट्रो संस्कृति प्रणाली हाइपोक्सिक या नॉर्मोक्सिक स्थितियों में संस्कृतियों को इनक्यूबेटिंग करके एंडोकार्डियल एंजियोजेनेसिस में हाइपोक्सिया की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करती है। ये वीवो में आचरण करने के लिए कठिन प्रयोग हैं क्योंकि इसके लिए गर्भवती माउस को नियंत्रित हाइपोक्सिक कक्ष में रखने की आवश्यकता होती है। हमारे अपने अनुभव से, वीवो प्रयोगों में से लगातार और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करना बहुत चुनौतीपूर्ण है। संक्षेप में, कोरोनरी एंजियोजेनेसिस का हमारा इन विट्रो मॉडल कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान से संबंधित विभिन्न प्रश्नों से पूछताछ करने के लिए एक विश्वसनीय प्रणाली प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।
Acknowledgments
लेखकों ने शर्मा प्रयोगशाला के सदस्यों को सहायक शोध वातावरण प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया। हम डायने (डी) आर हॉफमैन को विशेष धन्यवाद देना पसंद करते हैं जो हमारे माउस कॉलोनी का रखरखाव और परवाह करता है। हम डीआरएस फिलिप जे स्माल्डिनो और कैरोलिन वेन को पांडुलिपि को अच्छी तरह से प्रूफरीडिंग करने और सहायक टिप्पणियां प्रदान करने के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को बॉल स्टेट यूनिवर्सिटी प्रोवोस्ट ऑफिस और डिपार्टमेंट ऑफ बायोलॉजी से लेकर बीएस, इंडियाना एकेडमी ऑफ साइंसेज सीनियर रिसर्च ग्रांट फंड्स टू बीएस और एनआईएच (आरओ1-एचएल128503) और न्यूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन फंड ्स से केआर को फंड देकर सपोर्ट किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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